T/ZNZ 291-2024 饲料中多种抗球虫类药物的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS 65.120
CCS B 46
浙江省农产品质量安全学会团体标准
T/ZNZ 291—2024
饲料中多种抗球虫类药物的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of a variety of coccidiostat in feeds by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
2024 - 10 - 28 发布2024 - 11 - 28 实施
浙江省农产品质量安全学会发布

前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起
草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。
本文件起草单位：绿城农科检测技术有限公司。
本文件主要起草人：余鹏飞、董叶箐、傅诗敏、沈雄雅、陈蓉、何誉、倪娟桢、林婷、孙文闪、何
晓明、徐伟荣。
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饲料中多种抗球虫类药物的测定液相色谱-串联质谱法
1 范围
本文件规定了饲料中16种抗球虫类药物的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料等4类饲料中氨丙啉、常山酮、地克
珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲苄喹啉、甲基盐霉素、克拉珠利、氯苯胍、氯羟吡啶、拉沙洛西、马度
米星铵、莫能菌素、尼卡巴嗪标志物、盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理
试样中抗球虫类药物经乙腈水溶液提取，用通过型亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化，液相色谱-串
联质谱定性定量测定，基质外标法定量。
5 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂和材料
5.1.1 乙腈（CH3CN）。
5.1.2 甲醇（CH3OH）。
5.1.3 N,N-二甲基甲酰胺。
5.1.4 乙酸铵（HCOONH4）。
5.2 试剂配制
5.2.1 80%乙腈水溶液：取乙腈800 mL、水200 mL，混匀。
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5.2.2 0.005 mol/L 乙酸铵水溶液：取乙酸铵0.385 g，用水溶解并稀释至1000 mL。
5.3 标准品
氨丙啉、常山酮、地克珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲苄喹啉、甲基盐霉素、克拉珠利、氯苯胍、
氯羟吡啶、拉沙洛西、马度米星铵、莫能菌素、尼卡巴嗪标志物、盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯含量≥95.0%，
或均应为有证标准物质，具体见附录A。
5.4 标准溶液配制
5.4.1 标准储备溶液（1000 mg/L）：分别准确称取适量16 种抗球虫类药物标准品（相当于有效成分
10 mg，精确至0.01 mg），用N,N-二甲基甲酰胺3 mL 溶解后，再用甲醇定容至10 mL，此溶液浓度均
为1000 mg/L。-18 ℃避光密封保存，有效期6 个月。
5.4.2 混合标准工作液：准确量取标准储备液（5.4.1）氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉各0.1 mL，常山
酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物各
0.5 mL，氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺各2 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容
至刻度，配制成混合标准工作液。其中氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉浓度为1 mg/L，常山酮、甲基盐
霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物浓度为5 mg/L，
氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺浓度为20 mg/L。-18 ℃避光密封保存，有效期1 个
月。
5.5 材料
5.5.1 通过型亲水亲脂平衡型固相萃取柱：200 mg，6 mL。
5.5.2 聚四氟乙烯微孔滤膜：0.22 μm。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
6.2 分析天平：感量0.01 mg 和1 mg。
6.3 离心机：≥4000 r/min。
6.4 涡旋振荡器。
6.5 超声波清洗器。
6.6 固相萃取装置。
7 试样的制备与保存
7.1 试样的制备
按GB/T 14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样，按照GB/T 20195 制备试样，
粉碎后过0.45 mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。
a)取粉碎过筛后的供试样品，作为供试试料。
b)取粉碎过筛后的空白样品，作为空白试料。
c)取粉碎过筛后的空白样品，添加适宜浓度的混合标准工作液,作为空白添加试料。
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7.2 试样的保存
将样品置于阴凉、避光处保存。
8 测定步骤
8.1 提取
称取2 g（精确至0.001g）试样于50 mL 离心管中，准确加入10 mL80%乙腈水溶液（5.2.1）涡
旋混匀5 min 后，超声提取20 min， 4000 r/min 离心5 min，取上清液于50 mL 离心管中；残渣用10
mL80%乙腈水溶液（5.2.1）重复提取一次，合并上清液，备用。
8.2 净化
移取1 mL 备用液过固相萃取柱，弃去，再移取2 mL 备用液过柱，收集滤液，过滤膜，供液相
色谱—串联质谱仪测定。
8.3 基质匹配标准曲线的制备
取6 份空白样品经提取和净化后，加入适量的混合标准工作液（5.4.2）配制成氨丙啉、甲卞喹啉、
癸氧喹酯浓度为0.0005 mg/L、0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05mg/L；常山酮、
甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物浓度
为0.0025 mg/L、0.005 mg/L、0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.25 mg/L；氯羟吡啶、乙氧酰胺苯
甲酯、克拉珠利、二硝托胺浓度为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、1 mg/L 的
基质匹配标准溶液，供液相色谱—串联质谱测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液
浓度为橫坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a) 色谱柱：T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），或相当者。
b) 流动相：A为0.005 mol/L乙酸铵水溶液（5.2.2），B为甲醇。
c) 梯度洗脱：洗脱程序见表1。
d) 流速：0.35 mL/min。
e) 柱温：40℃。
f) 进样量：2 μL。
表1 梯度洗脱程序
时间，min A，% B，%
0 95 5
0.5 95 5
2.5 5 95
5.5 5 95
5.51 95 5
8.5 95 5
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8.4.2 质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a) 离子源：电喷雾（ESI）离子源。
b) 扫描方式：正/负离子扫描。
c) 检测方式：多反应监测。
d) 接口温度：350℃。
e) 脱溶剂温度：602℃。
f) 加热块温度：400℃。
g) 雾化气流量：3 L/min。
h) 加热气流量：10 L/min。
i) 干燥气流量：10 L/min。
j) 其他质谱参数参考值见表A.2。
8.4.3 定性测定
在同样测试条件下，试样中待测药物的保留时间与基质匹配标准工作液中待测药物的保留时间之比，
偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。
其允许偏差应符合表3的要求。
表3 定性确证时相对离子丰度的允许偏差
相对丰度（%） ＞50 ＞20-50 ＞10-20 ≤10
允许偏差（%） ± 20 ± 25 ± 30 ± 50
8.4.4 定量测定
取试样溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按外标法定量，基质匹配标准工作液及试
料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超过线性范围，应重新实验或将试样溶液和
基质匹配标准溶液作相应稀释f倍后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液
浓度相差不超过30%。在上述色谱质谱条件下标准溶液特征离子质量色谱图见附录B。
8.4.5 空白试验
取空白试样，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9 结果计算和表述
试样中抗球虫药物的量标准曲线校准按（1）计算或单点校准按（2）计算， 结果保留3 位有效数字。
� = �×�×1000
�×1000 × � ··································（1）
式中：
� ——试样中被测物质的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
�——由标准曲线得到的试样溶液中相对应被测物质浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
� ——试料质量的数值，单位为克（g）；
1000 ——换算系数；
f——上机测定的试样溶液浓度超出线性范围后，进一步稀释的倍数。
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� = �×��×�×1000
��×�×1000 × � ··································（2）
式中：
� ——试样中被测物质的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
� ——试样中被测物质的峰面积；
�� ——基质匹配标准溶液中被测物质浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L）；
V——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
�� ——基质匹配标准溶液中被测物质的峰面积；
� ——试料质量的数值，单位为克（g）；
1000 ——换算系数；
f ——上机测定的试样溶液浓度超出校准点30%，进一步稀释的倍数。
10 方法灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯的定量限为0.01mg/kg；常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯
苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物定量限为0.05 mg/kg；氯羟吡啶、
乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺的定量限为0.2 mg/kg。
10.2 准确度
本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯在0.01 mg/kg~0.25mg/kg，常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、
氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物在0.05 mg/kg~1.25 mg/kg，氯羟
吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺在0.2 mg/kg~5 mg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对偏差≤15%。
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附录A
（资料性）
16 种抗球虫药物的中英文名称、CAS 号、分子式、相对分子量及定性、定量和质谱分析参数
16种抗球虫药物的中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量见表A.1。
表A.1 16 种抗球虫药物的中英文名称、CAS 号、分子式、相对分子量
序号中文名称英文名称CAS号分子式相对分子量
1 氨丙啉Amprolium 121-25-5 C14H19ClN4 278.79
2 常山酮Halofuginone 55837-20-2 C16H17BrClN3O3 414.68
3 地克珠利Diclazuril 101831-37-2 C17H9Cl3N4O2 407.64
4 二硝托胺Dinitolmide 148-01-6 C8H7N3O5 225.16
5 癸氧喹酯Decoquinate 18507-89-6 C24H35NO5 417.53
6 甲苄喹啉Nequinate 13997-19-8 C22H23NO4 365.42
7 甲基盐霉素Narasin 55134-13-9 C43H72O11 765.03
8 克拉珠利Clazuril 101831-36-1 C17H10Cl2N4O2 373.19
9 氯苯胍Robenidine·HCl 500-92-5 C15H13Cl2N5·HCl 370.66
10 氯羟吡啶Clopidol 2971-90-6 C7H7Cl2NO 192.04
11 拉沙洛西Lasalocid 25999-31-9 C34H53NaO8 590.78
12 马度米星铵
Maduramicin
ammonium
84878-61-5 C47H83NO17 934.16
13 莫能菌素钠Monensin sodium 22373-78-0 C36H61O11·Na 692.85
14
尼卡巴嗪标
志物（4,4'-二
硝基二苯脲）
4,4’-Dinitrocarbanil
ide
587-90-6 C13H10N4O5 302.24
15 盐霉素钠
Salinomycin
sodium salt
53003-10-4 C42H69NaO11 772.98
16
乙氧酰胺苯
甲酯
Ethopabate 59-06-3 C12H15NO4 237.25
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16种抗球虫药物的定性、定量和质谱分析参数见表A.2。
表A.2 16 种抗球虫药物的定性、定量和质谱分析参数
药物
扫描
方式
定性离子对
m/z
Q1Prerod偏差
V
碰撞能量
ev
Q3Prerod偏差
V
氨丙啉+
243.00＞150.20* -12.0 -11.0 -12.0
243.00＞93.95 -12.0 -21.0 -20.0
常山酮+
415.80＞137.95* -20.0 -17.0 -11.0
415.80＞398.10* -20.0 -13.0 -23.0
癸氧喹酯+
418.00＞372.25* -11.0 -25.0 -21.0
418.00＞204.15 -12.0 -42.0 -16.0
甲卞喹啉+
366.00＞334.25* -10.0 -21.0 -26.0
366.00＞200.90 -10.0 -31.0 -16.0
甲基盐霉素+
787.50＞431.30* -22.0 -52.0 -25.0
787.50＞531.30 -22.0 -47.0 -22.0
氯苯胍+
333.80＞155.15* -17.0 -20.0 -19.0
333.80＞111.15 -16.0 -43.0 -22.0
氯羟吡啶+
191.90＞101.15* -10.0 -26.0 -22.0
191.90＞87.10 -23.0 -31.0 -19.0
拉沙洛西+
613.10＞377.35* -30.0 -37.0 -30.0
613.10＞359.30 -30.0 -39.0 -28.0
马度米星铵+
939.10＞877.50* -26.0 -32.0 -28.0
939.10＞895.45 -26.0 -46.0 -38.0
莫能菌素+
693.10＞675.30* -20.0 -38.0 -28.0
693.10＞461.15 -34.0 -52.0 -19.0
盐霉素+
773.50＞431.25* -22.0 -50.0 -24.0
773.50＞265.20 -22.0 -54.0 -15.0
地克珠利-
405.00＞334.00* 14.0 20.0 14.0
407.00＞335.70 14.0 20.0 14.0
二硝托胺-
224.10＞181.20* 15.0 11.0 16.0
224.10＞42.10 15.0 12.0 12.0
克拉珠利-
371.00＞300.10* 13.0 18.0 12.0
371.00＞265.10 13.0 26.0 25.0
尼卡巴嗪标志物-
301.10＞136.95* 11.0 15.0 11.0
301.10＞106.90 11.0 37.0 13.0
乙氧酰胺苯甲酯-
236.20＞192.05* 16.0 24.0 16.0
236.20＞131.95 16.0 36.0 11.0
* 为定量碎片离子
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附录B
（资料性）
抗球虫药物标准溶液提取离子流图（XIC）
抗球虫药物标准溶液提取离子流图（XIC）见图B.1。
图B. 1 16 种抗球虫药物的提取离子图（XIC）
a)氨丙啉；b)甲氧喹啉；c)常山酮；d)癸氧喹酯；e)甲基盐霉素；f)拉沙洛西；g)氯苯胍；h)氯羟吡啶；i)马度米
星铵；j)莫能菌素；k)地克珠利；l)二硝托胺；m)尼卡巴嗪标志物；n)乙氧酰胺苯甲酯；o)盐霉素；p)克拉珠利