GB/T 26436-2025 禽白血病诊断技术

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 26436—2025代替 GB/T 26436—2010

　　禽白血病诊断技术

　　Diagnostic techniques for avian leukosis

　　2025⁃01⁃ 24 发布 2025⁃08⁃01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 26436—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 实验室生物安全措施 2

　　6 临床诊断 2

　　6.1 流行病学 2

　　6.2 临床症状 2

　　6.3 病理变化 3

　　6.4 鉴别诊断 3

　　6.5 临床判定 3

　　7 样品采集与处理 4

　　7.1 样品采集 4

　　7.2 样品处理 4

　　8 实验室诊断 4

　　8.1 病毒分离和鉴定 4

　　8.2 病毒亚群的鉴定 7

　　8.3 Real-time RT-PCR 扩增 ALV-J 7

　　8.4 血清学诊断 7

　　9 综合判定 8

　　9.1 疑似 8

　　9.2 确诊 8

　　附录 A(规范性) 病毒分离相关溶液的配制 9

　　A .1 0.01 mol/L PBS(pH 7.4) 9

　　A .2 50% 甘油-PBS 保存液(pH 7.4) 9

　　A .3 细胞完全营养液和维持液 9

　　附录 B(资料性) CEF(C/E 品系)的制备 10

　　附录 C(资料性) 抗 ALV 单因子鸡血清的制备 11

　　附录 D(规范性) p27 抗原 ELISA 检测相关溶液的配制 12

　　D .1 包被液 12

　　D .2 洗涤液 12

　　Ⅰ

　　GB/T 26436—2025

　　D .3 样品稀释液 12

　　D .4 底物溶液 12

　　D .5 终止液 12

　　附录 E(资料性) ALV 亚群鉴定程序 13

　　E .1 克隆载体和宿主菌 13

　　E .2 病毒模板的制备 13

　　E .3 囊膜蛋白 env 基因的扩增 13

　　E .4 PCR 产物的克隆 14

　　E .5 质粒 DNA 的提取和鉴定 15

　　E .6 克隆序列的测定 15

　　附录 F(资料性) Real-time RT-PCR 扩增 ALV-J 17

　　F .1 引物和探针序列 17

　　F .2 样品采集和前处理 17

　　F .3 核酸抽提 17

　　F .4 扩增试剂准备 17

　　F .5 加样检测 18

　　F .6 反应条件设置 18

　　F .7 荧光素设定 18

　　F .8 分析条件设定及结果判定 18

　　附录 G(资料性) ALV-J 一步法 Real-time RT-PCR 检测试剂盒的组成及使用 19

　　G .1 试剂盒组成 19

　　G .2 说明 19

　　G .3 使用时的注意事项 19

　　附录 H(资料性) IFA 法抗体检测用 ALV 感染细胞的制备 20

　　参考文献 21

　　Ⅱ

　　GB/T 26436—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 26436—2010《禽白血病诊断技术》，与 GB/T 26436—2010 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

　　——增加了“缩略语”(见第 4 章);

　　——增加了 ALV-p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测方法(见 8.1.4.3);

　　——更改了抗体检测结果对确诊的判定标准(见 8.4.5，2010 年版的 4.3.2.3)。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本文件起草单位：山东农业大学 、中华人民共和国拱北海关技术中心 、华南农业大学 、扬州大学 、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、灵羽生工(北京)医药科技有限公司 、中国农业大学 、普莱柯生物工程股份有限公司 、中国动物疫病预防控制中心 。

　　本文件主要起草人 ：赵鹏 、崔治中 、孙淑红 、杨素 、沙才华 、廖明 、曹伟胜 、秦爱建 、钱琨 、王一新 、高玉龙 、陈西钊 、苏敬良 、田克恭 、吴清民 、王传彬 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

　　——2010 年首次发布为 GB/T 26436—2010;

　　——本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 26436—2025

　　引 言

　　禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)感染引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称 ，主要引起鸡的恶性肿瘤和亚临床感染 ，导致鸡只生长迟缓 、产蛋下降和免疫抑制，是一种能够通过种蛋垂直传播的免疫抑制性疾病，我国将其列为三类动物疫病 。

　　ALV 属 于 反 转 录 病 毒 科 正 反 录 病 毒 亚 科 甲 型 反 转 录 病 毒 属 ，根 据 其 gp85 蛋 白 的 特 性 目 前 将ALV 分为 A 、B、C 、D 、E、F、G 、H 、I、J 和 K 共 11 个亚群 。ALV 分为内源性 ALV 和外源性 ALV 两大类 。 内源性 ALV 是指整合进宿主细胞染色体基因组因而能通过染色体垂直传播的 ALV，它可能只是病毒基因组的不完全片段不产生传染性病毒粒子 ，也可能是病毒全基因组因而能产生传染性病毒粒子 ，不过这类病毒通常致病性很低或无致病性 ，主要是 E 亚群 ALV 。外源性 ALV 是与内源性 ALV相对应的 ，指不通过宿主细胞染色体传递给下一代的 ALV，包括 A 、B、C 、D 、J 和 K 亚群 ，致病性强的ALV 均属于外源性病毒 。 内源性 ALV 的干扰是开展实验室检测 ，特别是进行核酸检测时首要排除因素 。

　　本病发生没有明显的季节性或地域性，通常因为饲养种源未净化 ALV 的鸡苗而发病，以及在育雏期与感染鸡群混养或者使用存在外源性 ALV 污染的生物制品而感染发病 。

　　本文件诊断技术内容包括临床诊断 、病原学诊断和血清学诊断方法 。本文件的修订参考了世界动物卫生组织(WOAH)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，并结合了我国相关技术研究新成果 。

　　Ⅳ

　　GB/T 26436—2025

　　禽白血病诊断技术

　　1 范围

　　本 文 件 描 述 了 禽 白 血 病 的 临 床 诊 断 、样 品 采 集 与 处 理 ，以 及 病 毒 分 离 和 鉴 定 、病 毒 亚 群 的 鉴 定 、 Real⁃time RT⁃PCR、扩增 ALV⁃J、血清学诊断等实验室诊断方法 。

　　本文件适用于鸡群中禽白血病的诊断 、检测 、检疫 、监测和流行病学调查 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 ，其中 ，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　GB/T 18643 鸡马立克氏病诊断技术

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集 、保存与运输技术规范

　　NY/T 1247 禽网状内皮组织增殖症诊断技术

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　AL：禽白血病(Avian leukosis)

　　ALV：禽白血病病毒(Avian leukosis virus)

　　CPE：细胞病变效应(Cytopathic effect)

　　Ct 值：循环阈值(Cycle threshold)

　　CEF：鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast)

　　DEPC：焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate)

　　DMEM：杜氏改良 Eagle 培养基(Dulbecco ’s modification of Eagle ’s medium)

　　dNTP：脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate)

　　EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid)

　　ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme⁃linked immunosorbent assay)

　　IFA：间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay)

　　MDV：鸡马立克氏病病毒(Marek ’s disease virus)

　　1

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　　PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)

　　Real⁃time RT⁃PCR：实时反转录⁃聚合酶链反应(Real⁃time reverse transcription⁃polymerase chain re ⁃ action)

　　REV：禽网状内皮组织增殖症病毒(Reticuloendotheliosis virus)

　　RNA：核糖核酸(Ribonucleic acid)

　　RT⁃PCR：反转录⁃聚合酶链式反应(Reverse transcription⁃polymerase chain reaction)

　　TCID50：半数组织感染剂量(50% tissue culture infective dose)

　　5 实验室生物安全措施

　　进行禽白血病实验室诊断时，按照 GB 19489 的规定执行 。样品采集 、保存 、运输执行 GB/T 18088和 NY/T 541 的要求 。本文件中各类试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的要求 。

　　6 临床诊断

　　6.1 流行病学

　　6.1.1 家禽是 ALV 的自然宿主，母鸡易感性较高，某些品种的野鸡和鹧鸪也可感染 ALV 。

　　6.1.2 性成熟或即将性成熟的鸡群(16周龄以上鸡群)多发，并呈渐进性 。 肉鸡最早可在 5 周龄引起发病，平均发病时间为 9 周龄，肿瘤致死率通常在 20 周龄达最高 。蛋鸡通常在 20 周龄后发病，性成熟前后发病相对集中 。

　　6.1.3 通过垂直传播的雏鸡处于免疫低下状态，通过粪便排毒，成为传染源 。

　　6.1.4 感染家禽的外源性 ALV 主要包括 A 、B、J、K 等亚群 ，肉种鸡和蛋种鸡主要感染 J 亚群 ，黄羽肉种 鸡 主 要 感 染 J 亚 群 和 K 亚 群 ，某 些 品 种 的 野 鸡 中 分 离 到 的 ALV 毒 株 属 于 其 他 亚 群(如 F、G 、H亚群)。

　　6.2 临床症状

　　6.2.1 鸡感染后通常不表现特异的临诊症状，甚至可能完全没有症状，但可造成鸡群产蛋性能下降 、生长迟缓和免疫抑制等亚临床症状 。若表现症状，其典型特征为在性成熟前后发生肿瘤而死亡 。

　　6.2.2 同一亚型的 ALV 可以引起不同类型的肿瘤 ，同一类型的肿瘤也可以由不同亚型的 ALV 引发 。由 ALV 诱发的常见肿瘤包括淋巴细胞瘤 、成红细胞瘤 、髓细胞样肿瘤 、血管瘤 、肾瘤和肾胚细胞瘤 、纤维肉瘤和其他结缔组织瘤 、骨硬化病等 。

　　6.2.3 若表现为淋巴细胞瘤，肿瘤主要分布在肝脏 、脾脏和法氏囊，质地柔软 、有光泽，切面呈淡灰色到乳白色，瘤体可能呈结节状 、粟粒状或弥散性，乃至多种形式组合 。

　　6.2.4 若表现为成红细胞瘤，肿瘤常见于肝脏 、脾脏和肾脏，器官肿大，并通常呈樱桃红色到暗褐色，病死鸡出现全身性贫血及不同程度的出血 、水肿或积水，贫血严重时内脏和免疫器官常呈现萎缩 。

　　6.2.5 若表现为髓细胞样肿瘤 ，髓细胞瘤可发生于肋骨和肋软骨的连接处 ，胸骨内面以及下颌骨和鼻腔的软骨上，通常为结节状和弥漫性生长，质地柔软易碎或干酪样 。除骨骼肿瘤外，髓细胞的浸润通常引起肝脏 、脾脏和其他器官的肿大 。

　　6.2.6 若表现为血管瘤 ，肿瘤发生于鸡的皮肤或内脏器官中 ，表现为充血性的囊性肿块(血疱)或更多的实体增生性病变 。

　　6.2.7 若表现为肾瘤和肾胚细胞瘤，肿瘤眼观变化不一，从埋在肾实质内的粉灰色小结节，到取代大部分肾组织的灰黄色分叶状团块均有发生 。

　　2

　　GB/T 26436—2025

　　6.2.8 若表现为骨硬化病，病鸡骨骼上通常双侧对称性出现明显的浅黄色病灶，骨膜增厚，病变骨骼呈海绵状，病变通常环绕骨干并向干骺端发展，使骨骼呈梭形外观 。

　　6.3 病理变化

　　6.3.1 淋巴细胞性白血病镜下观察，肿瘤由淋巴母细胞的聚集体组成，细胞大小稍有不同，但均处于原始发育阶段 。

　　6.3.2 成红细胞增多病镜下检查，可见多脏器血窦扩张，其内充满未成熟的成红细胞 。

　　6.3.3 成髓细胞性白血病镜下观察 ，可见肝脏 、脾脏 、肾脏等器官血管内外有大量幼稚型髓细胞 ，分裂象明显 。髓细胞性白血病肿瘤通常由大量均一的 、高度分化的髓细胞组成，分裂象明显 。

　　6.3.4 血管瘤镜下可见血管高度扩张 、壁薄，呈海绵状特征 。

　　6.3.5 肾瘤和肾胚细胞瘤镜下通常可见上皮和间质成分出现肿瘤样增生 ，肾小球 、肾小囊和肾小管正常结构畸形 。

　　6.3.6 纤维瘤主要成分为纤维细胞 、成纤维细胞和细胞外的胶原纤维 ;纤维肉瘤的瘤细胞则主要是不成熟的成纤维细胞 。

　　6.3.7 黏液瘤镜检可见到星芒状的细胞，核分裂象少见，且细胞间有大量淡蓝染的黏液性物质;黏液肉瘤镜检下与黏液瘤相近，但核分裂象较多见 。

　　6.3.8 组织细胞肉瘤是间叶组织细胞发生的恶性肿瘤，镜检肿瘤细胞具有高度多形性 。

　　6.3.9 骨瘤由均质的嗜酸骨黏蛋白基质组成，其中不规则的间隔含有成骨细胞群 。软骨瘤具有典型而独特的结构，由两个或多个软骨细胞组成的细胞群，分布于均质的软骨黏蛋白基质中，细胞成分从最不成熟的软骨细胞到完全成熟的软骨细胞等差异较大 。

　　6.3.10 骨硬化病镜下可见嗜碱性成骨细胞的数目增多和体积变大，破骨细胞数目增加但密度减少，哈氏管的大小和不规则性增加，陷窝的数目和体积增加且位置发生改变 。

　　6.4 鉴别诊断

　　6.4.1 本病引起的肿瘤病变需要与疱疹病毒感染引起的鸡马立克氏病(MD)以及另一种逆转录病毒感染引起的禽网状内皮组织增殖症(RE)进行鉴别 。

　　6.4.2 神经型 MD 可根据病鸡特征性麻痹症状及外周神经的病理变化确定诊断 。 内脏型 MD 和淋巴细胞性白血病眼观变化很相似 。一般 MDV 导致的肿瘤最早可发生于 4 周龄 ;MD 的法氏囊变化通常是萎缩或弥漫性增厚，而淋巴细胞性白血病常有法氏囊肿瘤 。

　　6.4.3 REV 导致的肿瘤最早可发生于 4 周龄，也可诱发 16 周龄以上的鸡产生淋巴白血病 。REV 可诱发神经增粗 、矮小症和非法氏囊 T 细胞淋巴瘤 ，但一般仅见于实验条件下感染鸡 ，或注射接种污染疫苗的鸡 。

　　6.4.4 当发生肿瘤时 ，应结合实验室病原学检测确定肿瘤与病原的相关性 ，鸡马立克氏病诊断技术按照 GB/T 18643 执行，禽网状内皮组织增殖症诊断技术按照 NY/T 1247 执行 。

　　6.5 临床判定

　　6.5.1 易感鸡群出现上述典型临床症状和病理变化，可临床判定为疑似 AL 病例 。

　　6.5.2 进一步确诊应采集发病期有明显临床症状鸡只的全血 、血清及肝 、脾等组织脏器和肿瘤组织开展病原分离鉴定 ，如有可能应同时采集同一流行病学单元内其他未见明显临床症状易感鸡群的全血 、血清进行实验室诊断 。

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　　7 样品采集与处理

　　7.1 样品采集

　　7.1.1 组织样品：无菌采集疑似病鸡的肝脏 、脾脏 、肾脏等组织 ，装入样品保存管 ，加入 50% 甘油⁃PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存 。

　　7.1.2 血液样品：无菌采集发病鸡只 EDTA 抗凝血及无抗凝剂添加全血 ，每只鸡不少于 2 mL，密封后冷藏保存 。

　　7.1.3 咽喉和泄殖腔拭子样品：取咽喉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮 3 次~5 次取咽喉分泌液 ;取泄殖腔棉拭子时 ，将棉拭子深入泄殖腔转 3 圈并蘸取少量粪便 ;将棉拭子头一并放入盛有1.5 mL PBS 的无菌离心管中(含青霉素 100 IU/mL 和链霉素 100 μg/mL)，加盖封口，冷冻保存 。

　　7.2 样品处理

　　7.2.1 组织样品：按脏器质量的 5 倍~10 倍加入灭菌生理盐水(含青霉素 100 IU/mL 和链霉素 100 μg/ mL)研磨，直至成匀浆液 。将悬液移至离心管中充分摇振后，4 ℃ 、10 000 r/min 离心 5 min，收集上清液并经 0 .22 μm 一次性滤器滤过除菌，滤液直接接种细胞培养或-80 ℃保存备用 。

　　7.2.2 EDTA 抗凝血：取 EDTA 抗凝血 200 μL，用无菌 PBS 洗涤 2 次~3 次(1 000 r/min，离心 5 min)收获上层血浆层(注意尽可能避免取到红细胞)。 经处理的样品当天使用 ，使用前置于 4 ℃保存 ，剩余样品置于-80 ℃保存 。

　　7.2.3 无抗凝剂添加全血：按常规方法制备血清 。使用前置于 4 ℃保存，剩余样品置-20 ℃保存 。

　　7.2.4 咽喉和泄殖腔拭子样品：装有拭子样品的无菌离心管经 4 ℃ 、10 000 r/min 离心 5 min，收集上清液经 0 .22 μm 一次性滤器滤过除菌备用 。接种细胞培养或-80 ℃保存备用 。

　　8 实验室诊断

　　8.1 病毒分离和鉴定

　　8.1.1 仪器设备

　　8.1.1.1 生物安全柜 。

　　8.1.1.2 恒温 CO2 细胞培养箱 。

　　8.1.1.3 倒置生物显微镜 。

　　8.1.1.4 台式低温高速离心机 。

　　8.1.1.5 研钵和研杵(或组织匀浆机)。

　　8.1.1.6 细胞培养瓶或培养皿 。

　　8.1.2 试剂材料

　　8.1.2.1 0.01 mol/L PBS(pH7 .4)，按照附录 A 中 A .1 配制 。

　　8.1.2.2 50% 甘油⁃PBS 保存液，按照 A .2 配制 。

　　8.1.2.3 青霉素，浓度为 10 000 IU/mL 。

　　8.1.2.4 链霉素，浓度为 10 000 μg/mL 。

　　8.1.2.5 细胞完全营养液和维持液，按照 A .3 配制 。

　　8.1.2.6 CEF(C/E 品系)，制备方法见附录 B 。

　　8.1.2.7 抗 ALV 单因子鸡血清，制备方法见附录 C 。

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　　8.1.2.8 包被液，配制方法按照附录 D 中 D .1。

　　8.1.2.9 洗涤液，配制方法按照 D .2。

　　8.1.2.10 样品稀释液，配制方法按照 D .3。

　　8.1.2.11 底物溶液，配制方法按照 D .4。

　　8.1.2.12 终止液，配制方法按照 D .5。

　　8.1.3 病毒的分离培养

　　8.1.3.1 接种培养：经 7.2 样品的采集与处理后无菌滤液或血浆 ，接种 CEF(C/E 品系)或 DF1 细胞单层后 ，将 6 孔细胞培养板放入 37 ℃ 、5% CO2 的细胞培养箱中培养 ，样品吸附 2 h 后弃去所有上清液并以灭菌的 PBS(0 .01 mol/L，pH7 .4)洗涤细胞 ，然后每孔更换 500 μL 细胞维持液 ，继续在 37 ℃ 、5%(体积分数)CO2 的细胞培养箱中培养 7 d。

　　8.1.3.2 细胞传代：将 8.1.3.1 培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养 7 d。

　　8.1.4 病毒的鉴定

　　8.1.4.1 IFA 鉴定

　　8.1.4.1.1 固定

　　将盖玻片上的单层细胞 ，在自然干燥后滴加丙酮-乙醇(6∶4)混合液 ，覆盖单层细胞为宜 ，室温固定5 min，待其自然干燥，用于 IFA，或置于-20 ℃保存备用 。设未感染的空白细胞单层为阴性对照 。

　　8.1.4.1.2 加第一抗体

　　用 0.01 mol/L 灭菌 PBS(pH7 .4)将单克隆抗体(如抗 ALV-J 亚群特异性单克隆抗体)或抗 ALV单因子鸡血清稀释至工作浓度，在 37 ℃水浴箱作用 40 min，然后用无菌 PBS 洗涤 3 次 。

　　8.1.4.1.3 加 FITC 标记第二抗体

　　按商品说明书用无菌 PBS 稀释 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体或山羊抗鸡 IgG 抗体至工作浓度(当第一抗体为 ALV 特异性单克隆抗体 ，选用 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体作为第二抗体 ;当第一抗体为鸡抗 ALV 单因子血清 ，则选用 FITC 标记的山羊抗鸡 IgG 抗体作为第二抗体)，然后添加至样品孔中 。细胞培养板置于 37 ℃温箱中作用 40 min，然后弃去抗体，用无菌 PBS 洗涤 3 次 。

　　8.1.4.1.4 加甘油

　　滴加少量 50% 甘油-PBS 于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上 。

　　8.1.4.1.5 结果观察与判定

　　在荧光显微镜下观察 。 阳性对照感染的细胞胞浆内呈现亮绿色荧光 ，阴性对照无显色 ，表明实验成立 。被感染的 CEF 或 DF1 细胞内呈现亮绿色荧光 ，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡 。在放大 200× ~400× 时 ，若观察到 CEF 或 DF1 细胞内呈现亮绿色荧光 ，判为 ALV 阳性 ，无亮绿色荧光者判为阴性 。

　　8.1.4.2 ALV⁃p27 抗原 ELISA 检测

　　8.1.4.2.1 抗原样本制备

　　将不同样品按照 7.2 所述方法处理后接种细胞 ，培养 7 d~14d 后取上清液直接检测 ，也可取细胞培养物冻融后检测 。

　　5

　　GB/T 26436—2025

　　8.1.4.2.2 p27 抗原 ELISA 检测

　　使用 p27 抗原 ELISA 检测商品化试剂盒按说明书进行检测，或按以下程序进行 。

　　a) 用包被液将抗 p27 蛋白抗体(商品化单克隆抗体或免疫实验兔血清)作 4 000 倍稀释 ，每孔

　　100 μL 加入 96 孔聚苯乙烯板中 ，4 ℃ 过夜 。取出包被好的聚苯乙烯板 ，将液体倒弃 ，每孔加

　　250 μL 洗涤液漂洗 3 次，每次 2 min，甩干 。

　　b) 每孔加 150 μL 质量浓度为 10 mg/L 的明胶封闭液 ，37 ℃ 反应 60 min 。将液体倒弃 ，每孔加

　　250 μL 洗涤液漂洗 3 次，每次 2 min，甩干 。

　　c) 在 A1、A2 孔各加 100 μL 标准阴性对照(不含有 ALV p27 蛋白的 SPF 鸡蛋清 、空白细胞培养物等)，A3、A4 孔各加 100 μL 标准阳性对照(含有 ALV p27 蛋白的 SPF 鸡蛋清 、ALV 细胞培养物等)。

　　d) 将待检样品以样品稀释液作 100 倍稀释 ，加入其他各孔 ，每孔 100 μL，37 ℃ 反应 60 min 。将液体倒弃，每孔加 250 μL 洗涤液漂洗 3 次，每次 2 min，甩干 。

　　e) 每孔加 100 μL 工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗 p27 蛋白抗体 ，37 ℃反应 60 min 。将液体倒弃，每孔加 250 μL 洗涤液漂洗 3 次，每次 2 min，甩干 。

　　f) 每孔加 100 μL 新配制的底物溶液，室温避光反应 10 min。

　　g ) 每孔加 100 μL 终止液 。

　　h) 置酶联检测仪于波长 450 nm 测定各孔光密度值(OD 值)。

　　8.1.4.2.3 结果判定

　　读取 OD 值，计算 S/P 值，按式(1)计算：

　　S/P=(OD450-S—OD450-NC)/(OD450-PC—OD450-NC)

　　式中：

　　S/P ——样品数值;

　　OD450-S ——待检样品在波长 450 nm 处的 OD 值;

　　OD450-PC ——阳性对照样品在波长 450 nm 处的平均 OD 值;

　　OD450-NC ——阴性对照样品在波长 450 nm 处的平均 OD 值 。

　　当 OD450-NC<0 .15 且 OD450-PC -OD450-NC >0 .3 时，试验结果有效，否则，应重新进行试验 。

　　在 试 验 成 立 的 前 提 下 ，待 检 样 品 S/P 值 >0 .2，判 为 p27 抗 原 阳 性 ;待 检 样 品 S/P 值 ≤0 .2，判 为p27 抗原阴性 。DF l 或 CEF(C/E 品系)细胞上清液检测出 ALV-p27 抗原时，判为外源性 ALV 阳性，否则判为阴性 。普通 CEF 细胞上清液检测出 ALV-p27 抗原时 ，无法区分是否有外源性 ALV 或内源性 ALV，需转接 DFl 细胞后判定 。

　　8.1.4.3 ALV⁃p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测

　　8.1.4.3.1 抗原样本制备

　　将不同样品按照 7.2 所述方法处理后接种细胞 ，培养 7 d~14d 后取上清液直接检测 ，也可取细胞培养物冻融后检测 。

　　8.1.4.3.2 p27 抗原免疫胶体金试纸卡检测

　　可用商品试剂盒检测 ，按厂家的说明书操作 。从 2 ℃ ~8 ℃ 冰箱中取出带包装的试纸卡 ，在室温(20 ℃~25 ℃)放置约 30 min 。打开试纸卡的密封包装袋 ，检查试纸卡是否正常 。如试纸卡已变形 、变

　　6

　　GB/T 26436—2025

　　色或受潮则不能使用 。将试纸卡平放于操作台面 ，加样孔朝上 ，向加样孔中加入待检样品 ，室温静置5 min，观察结果 。

　　8.1.4.3.3 结果判定

　　如果对照线(C 线)和检测线( T 线)均显色，则为阳性;对照线显色而检测线不显色，则为阴性 。如果对照线不显色 ，则检测无效 ，需换用另一根试纸卡重新检测 。 阳性对照和阴性对照符合上述判定标准时 ，表明实验成立 。 当样本在 DFl 细胞或 CEF(C/E 品系)培养后上清液检测出 ALV-p27 抗原时 ，判为外源性 ALV 阳性，否则判为阴性 。

　　8.2 病毒亚群的鉴定

　　8.2.1 按照 8.1.4.1 方法 ，利用 J 亚群 ALV 特异性单克隆抗体进行 IFA 检测 ，可鉴定 J 亚群 ALV，但不能鉴别其他 ALV 亚群(如 A 亚群 、B 亚群 、C 亚群 、D 亚群 、K 亚群)。

　　8.2.2 对分离得到的病毒用 RT-PCR(针对上清液中的游离病毒 RNA)或 PCR(针对细胞中的前病毒cDNA)扩增和克隆囊膜蛋白 env 基因，测序后与基因序列数据库(GenBank)中已知 ALV 的 A 亚群 、B亚群 、C 亚群 、D 亚群 、E 亚群 、J 亚群和 K 亚群的 env 基因序列做同源性比较 ，即可根据同源性对病毒进行分群 。ALV 亚群鉴定程序见附录 E 。

　　8.3 Real⁃time RT⁃PCR 扩增 ALV⁃J

　　受不同鸡群中复杂的内源性 ALV 核酸干扰，该方法在进行确诊时存在假阳性风险，仅适用于鸡群的快速检疫或 ALV-J 感染的初步筛查 。血浆 、组织样品或泄殖腔拭子样品可直接用于检测 ，见附录F 。J 亚群禽白血病病毒一步法 Realtime RT-PCR 检测试剂盒的组成及使用见附录 G 。

　　8.4 血清学诊断

　　8.4.1 仪器设备

　　8.4.1.1 酶标仪 。

　　8.4.1.2 恒温培养箱 。

　　8.4.1.3 洗板机 。

　　8.4.1.4 微量可调移液器(2 .5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL 等不同规格)。

　　8.4.1.5 ELISA 反应板和枪头 。

　　8.4.2 试剂材料

　　8.4.2.1 禽白血病 J 亚型抗体 ELISA 检测试剂盒 。

　　8.4.2.2 禽白血病 AB 亚型抗体 ELISA 检测试剂盒 。

　　8.4.3 ELISA 检测

　　选用商品化的禽白血病 AB 抗体 ELISA 检测试剂盒及 J 亚群抗体 ELISA 检测试剂盒 ，按说明书操 作 和 判 定 。J 亚 群 抗 体 ELISA 检 测 试 剂 盒 可 检 测 出 J 亚 群 ALV 感 染 产 生 的 抗 体 或 J 亚 群 同 源gp85 蛋白诱导产生的抗体，AB 抗体 ELISA 检测试剂盒可检出 A 亚群 、B 亚群及 K 亚群 ALV 感染产生的抗体或相应亚群 gp85 蛋白诱导产生的抗体 。

　　8.4.4 IFA 检测

　　8.4.4.1 抗原制备

　　抗原制备方法见附录 H 。

　　7

　　GB/T 26436—2025

　　8.4.4.2 操作步骤

　　在 相 应 的 盖 玻 片 上 或 抗 原 孔 中 加 入 用 PBS 稀 释 的 待 检 鸡 血 清 ，在 37 ℃ 下 作 用 40 min，用 无 菌PBS 洗 涤 3 次 。再 加 入 工 作 浓 度 的 FITC 标 记 的 山 羊 抗 鸡 IgG 抗 体 ，在 37 ℃ 作 用 40 min，用 无 菌PBS 洗涤 3 次，加少量 50% 甘油⁃PBS 后在荧光显微镜下观察 。 结果的判定方法同 8.1.4.1.5。

　　8.4.5 血清学结果的判定

　　当待检鸡群检出 A 亚群 、B 亚群 、K 亚群及 J 亚群抗体阳性时 ，表明该群鸡可能曾经有过外源性ALV 感染，确诊需按照 8.1 进行病毒分离鉴定 。

　　9 综合判定

　　9.1 疑似

　　通过临床诊断判为可疑或疑似病例 。符合 8.4.5 中的阳性情况 ，初步判定为外源性 ALV 感染可疑病例 。

　　9.2 确诊

　　经临床诊断判为可疑或疑似病例的鸡只 ，符合 8.1 经 DF1 细胞或 CEF(C/E 品系)细胞病毒分离为阳性结果时，判定被检样品为外源性 ALV 感染引起的病例 。经 8.2 确定亚群的，可判定被感染鸡中外源性 ALV 的亚群 。

　　8

　　GB/T 26436—2025

　　附 录 A

　　(规范性)

　　病毒分离相关溶液的配制

　　A.1 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)

　　称取 8.00 g 氯化钠(NaCl)、0.20 g 氯化钾(KCl)、1.42 g 磷酸氢二钠(Na2HPO)、0.27 g 磷酸二氢钾( KH2PO4)加去离子水溶解至 1 000 mL，调节 pH 至 7.4，103 kPa 高压蒸汽灭菌 30 min，室温保存 。

　　A.2 50% 甘油⁃PBS 保存液(pH 7.4)

　　将 0.01 mol/L PBS 与纯甘油(分析纯)等量混合 ，调节 pH 至 7.4，分装为小瓶 ，103 kPa 高压蒸汽灭菌 30 min。室温或 4 ℃保存 。

　　A.3 细胞完全营养液和维持液

　　A.3.1 DMEM 基础营养液(pH 7.2)

　　可购买商品化液体 DMEM 基础培养基，也可购买粉状 DMEM 基础培养基自行配置，根据商品说明书将 DMEM 粉加入相应体积蒸馏水中过滤除菌，4 ℃保存备用 。

　　A.3.2 细胞完全营养液(pH 7.2)

　　取 900 mL 的 DMEM 基础营养液加 100 mL 的灭活胎牛血清混合，配制成 1 000 mL 溶液，加入青霉素至终浓度 100 IU/mL，链霉素至终浓度 100 μg/mL，4 ℃保存备用 。

　　A.3.3 细胞维持液(pH 7.2)

　　取 990 mL 的 DMEM 基础营养液加 10 mL 的灭活胎牛血清混合 ，配制成 1 000 mL 溶液 ，加入青霉素至终浓度 100 IU/mL，链霉素至终浓度 100 μg/mL，4 ℃保存备用 。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 B

　　(资料性)

　　CEF(C/E 品系)的制备

　　选择 9 日~10 日龄发育良好的 SPF 鸡胚 。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位 ，无菌取出鸡胚放入灭菌的玻璃器皿内 ，去除头 、四肢和内脏 ，用无血清的 DMEM 培养基液洗涤胚体 。用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块 ，再用无血清的 DMEM 培养基液洗 2 次~3 次 ，然后加 0.25% 胰酶溶液(每个鸡胚约加 1 mL)，在 37.5 ℃ ~38.5 ℃ 水浴中消化 10 min ~15 min。 吸出胰酶溶液消化产生的悬液 ，再加入适量的营养液(用无血清的 DMEM 培养基液 ，加青霉素 100 IU/mL、链霉素 100 μg/mL)吹打 ，用 4 层纱布或一次性铜网滤过 。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数 ，其余在 1 000 r/min 下离心5 min。将细胞沉淀再混悬于细胞培养液中 ，制成每毫升含活细胞数约 100 万~150 万的细胞悬液 ，分装于 T25 培养瓶(皿)中，进行培养 。形成单层后备用(一般在 24 h 内应用)。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 C

　　(资料性)

　　抗 ALV 单因子鸡血清的制备

　　选择经鉴定无任何其他潜在病毒污染的 ALV 参考株作为种毒(如经 ALV-J 全基因组 cDNA 克隆质粒 DNA 转染 SPF 鸡的 CEF 所产生的分子克隆化 ALV)，接种 DF1 或 CEF(C/E 系)后复制和扩增病毒 。病毒接种细胞继续培养 5 d 后 ，再传代一次 。将传代长成单层的细胞培养液换成含 1% 胎牛血清的 DMEM 维持液，继续培养 72 h~96 h 后收取上清液(通常可达到最高病毒效价)，分装在小试管中 ，每支 1 mL，于-80 ℃冰箱保存 。2 d~3d 后 ，取出一支 ，用细胞培养液作 10 倍系列稀释后 ，分别接种于含有新鲜配制的细胞单层(细胞覆盖面 70%)96 孔培养板上 ，每个稀释度 8 孔 。在 37 ℃下培养6 d 后 ，弃上清液 ，用 PBS 洗一次后 ，加入预冷的丙酮-乙醇(6∶4)固定 。待自然干燥后 ，用抗 ALV-J 的单克隆抗体进行 IFA(见 8.1.4.1)，以 IFA 的结果来判定病毒感染的终点 ，测定其中 ALV 的 TCID50量 。选用 6 周龄以上 SPF 鸡 ，隔离器饲养 。每只鸡皮下接种 104 TCID50 的 ALV 悬液 。4 周~6 周后采集血清 。IFA 抗体滴度≥1∶100。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 D

　　(规范性)

　　p27 抗原 ELISA 检测相关溶液的配制

　　D.1 包被液

　　分别称取碳酸钠 1.59 g、碳酸氢钠 2.93 g，加蒸馏水至 1 000 mL，充分溶解备用 。

　　D.2 洗涤液

　　在 1 000 mL 的无菌 PBS 中加入 0.5 mL 吐温-20，充分溶解备用 。

　　D.3 样品稀释液

　　含 10%(体积分数)新生牛血清的洗涤液 。

　　D.4 底物溶液

　　分别称取柠檬酸 3.26 g、十二水磷酸氢二钠 12.9 g，加蒸馏水至 700 mL，配制成(pH5.0)磷酸盐-柠檬酸缓冲液，充分溶解备用 。

　　用二甲基亚砜配制质量浓度为 10 mg/L 的 3′3′5′5′-四甲基联苯胺溶液(TMB)，4 ℃保存 。使用时分别量取磷酸盐-柠檬酸缓冲液 9.9 mL、1% TMB 0.1 mL、30% 过氧化氢 1 μL 充分混匀后备用 。

　　D.5 终止液

　　量取硫酸 58 mL，加入蒸馏水 442 mL，充分混匀后备用 。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 E

　　(资料性)

　　ALV 亚群鉴定程序

　　E.1 克隆载体和宿主菌

　　商品化的 PCR 产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒 。可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如 TGl 等。

　　E.2 病毒模板的制备

　　使用商品化细胞 DNA 提取试剂盒按说明书提取模板 DNA，或按以下程序提取模板 DNA。

　　a) 接种病毒的细胞经磷酸盐缓冲液洗涤 3 次 ，加入适量 0.25% 胰酶 ，37 ℃ 温箱中放置 5 min~

　　10 min，将细胞消化吹打后收集于 1.5 mL 离心管中 。

　　b) 2 000 r/min 离 心 收 获 细 胞 ，然 后 加 入 500 μL 抽 提 缓 冲 液(100 mmol/L 氯 化 钠 ，10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，25 mmol/L EDTA pH8.0，0.5%SDS)悬浮后，加入 5 μL 蛋白酶 K(100 μg/mL)， 56 ℃水浴中消化 5 h。

　　c) 加入等体积的苯酚-三氯甲烷溶液(苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇 =25∶24∶1)约 500 μL 抽提一次 ，将上层液体转移至另一 1.5 mL 离心管中 ，加入 1/10 体积 3 mol/L 乙酸钠和 2 倍体积无水乙醇后，置于-20 ℃冷却 2 h 或者更长时间 。

　　d) 取出后 12 000 r/min 离心 10 min 沉淀 DNA，弃去上清液 。再小心加入 70%(体积分数)冷乙醇轻洗 DNA 沉淀，弃去上清液 。

　　e) 经乙醇沉淀后的 DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于 50 μL 双蒸水中，即为模板 DNA。

　　E.3 囊膜蛋白 env 基因的扩增

　　E.3.1 引物

　　可根据已发表资料合成扩增 ALV-J 的前病毒 DNA 特异性 PCR 引物，本例示范引物为：

　　——正向引物：5′-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3′，相当于 ALV-J 原型毒株 HPRS-103前病毒基因组 DNA 序列的第 5394 对~第 5416 对碱基;

　　——反向引物：5′-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3′，相当于 ALV-J 原型毒株 HPRS-103 前病毒基因组 DNA 序列的第 7811 对~第 7794 对碱基 。

　　引物用双蒸水稀释为 25 pmol/μL，-20 ℃保存备用 。

　　E.3.2 PCR

　　以 E.2 中 提 取 的 细 胞 DNA 为 模 板 ，扩 增 ALV-J 的 囊 膜 蛋 白 基 因( env)特 异 性 2.2 kb 条 带 ，其PCR 反应体系(50 μL)见表 E.1。可采用同等扩增效率的商品化 PCR 试剂盒 。

　　表 E.1 ALV⁃J env 基因 PCR 反应体系

　　组 分

　　体积/μL

　　双蒸水

　　30.5

　　10×缓冲液(无 Mg2+)(成分：100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，500 mmol/L 氯化钾，1% 明胶)

　　5.0

　　氯化镁(15 mmol/L)

　　4.0

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　　GB/T 26436—2025

　　表 E.1 ALV⁃J env 基因 PCR 反应体系(续)

　　组 分

　　体积/μL

　　dNTPs(2 .5 mmol/L)

　　4.0

　　正向引物(25 pmol/μL)

　　2.0

　　反向引物(25 pmol/μL)

　　2.0

　　DNA 聚合酶(5 U/μL)

　　0.5

　　模板 DNA(约 100 ng/μL)

　　2.0

　　总体积

　　50.0

　　将上述成分分别加入灭菌的 PCR 管中 ，轻轻混合均匀 ，离心后置于 PCR 扩增仪 。扩增程序为： 95 ℃ 预 变 性 5 min;95 ℃ 变 性 1 min，50 ℃ 退 火 1 min，72 ℃ 延 伸 150 s，进 行 30 个 循 环 ;72 ℃ 延 伸10 min 。扩增产物 4 ℃保存 。

　　E.3.3 PCR 产物 DNA 电泳

　　用微量移液器取 4.5 μL PCR 产物加入 0.5 μL 的 10× 进样缓冲液(0 .25% 溴酚蓝 ，0.25% 甲苯苯胺 ，15% 聚 蔗 糖 400)，在 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 上 进 行 电 泳 ，同 时 在 另 一 加 样 孔 加 入 5 μL DL2000 DNA Marker 。在 TAE 电泳缓冲液[由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙醇(acetic acid)和 EDTA 组成]中 ， 90 V 电压，电泳 50 min 后，于紫外光凝胶成像分析系统中观察并记录结果 。

　　E.3.4 PCR 产物的回收与定量

　　可采用商品化 PCR 产物回收试剂盒进行回收 。

　　E.4 PCR 产物的克隆

　　E.4.1 连接反应

　　将载体与纯化回收 PCR 产物于 16 ℃下连接 6 h~8h 。连接体系为：

　　——25 ng 载体;

　　——100 ng 纯化 env 基因 PCR 产物;

　　——5 μL 溶液 I。

　　加双蒸水至 10 μL 。

　　E.4.2 质粒转化用感受态大肠杆菌的制备

　　用氯化钙法制备大肠杆菌 TGl 菌株的感受态细胞，步骤简述如下 。

　　a) 一个盛约 50 mL LB 液体培养基的锥形瓶 ，接种大肠杆菌 TGl 菌株 ，在 37 ℃恒温振荡器中振荡培养至半浑浊半透明状态 。

　　b) 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的-20 ℃保存的 50 mL 离心管中 ，冰浴放置 10 min，使培养物冷却至 0 ℃ 。

　　c) 4 ℃以 4 000 r/min 离心 10 min，回收细菌细胞 。

　　d) 倒出上清液，将管倒置 1 min，以使残余的培养液流尽 。

　　e) 用 10 mL 用冰预冷的 0.1 mol/L 氯化钙重悬每份沉淀，冰浴放置 30 min。

　　f) 4 ℃以 4 000 r/min 离心 10 min，回收细菌细胞 。

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　　GB/T 26436—2025

　　g ) 倒出上清液，将管倒置 1 min，以使残余的培养液流尽 。

　　h) 每 50 mL 初始培养物用 l mL 用冰预冷的 0.1 mol/L 氯化钙重悬每份沉淀，4 ℃保存备用 。 E.4.3 质粒的转化

　　将 E .4.1 中得到的连接产物转化大肠杆菌，步骤简述如下 。

　　a) 10 μL 连接产物加入 200 μL 新鲜制备的 TGl 感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置 30 min。

　　b) 放入 42 ℃循环水浴中，准确热激 90 s。

　　c) 快速转移至冰浴中，使之冷却 2 min~3 min。

　　d) 每管加 LB 培养基 800 μL，在 37 ℃摇床上(转速不超过 220 r/min)，温育 45 min，使细菌复苏。

　　e) 取 200 μL 菌液均匀涂布到含有 100 μg/μL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上 。

　　f) 将平板置于 37 ℃温箱中培养 12 h，挑取单个菌落培养后，进行质粒 DNA 的制备与鉴定 。

　　E.5 质粒 DNA 的提取和鉴定

　　E.5.1 质粒 DNA 的提取

　　挑选平板上的白色菌落 ，接种至氨苄青霉素浓度为 50 μg/mL 的 5 mL LB 液体培养基中 ，于 37 ℃摇床上振荡培养 6 h，提取质粒，可选用商品化质粒提取试剂盒按照说明书提取，也可参照如下步骤 。

　　a) 将 培 养 液 倒 入 1.5 mL 离 心 管 中 ，12 000 r/min，离 心 1 min，倒 掉 上 清 液 。用 1 mL TE Tris- EDTA 缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体 。

　　b) 将沉淀悬浮于 100 μL 用冰预冷的溶液 Ⅰ , 在振荡器上强烈振荡混匀 。

　　c) 加 200 μL 溶液Ⅱ(不超过 5 min，溶液Ⅱ需现配)，颠倒 5 次(不要强烈振荡)，冰浴中放置 3 min。

　　d) 加 150 μL 溶液Ⅲ , 温和振荡 10 s，冰浴中放置 3 min~5 min。

　　e) 12 000 r/min 离心 5 min，将上清液转移至另一离心管中 ，加入等体积的苯酚-三氯甲烷 ，在振荡器上振荡混匀 。

　　f) 12 000 r/min 离心 5 min，将上清液转移至另一离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇 。

　　g ) 12 000 r/min 离心 10 min~15 min，用 1 mL70%(体积分数)乙醇漂洗沉淀，干燥 DNA 沉淀 。

　　h) 用 50 μL 双蒸水或 TE 缓冲液溶解沉淀，同时加入 0.5 μL~1 μL RNase 。 -20 ℃保存备用 。 E.5.2 重组质粒 DNA 的酶切鉴定

　　以质粒上带有的酶切位点使用相关内切酶进行双酶切鉴定 。酶切体系如下：

　　——10 μL 质粒 DNA;

　　——7 μL 双蒸水;

　　——2 μL 10×缓冲液 K;

　　——0.5 μL EcoR Ⅰ;

　　——0.5 μL Hind Ⅲ 。

　　使总体积为 20 μL，以上组分混匀后 ，轻微离心 ，37 ℃酶切 2 h 。于 0.8% 琼脂糖凝胶中 90 V 电泳45 min，在凝胶成像系统下观察并记录结果 。

　　E.6 克隆序列的测定

　　将 上 一 步 经 EcoR Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双 酶 切 鉴 定 的 阳 性 克 隆 测 序 。 所 得 序 列 与 GenBank 中 发 布 的ALV 的 A 亚群 、B 亚群 、C 亚群 、D 亚群 、E 亚群 、J 亚群和 K 亚群的囊膜蛋白 env 基因做同源性比较分析，并确定属于哪个亚型 。可参考的 GeneBank 中序列编号分别为：M37980 和 DQ365814(A 亚型); AF052428(B 亚 型);J02342(C 亚 型);D10652(D 亚 型);M12172、EF467236 和 AY013303(E 亚 型);

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　　GB/T 26436—2025

　　Z46390、AF247391、DQll6805、AY897219 和 EU264064(J 亚 型);KY773911 和 MG770235(K 亚 型)。对于 A 亚群 、B 亚群 、C 亚群 、D 亚群 、K 亚群和 E 亚群，核苷酸或氨基酸的同源性应分别大于 90% ，与哪个参考亚型的同源性最高 ，即确定是这个亚型 。对于 J 亚群 ，应与大多数已知 J 亚群序列的同源性大于 80% 。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 F (资料性)

　　Real⁃time RT⁃PCR 扩增 ALV⁃J

　　F.1 引物和探针序列

　　选择 ALV-J 特异性 env 基因序列作为 ALV-J 检测的靶序列，产物长度为 138 bp。

　　上游引物：5′-AGAAAGACCCGGAGAAGAC-3′;

　　下游引物：5′-ACACGTTTCCTGGTTGTT-3′;

　　TaqMan 探针：5′-ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG-3′，其 5′端和 3′端分别标记 FAM 和 BHQ。

　　F.2 样品采集和前处理

　　样品采集和前处理按照第 7 章 。

　　F.3 核酸抽提

　　使用商品化细胞 DNA 提取试剂盒按说明书提取模板 DNA 或按以下程序提取模板 DNA。

　　a) 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管编号(n 为被检样品与阴性对照 、阳性对照之和)。

　　b) 每管加入 600 µL 裂解液 ，分别加入被检样本 、阴性对照 、阳性对照各 200 µL，再加入 200 µL三氯甲烷 ，混匀器上振荡混匀 5 s(不能过于强烈 ，以免产生乳化层 ，也可用手颠倒混匀)。 于

　　4 ℃ 、12 000 r/min 离心 15 min。

　　c) 取与步骤 a)相同数量灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 400 µL 异丙醇(-20 ℃ 预冷)，做标记 。 吸取步骤 b)各管中的上清液转移至相应的管中 ，上清液应至少吸取 500 µL，尽量避免吸出中间层，颠倒混匀 。

　　d) 于 4 ℃ 、12 000 r/min 离心 15 min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，蘸干液体(不同样品需在吸水纸不同地方蘸干);加入 600 µL 75%(体积分数)乙醇，颠倒洗涤 。

　　e) 于 4 ℃ 、12 000 r/min 离心 10 min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量蘸干液体(不同样品需在吸水纸不同地方蘸干)。

　　f) 4 000 r/min 离心 10 s(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部 ，小心倒去上清液 ，用微量加样器将其吸干 ，吸头不要碰到有沉淀一面 ，室温干燥 5 min~

　　10 min。

　　g) 加入 15 µL DEPC 水 ，溶解管壁上的 RNA，5 000 r/min 离心 5 s，冰浴保存备用 。若需长期保存需放置-70 ℃ 冰箱 。

　　F.4 扩增试剂准备

　　在反应混合物配制区进行 。取出 ALV-J 一步法 Real-time RT-PCR 检测试剂盒(见附录 G)，在室温下融化后 ，6 000 r/min 离心 5 s，每个 PCR 反应体系按表 F.1 所示用量配制 PCR 反应混合液(需配制反应液数量为样本个数 、阴性对照 、阳性对照的和再加 1)。

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　　GB/T 26436—2025

　　表 F.1 PCR 反应体系

　　试 剂

　　用量/µL

　　RT-PCR 反应液

　　14.5

　　Taq 酶(5 U/µL)

　　0.25

　　逆转录酶

　　0.25

　　将以上 PCR 反应试剂按使用量吸取至一个离心管中，充分混匀，然后在每个 PCR 管中分装 15 µL，转移至样本处理区 。

　　F.5 加样检测

　　在已分装有 PCR 反应混合液的 PCR 管中分别加入已提取好的核酸 10 µL，盖上管盖 ，将 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，记录样本放置顺序 。在扩增检测区进行 。

　　F.6 反应条件设置

　　第一步：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。

　　第二步：95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，5 个循环 。

　　第三步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环 。

　　60 ℃时设置采集荧光 。

　　F.7 荧光素设定

　　报 告 基 团(report dye)设 定 为 FAM，淬 灭 基 团(quench dye)设 定 为 BHQ(或 Tamra 或 Eclipse)， Reference dye 设定为 None。

　　F.8 分析条件设定及结果判定

　　F.8.1 质控标准

　　F.8.1.1 综合分析仪器给出的各项结果 ，基线以仪器给出的默认值作为参考 ，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准 ，具体根据仪器噪声情况进行调整 ，选择 FAM 通道进行分析 。

　　F.8.1.2 ALV-J 阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照呈现典型 S 型扩增曲线 ，且 Ct 值≤30;阴性对照无 S 型扩增曲线，且无 Ct 值 。否则此次实验结果无效，应重新进行实验 。

　　F.8.2 结果判定及描述

　　F.8.2.1 样本 Ct 值≤30 且呈 S 型扩增曲线，表明 ALV-J 核酸阳性 。样本无 Ct 值且无 S 型扩增曲线，表明 ALV-J 核酸阴性 。

　　F.8.2.2 对于 30

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 G (资料性)

　　ALV⁃J 一步法Real⁃time RT⁃PCR 检测试剂盒的组成及使用

　　G.1 试剂盒组成

　　每个试剂盒可做 48 个检测，包括以下成分：

　　——1 管 750 µL RT-PCR 反应液;

　　——1 管 12.5 µL Taq 酶;

　　——1 管 12.5 µL 逆转录酶;

　　——1 管 1.0 mL 阴性对照;

　　——1 管 1.0 mL 阳性对照;

　　——1 管 1.0 mL DEPC 水;

　　——1 管 30 mL 裂解液 。

　　G.2 说明

　　G.2.1 RT-PCR 反应液(1×)：含 50 mmol/L KCl ，10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，2.5 mmol/L MgCl2， 0.2 mmol/L dNTP 混合物 ，上 、下游引物各 20 nmol/mL，探针 10 nmol/mL，1U Taq 酶 ，100 U 逆转录酶，2 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，5% 甘油 。

　　G.2.2 阳性对照：ALV-J 靶基因 RNA 经稀释保存于 75%(体积分数)乙醇中 。

　　G.2.3 裂解液为 Trizol，于 4 ℃保存，也可采用功能等效的提取试剂 。

　　G.3 使用时的注意事项

　　G.3.1 在检测过程中，需严防不同样品间的交叉污染 。

　　G.3.2 反应液分装时避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器 。

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　　GB/T 26436—2025

　　附 录 H

　　(资料性)

　　IFA 法抗体检测用 ALV 感染细胞的制备

　　在已铺满 DF1 或 CEF(C/E 系)单层细胞的细胞瓶或培养皿中接种 0.5 mL 含 103 TCID50 的 ALV (如 ALV-J)悬液 ，37 ℃ 、5%(体积分数)CO2 恒温培养箱中培养 ，24 h 后换 1% 胎牛血清的 DMEM 培养基继续培养 。继续培养 5 d 后将细胞单层用 0.25% 胰酶溶液消化分散成悬液 ，经离心后 ，重新悬浮于 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基中 。将细胞浓度调至每毫升 5×105 个细胞 。在加入盖玻片的培养皿中加入 5 mL 细胞悬液，或在 96 孔细胞培养板上每孔加入 100 µL 细胞悬液 。在 37 ℃继续培养 4 d。将盖玻片从培养皿中取出或 96 孔细胞培养板弃去培养基 ，经无菌 PBS 漂洗一次后 ，滴加预冷的丙酮-乙醇(6∶4)固定液室温固定 5 min。 自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置于-20 ℃保存 。

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　　GB/T 26436—2025

　　参 考 文 献

　　[1] Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (WOAH)

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