DB63/T 2549-2026 燕麦品种鉴定技术规程 SNP分子标记法
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资料介绍
ICS 65.020.01 CCS B 20
DB63
青海 省地 方标 准
DB 63/T 2549—2026
燕麦品种鉴定技术规程 SNP 分子标记法
2026-05-07 发布 2026-06-01 实施
青海省市场监督管理局发 布
DB 63/T 2549—2026
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青海省农牧业标准化技术委员会提出。
本文件由青海省农业农村厅归口。
本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、青海省饲草料技术推广站、青海省乡村产业发展指导中心、海南州农牧业综合服务中心、青海天兴草业有限公司、青海省农业农村能源与资源保护技术指导服务中心。
本文件主要起草人：王寒冬、徐金青、沈裕虎、王蕾、边海燕、杨彩凤、侯留飞、王健斌、陈同睿、李春桥、唐有林、陈永祥、曹占英、张国军、汪忠善、任阳阳。
本文件由青海省农业农村厅监督实施。
I
DB 63/T 2549—2026
燕麦品种鉴定技术规程 SNP 分子标记法
1 范围
本文件规定了燕麦品种鉴定SNP分子标记法的相关术语和定义、缩略语、技术流程、主要仪器设备及试剂、溶液配制、推荐引物、操作程序、数据记录、结果判定等技术要求。
本文件适用于燕麦品种(系)和种质资源的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 3543.2 农作物种子检验规程第2部分：扦样
GB/T 3543.4 农作物种子检验规程第4部分：播种质量发芽试验
GB 4404.1 粮食作物种子第1部分：禾谷类
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法
GB/T 34265 Sanger法测序技术指南
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
SNP 标记
基于单核苷酸多态性的分子标记。
3.2
推荐引物
用本文件进行品种(系)和种质资源鉴定时选用的一套SNP引物。
3. 3
等位变异
同源染色体同一基因位点上存在的不同等位基因形式。
3. 4
参照品种
1
DB 63/T 2549—2026
具有所用SNP位点上不同等位变异的品种。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphates)
EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)
PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
SNP：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)
Taq酶：耐热DNA聚合酶(Taq-DNA polymerase)
TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸(Tris-borate-EDTA)
TE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)
Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane THAM]
5 技术流程
燕麦品种鉴定SNP分子标记法技术流程如图1所示。
图1 燕麦品种鉴定技术流程图
2
DB 63/T 2549—2026
6 主要仪器设备及试剂
主要仪器设备及试剂见附录A，所用试剂均为分析纯。本文件使用的超纯水须符合GB/T 6682的规定。
7 溶液配制
见附录B。
8 推荐引物
见附录C。
9 操作程序
9. 1 样品准备
种子质量应符合GB 4404.1的规定。各待检品种的分样应符合GB/T 3543.2的规定。按照GB/T 3543.4的规定进行发芽，发芽的籽粒数须大于等于50粒。植株长至三叶一心时，随机抽取10株，采取叶片混样进行样品制备。
9.2 DNA 样品制备
按照GB/T 19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。 试验样品DNA纯度、浓度测试应符合GB/T 30988的规定。
9.3 PCR 扩增
9.3.1 反应体系
将附录C中各组推荐引物分别稀释至10 µmol/L，DNA浓度稀释至100 ng/μL~200 ng/μL。各组反应体系为25 µL，包含10×PCR反应缓冲液2 μL，2.5 mmol/LdNTPs溶液1.6 μL，10 µmol/L正向引物0.5 μL，10 µmol/L反向引物0.5 μL，Taq酶0.2 μL，超纯水18.2 μL，样品DNA 2 μL。
9.3.2 反应程序
94℃预变性4min;95℃变性30 s，53℃~61℃退火45 s，不同引物退火温度见附录C;72℃延伸1min，共30个循环;72℃下延伸10 min，4℃下保存。
9.4 扩增产物检测和测序
按照GB/T 30988中的琼脂糖凝胶电泳法进行电泳检测。将扩增产物送样至生物公司按照GB/T 34265中的方法进行测序，获得扩增产物的相应序列。
10 数据记录
将测序序列与附录D中各标记的参考序列进行比对，记录待检样品在各标记中的变异情况。
3
DB 63/T 2549—2026
11 结果判定
当样品间差异位点数大于等于2，则判定为“不同品种”;当样品间差异位点数等于1，判定为“近似品种”;当样品间差异位点数等于0，判定为“极近似品种或相同品种”。
另外，可将待检品种数据结果直接与附录E参照品种SNP碱基类型的数据进行比对，当与参照品种一致时，可以鉴定为某一品种。
4
DB 63/T 2549—2026
A
A
附录 A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
A.1 主要仪器设备
PCR扩增仪、电子恒温不锈钢水浴锅、电子天平、磁力搅拌机、高速台式离心机、高通量组织研磨仪、微量分光光度计、高压灭菌锅、酸度计、微量移液器、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。
A.2 主要试剂
乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、Taq酶、琼脂糖、溴酚蓝、硼酸、二甲苯青FF、甘油、核酸染料。
5
DB 63/T 2549—2026
B
B
附录 B
(规范性)
溶液配制
B.1 DNA提取试剂
B.1.1 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶液
称取186.1 g的EDTA-Na2·2H2O，加800 mL超纯水，充分溶解，用NaOH固体调节pH至8.0，定容至1000 mL。在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min，室温保存。
B.1.2 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液
称取121.1 g的Tris，加800 mL的超纯水，充分溶解。用浓HCl(质量分数为36%~38%)调节pH至8.0，定容至1000 mL。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。
B.1.3 CTAB提取液
依次加入CTAB 20.0 g、氯化钠81.7 g、100 mL Tris-HCl溶液(pH 8.0)(见B.1.2)和40 mL EDTA溶液(pH 8.0)(见B.1.1)，再加入超纯水，充分溶解后，用超纯水定容至1000 mL。灭菌温度和时间同B.1.1，4 ℃保存。
B.1.4 TE缓冲液
取10 mL 1 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)(见B.1.2)和2 mL 0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0)(见B.1. 1)，加入超纯水，混合均匀，定容至1000 mL。分装后灭菌，灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。
B.2 琼脂糖凝胶电泳试剂
B.2.1 5×TBE缓冲液
依次加入Tris 54.0 g，硼酸27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液(见B.1. 1)，再加入超纯水，充分溶解后，用超纯水定容至1000 mL。用时稀释为1×TBE电泳缓冲液。室温保存。
B.2.2 6×上样缓冲液
称取EDTA 8.8 g，二甲苯青FF 0.5 g，溴酚蓝0.5 g，加入360 mL甘油，调节PH至7.0，磁力搅拌充分溶解后，定容至1000 mL，4℃保存。
6
DB 63/T 2549—2026
C
C
附录 C
(规范性)
推荐引物推荐引物见表C.1
表C.1 推荐引物
引物
标记
退火温度(℃)
引物序列(5,–3,)
扩增产物长度
(bp)
GM1
GMI_ES17_c899_571
55
Forward: TCAGGTGCTTGACGACGATT
Reverse: CCCCTGCACCGAATCAATCA
185
GM2
GMI_ES22_c10988_296
53
Forward: GAGGTGGAAGGTTGGAGCTGAAC Reverse: ACAGCAAGGCATGGCATGACAG
231
GM3
GMI_ES14_c6176_603
55
Forward: AGGCACCTTGAATGGGACTG
Reverse: TTGAAAAGGCAGGGGTAGGG
569
GM4
GMI_ES_CC7903_312
55
Forward: CTTTCCGAACAACACGCAACTCAG Reverse: TGCCTCCAACTTCACAGCCATTG
201
GM5
GMI_ES01_c12759_ 163
55
Forward: CCAGCAGCCACAGCAATTTCATTC Reverse: GAAGCATCATCGGAGCACTGACC
206
GM6
GMI_ES_CC3511_395
58
Forward: GTCTTGTCACCCCTGCTGGAAAAG Reverse: GCGAGGAGACTCTCACTTTGCTTG
310
GM7
GMI_ES01_c677_223
58
Forward: CTGGCATCAAGGTGGACAAGGG Reverse: TCACATAGGCACAGCGGTCAATG
303
GM8
GMI_ES05_c15526_511
61
Forward: CATGATAGCTGGTGGAGCCG
Reverse: CCCTGTCAGCTCTTTGACCAT
288
7
D
D
附录 D
(规范性)
SNP 标记参考序列
各SNP标记参考序列见表D.1
表D.1 SNP 标记参考序列
标记
SNP
参考序列
GMI_ES17_c899_571
[T/C]
TGATAGCAACGTGATTGTGCGAAGCATCAT[T/C]GGGCAGTTGTGTGCGAAG CATGTGTGTGTG
GMI_ES22_c10988_296
[T/G]
GTGTTAAGGTTCAGAACGAAGAAATTACTA[T/G]GATGGGAGTAAGTAGGTT TTATGTTTGGGG
GMI_ES14_c6176_603
[A/G]
AGCAATGGGTTTGATACGATTCTTTTGTTG[A/G]AGCCTATCTTGAATTGTTGC CTGGTTGGTT
GMI_ES_CC7903_312
[T/C]
TGCTATCCCACCCCAATACCTTCTCGGATA[T/C]GATGCAGCAAGACTCGCTA GGGCGGCTCCA
GMI_ES01_c12759_ 163
[T/C]
CTACAGCACTGTTTATGGAAGCCCTCCCAA[T/C]AACGCTGCTACTTTTGTTG CTGTCCTTCCT
GMI_ES_CC3511_395
[T/C]
TGTGAAGCTGTTATGCAATTCTAGTTAAGG[T/C]GACATGGCGCGGTGTTTGT ATCTGGTCCAA
GMI_ES01_c677_223
[T/C]
GGACAAGGGCACCATCGAGCTCGCTGGAAC[T/C]GACAAGGAGACCACCAC CCAGGGCCATGAT
GMI_ES05_c15526_511
[T/G]
TTACAATGACTTAATGGAGCTTACTGAAGA[T/G]ATGATATCTGGTATGGTCA AAGAGCTGACA
8
E
E
附录 E
(资料性)
参照品种 SNP 碱基类型
参照品种推荐引物变异位点SNP碱基类型见表E.1
表E.1 参照品种推荐引物变异位点 SNP 碱基类型
品种名称
GM1
GM2
GM3
GM4
GM5
GM6
GM7
GM8
加燕 2 号
TT
TT
AA
TT
TT
TT
TC
TG
林纳
CC
GG
GG
CC
CC
TT
CC
TG
青海 444
TT
GG
GG
TT
TT
CC
CC
TG
青引 1 号
TT
TT
AA
CC
CC
TT
CC
GG
青引 2 号
TT
GG
GG
TT
CC
CC
CC
GG
青引 3 号
TT
GG
GG
CC
TT
CC
CC
GG
蒙燕 1 号
CC
GG
AA
CC
TT
TT
TC
TG
青海甜燕麦
CC
GG
AA
CC
TT
CC
CC
GG
白燕 2 号
TT
TT
GG
TT
CC
TT
CC
GG
巴燕 5 号
TT
GG
GG
TT
CC
CC
CC
TG
燕科 2 号
TT
TT
AA
CC
TT
TT
CC
GG
坝燕 6 号
TT
TT
AA
CC
TT
CC
CC
GG
冀张燕 3 号
TT
TT
AA
TT
CC
CC
TC
GG
白燕 14 号
CC
GG
GG
CC
CC
TT
CC
GG
冀张燕 4 号
TT
GG
AA
CC
CC
TT
TC
GG
白燕 7 号
CC
GG
AA
TT
CC
TT
CC
TG
冀张燕 5 号
CC
GG
AA
CC
CC
TT
TC
TG
定引 1 号
CC
TT
AA
CC
TT
CC
CC
TG
内燕 5 号
CC
TT
GG
CC
CC
TT
CC
TG
定燕 2 号
CC
TT
GG
TT
TT
CC
CC
TG
蒙农大 2 号
CC
GG
GG
TT
CC
TT
CC
GG
定莜 9 号
TC
TT
AA
CC
CC
TT
CC
TG
蒙农大 1 号
CC
GG
AA
TT
CC
TT
TC
TG
白燕 15 号
CC
TT
AA
CC
TT
CC
TC
GG
草莜 1 号
CC
TT
GG
CC
TT
CC
TC
GG
9
