DB63/T 2494-2026 芜菁种质资源鉴定技术规程 SSR分子标记法
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资料介绍
ICS 65.020.01 CCS B 04
备案号
DB63
青
海 省 地 方 标 准
DB63/T 2494-2026
芜菁种质资源鉴定技术规程
SSR 分子标记法
2026—01—09 发布 2026—02—10 实施
青海省市场监督管理局 发 布
DB63/T 2494-2026
目 次
前言 II
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 仪器设备及试剂 1
5 溶液配制 1
6 操作程序 2
7 数据处理 3
8 判定方法 3
附录 A (规范性) 溶液配制 4
附录 B (资料性) 推荐引物及序列信息 5
I
DB63/T 2494-2026
前 言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青海省农牧业标准化技术委员会提出。
本文件由青海省农业农村厅归口。
本文件起草单位：青海大学、青海省农林科学院、玉树藏族自治州农牧业综合服务中心。
本文件主要起草人：任延靖、李全辉、尕桑、文军琴、邵登魁。
本文件由青海省农业农村厅监督实施。
II
DB63/TXXXX-2025
芜菁种质资源鉴定技术规程
SSR 分子标记法
1 范围
本文件规定了利用简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)标记进行芜菁(Brassica rapa ssp. rapa L.)种质资源鉴定的仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序、数据处理及判定方法等内容。
本文件适用于芜菁种质资源数据的采集和资源鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 仪器设备及试剂
4.1 仪器设备
高压灭菌锅、研磨仪、干燥箱、移液器、电热恒温水槽、低温高速离心机、超纯水系统、微波炉、水平电泳槽及其制胶套件、电泳仪、制冰机、凝胶成像系统、聚合酶链式反应(PCR)仪、胶片观察灯、天平、垂直电泳槽及其制胶套件、核酸定量测定仪、超低温冰箱、涡旋混合器、磁力加热搅拌器、水平摇床等。
4.2 试剂
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、酚： 氯仿：异戊醇(25:24:1，pH=8.0)、氯仿：异戊醇(24:1)、乙醇、琼脂糖、含有染料的 2×PCR 预混液(2×PCR Mix)、SSR 引物、核酸染料、DNA 分子量标准物、丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基二乙胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、硼酸、 Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)溶液、过硫酸铵(APS)、硝酸银(AgNO3)、氢氧化钠(NaOH)、甲醛溶液(37%)，本文件所用的试剂为分析纯试剂，水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水。
5 溶液配制
溶液配制按附录 A 执行。
1
DB63/T 2494-2026
6 操作程序
6.1 样品选择
选取幼嫩、无病虫害的叶片，每份样品包含 5～9 片叶片的混合样，并设置三个重复。
6.2 DNA 样品制备
DNA 提取方法及步骤如下：
a) 选取约 0.2 g 叶片组织样本子放置于干净的、装有 2 粒直径为 6mm 灭菌钢柱的2mL 离心管中，放入液氮中速冻后，使用高通量组织研磨仪迅速研磨至粉末，时间 30 s～60 s;
b) 向离心管中加入 710 μL 65 ℃预热 1 h 的 1.5×CTAB 提取液，混匀样品粉末和提取液;将离心管放入 65 ℃烘箱或水浴锅中温浴 30 min，中间每间隔 5 min 轻摇一次;
c) 取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合物，轻摇 10 min 充分混匀， 10000 r/min 4 ℃离心 10 min;
d) 取上层液相 650 μL 转移于无菌的 1.5 mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻摇 10 min 充分萃取杂质，12000 r/min 室温离心 10 min;
e) 取上清液 500 μL，加入 2 倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，-20 ℃条件下沉淀 30 min，4 ℃条件下 6000 r/min 离心 2 min;
f) 保留沉淀后晾干，充分溶解至超纯水中，检测 OD260 和 OD280。
注：以上为推荐的DNA提取方法，DNA质量能满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件。DNA溶液的紫外吸光度OD260与OD280的比值宜介于1.7～2.0。
6.3 PCR 扩增
6.3.1 引物选择
扩增引物见附录 B。
6.3.2 反应体系
PCR 反应体系为 20.00 μL，包括 200 ng/μL DNA 模板 1.00 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.80 μL， 2×PCR Mix 10.0 μL，用超纯水补足至 20.0 μL，可依据试验条件调整。
6.3.3 PCR 扩增程序
PCR 扩增程序：95 ℃预变性 5min;94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，重复 35 个循环;72 ℃延伸 10min;4 ℃保存。反应程序中各反应参数可根据 PCR 扩增仪型号、酶、引物等不同而作适当的调整。
6.4 产物检测
6.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6.4.1.1 凝胶准备
取一套玻璃板(一块光滑的和一块带磨砂边条的)，冲洗干净，晾干，固定在配套的橡皮条上。用完全溶解的 1.0%琼脂糖凝胶封底，静置晾干凝胶，制成铸胶槽。在 100 mL 小烧杯中依次加入 30%的丙烯酰胺溶液 7.5 mL、5×TBE 溶液 5.0 mL、10% APS 250 μL、补超纯水至 25 mL、TEMED 25 μL，混匀后注
2
DB63/TXXXX-2025
满铸胶槽，轻敲玻璃板，防止气泡产生，插入 42 孔或 50 孔样孔梳至 2/3 处，室温下静置直至凝胶完全聚合后使用。溶液体积可根据胶板的大小、胶槽的尺寸做适当的调整。
6.4.1.2 电泳
将含有样孔梳的玻璃板固定在垂直电泳槽上并拧紧，光滑的玻璃板向内，注入 1×TBE 缓冲液，外槽电泳液没过梳孔，内侧电泳液约 2cm～3cm 高。垂直向上拔掉梳子，清除点样孔余胶，接通电源，预电泳至阴极铂丝上有气泡生成。暂停电源，用移液器取 1.5 μL DNA 分子量标准物点入点样孔中，再取1.5 μL PCR 扩增产物点入其他点样孔中。设置电压 220 V，电流 60 mA/板，电泳约 1.5 h，待二甲苯氰迁移至胶底部，停止电泳。
6.4.1.3 银染显色
将电泳完毕的玻璃板从胶槽中卸出，在水中将凝胶从玻璃板上剥离下来。将剥离下来的凝胶放入盛有蒸馏水的盘子里，漂洗 2～3 次。将胶转入染色液中震荡染色8min～10min。将染色结束的凝胶转入蒸馏水中漂洗 2～3 次。将冲洗完毕的凝胶转入显色液中显色至条带清楚显示，用蒸馏水冲洗胶片 2～3次，沥干后扫描或拍摄成像。
注：染色液、显色液、蒸馏水的用量，以淹没凝胶为准。
7 数据处理
根据扩增产物的电泳结果，在相同迁移位置处，选择 100 bp～300bp 之间、清晰条带记为“1”，无条带的记为“0”，从而形成0-1矩阵，数据模式见图 1。
材料 1 材料 2 材料 1 材料 2
3
SSRX-1
SSRX-2
SSRX-3
SSRX-4
SSRY-1
SSRY-2
SSRY-3
图1 材料 PCR 扩增带型数据模式图
注：标记SSRX在所有材料中共扩增出4条大小不同的条带，按照条带从大到小依次编号为SSRX-1、SSRX-2、SSRX-3、 SSRX-4;标记SSRY在所有材料中共扩增出3条大小不同的条带，按照条带从大到小依次编号为SSRY-1、SSRY-2、 SSRY-3;若材料1显示的条带为SSRX-1、SSRX-3、SSRY-4、SSRY-1、SSRY-3，则其带型数据为1011101，若材料2显示的条带为SSRX-1、SSRX-2、SSRY-2、SSRY-3，则其带型数据为1100011，同样可给出其它参试材料的带型数据。由此，可建立每份材料的数字化指纹，每一数字对应一个扩增条带或位点。
8 判定方法
按照由带型数据赋予的数字化指纹，可单独或联合使用的标记鉴定材料的异同，具体如下：
a)当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”;
b)当样品间差异位点数=1，判定为“高度相似”;
c)当样品间差异位点数=0，判定为“极近似或相同”。
DB63/T 2494-2026
附 录 A (规范性)溶液配制
A.1 DNA提取溶液的配制
称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)15.0 g、氯化钠(NaCl)81.816 g、二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 ·2H20)7.444 g、三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.114 g 于 1000mL 烧杯中，加入 800mL 超纯水溶解，调整 pH 为 8.0，转移至 1000 mL 容量瓶中，用超纯水定容至 1000 mL，在 103.4 kPa(121 ℃)条件下灭菌 20 min。
A.2 PCR扩增所需的SSR引物的配制
用超纯水配制浓度为 10 μmol/L 的 SSR 引物工作液。
A.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制
A.3.1 30%丙烯酰胺溶液
分别称取丙烯酰胺 300.0 g 和甲叉双丙烯酰胺 20.0 g 于 1000 mL 烧杯中，加入 500 mL 超纯水溶解，后转移至容量瓶中定容至 1000 mL，避光保存。
A.3.2 TBE缓冲液
A.3.2.1 5×TBE缓冲液
称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)54.0 g 和硼酸 27.5 g 于 1000 mL 烧杯中，加入 20 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液，加入 800mL 超纯水溶解，调整 pH 为8.0，转移至 1000mL 容量瓶中，用超纯水定容至 1000 mL。
A.3.2.2 1 ×TBE缓冲液
量取 5×TBE 缓冲液 200 mL 于 1000 mL 容量瓶中，用超纯水定容至 1000 mL。
A.3.3 10%过硫酸铵溶液
称取 10.0 g 过硫酸铵，溶于 100 mL 超纯水中，避光保存。
A.4 银染溶液的配制
A.4.1 染色液
称取 1.0g 硝酸银于 1000mL 烧杯中，加800mL 超纯水溶解，转移至 1000mL 容量瓶中，定容至 1000 mL，避光保存。
A.4.2 显色液
称取 10.0 g 氢氧化钠于 1000mL 烧杯中，加入 800mL 超纯水溶解，量取 5mL 甲醛，转移至 1000mL容量瓶中定容至 1000 mL。
4
DB63/TXXXX-2025
附 录 B
(资料性)
推荐引物及序列信息
引物系根据芜菁种质资源 W21 和 W25 转录组数据开发，并采用设计的 30 对引物对 50 份芜菁种质资源进行测试，组合运用一些引物可将参试材料完全区分。为此，选择 14 对扩增条带清晰、多态性信息含量大于 0.50 的引物作为芜菁种质资源鉴定的推荐引物。推荐引物及序列信息见表 B.1。
表B.1 推荐引物及序列信息
序号
引物名称
正向引物序列(5 ’-3’)
反向引物序列(5 ’-3’)
退火温度
1
Cluster-30924.171259
F：TGTGAACCCAAGCTCCGTAC
R：GCCGTCTTCATCACATTCGC
60℃
2
Cluster-30924.151200
F：AAGGAGGCTGCAAGAGTGAC
R：CCAGTGGGTGTCTCAGGTTC
60℃
3
Cluster-30924.41968
F：CGCAGTTGGTTGTCACACAG
R：CGTCTCACTCGGTGTTCCAA
60℃
4
Cluster-30924.28557
F：TCTTCATGCGGCTTCCTCTG
R：AGCAAAGCTCCCATCAGACC
60℃
5
Cluster-30924.164312
F：GGAGACTGAGGGGATGAGGT
R：AGAAATCGGACCCGGGTTTC
60℃
6
Cluster-9993.0
F：GCGAGTCAGGCCTAAAGGTT
R：TCAATTTCCCTGGCGTCTCC
60℃
7
Cluster-30924.71367
F：GCTGTCGGTGGTGTTCAAAC
R：TAACAGGGACCGGCAAAGAC
60℃
8
Cluster-30924.76636
F：AGAGATGGCTGTGTTGGTGG
R：ATGAGCGTCTTCCTCCTCCT
60℃
9
Cluster-30924.60140
F：AGGTGGGGATAAGCACAAGC
R：GTTCTCCACTGCCTCTGTCC
60℃
10
Cluster-27140.0
F：GACTGATGAGATGCCTCGGG
R：CCGGAGATCCAATGTACCCG
60℃
11
Cluster-30924.54426
F：CTGCTTCTCCTCTTGCACCA
R：TGTCGGAGGAGCTGAAACAC
60℃
12
Cluster-30924.126255
F：TGATGATGATGGCTGGGCTG
R：GCGCTAGGCTTTGCTTTTGT
60℃
13
Cluster-30924.138446
F：TCCGTTTGAACCACACCCAA
R：TAACAGCAACCTCGTTGGCT
60℃
14
Cluster-30924.144894
F：CGGAGCGGATGCAAGACTAT
R：TCCCTCAGGACCAAAAGTGC
60℃
━━━━━━━━━━━
5
