SN/T 5729-2025 出口水产品中胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的测定 液相色谱-质谱 质谱法

　　ICS 67.050 CCS 53

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/ T 5729—2025

　　出口水产品中胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法

　　Determination of bile acid ，deoxycholic acid and dehydrocholic acid contents

　　inaquatic product for export —

　　HPLC-MS/MS method

　　2025-12-11发布 2026-07-01实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　SN/T 5729—2025

　　前 言

　　本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中华人民共和国上海海关、广州海关技术中心、青岛海关技术中心。

　　本文件主要起草人：曹晨、郭德华、席静、张晓梅、俞珉颉、张庶冉、王敏、邓晓军。

　　I

　　SN/T 5729—2025

　　出口水产品中胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的测定

　　液相色谱-质谱/质谱法

　　1 范围

　　本文件规定了出口水产品中胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的测定方法。

　　本文件适用于鱼、虾中胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的检测和确证。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 方法提要

　　样品用乙腈提取，经HLB 固相萃取柱净化，经色谱柱分离，以水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，采用液相色谱-质谱/质谱法检测，以电喷雾负离子(ESI- )模式电离，多反应监测(MRM)模式检测，同位素内标法定量。

　　5 试剂和材料

　　除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

　　5.1 乙腈：色谱纯。

　　5.2 正己烷：色谱纯。

　　5.3 甲醇：色谱纯。

　　5.4 标准品

　　5.4.1 胆酸(纯度99.2%)。

　　5.4.2 脱氧胆酸标准品(纯度99.5%)。

　　5.4.2 脱氢胆酸标准品(纯度99.0%)。

　　5.4.3 胆酸-D4 同位素内标(纯度99.5%)。

　　5.4.4 脱氧胆酸-D4 同位素内标(纯度99.0%)。

　　1

　　SN/T 5729—2025

　　5.5 标准溶液配制

　　5.5.1 混合标准储备液：称取适量胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸标准品用甲醇溶解配制成 10mg/L 的混合标准储备溶液，-18℃冷冻避光保存。

　　5.5.2 混合标准工作液：准确吸取 1mL标准储备(5.5.1)溶液于 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成浓度为 1mg/L标准中间溶液，4℃冷藏保存。

　　5.5.3 混合内标储备溶液：称取适量胆酸-D4、脱氧胆酸-D4 标准品用甲醇溶解配制成 10mg/L 的混合内标标准储备溶液，将上述标准储备溶液用甲醇稀释成浓度为 10mg/L 内标标准工作溶液。

　　5.5.4 混合内标工作液：准确吸取 1mL标准储备溶液(5.5.3)于 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成浓度为 1mg/L标准工作溶液，4℃冷藏保存。

　　5.5.5 标准曲线配制：分别吸取混合标准工作溶液(5.5.2)10μL、25μL、50μL、100μL、500μL，内标工作液(5.5.4)100μL，甲醇定容到 1.0mL，得到系列标准溶液，浓度为 10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、 100 ng/mL、500ng/mL，内标浓度 100ng/mL。

　　5.6 HLB 固相萃取柱(亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮)：200mg，6mL或相当。使用前依次用6mL 甲醇，6mL水活化。

　　6 仪器和设备

　　6.1 高效液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子(ESI)源。

　　6.2 分析天平：感量为0.01 mg和0.01 g。

　　6.3 恒温水浴超声机。

　　6.4 离心机：小于4 500r/min。

　　6.5 氮吹仪。

　　6.6 均质机。

　　6.7 旋转蒸发仪。

　　6.8 微孔滤膜：0.22μm，尼龙针式过滤膜。

　　7 分析步骤

　　7.1 样品制备

　　取鱼、虾的可食用部分作为代表性样品，经高速组织均质机均匀捣碎，用四分法分出适量试样，均分成两份，分别装入清洁容器内备用。一份作为试样，一份作为留样，于-20℃保存。

　　7.2 提取

　　称取试样5g(精确至0.01g)于50 mL离心管中，加入混合内标工作液(5.5.4)100μL，加入20mL 乙腈(5.1)，混匀后超声提取 10min，于4℃下4 500r/min离心5min，取上层清液。残渣中加入20mL 乙腈(5.1)重复提取一次，于4℃下4 500r/min离心5min，取上层清液，合并提取液于旋蒸瓶中，40℃旋蒸至干。用5mL 50% 甲醇水溶液溶解残渣，加入5mL正己烷混匀，4 000r/min离心5min后，弃掉正己烷层，待净化。

　　7.3 净化

　　HLB 固相萃取柱活化后，将待净化液上样，用3mL水溶液淋洗，抽干小柱后，用3mL 甲醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液40℃下氮吹至干，用 1mL 50%(体积分数)甲醇水溶液溶解残渣，待测液过0.45μm滤膜上机测定。

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　　8 高效液相色谱-质谱法测定

　　8.1 色谱参考条件

　　色谱参考条件如下：

　　a) 色谱柱：C18 色谱柱，50 mm ×2.1 mm，粒径 1.7μm，或性能相当者;

　　b) 柱温：室温;

　　c) 流动相A：水;流动相B：甲醇;梯度洗脱条件见表 1;

　　d) 流速：0.5mL/min;

　　e) 进样量：2 μL。

　　表 1 梯度洗脱条件

　　时间min

　　流动相A：水 %

　　流动相B：甲醇 %

　　0

　　90

　　10

　　2.0

　　10

　　90

　　4.0

　　10

　　90

　　4.1

　　90

　　10

　　5.0

　　90

　　10

　　8.2 质谱参考条件

　　色谱参考条件如下。

　　a) 电离方式：电喷雾电离，负离子。

　　b) 扫描方式：多反应监测(MRM)。

　　c) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体;使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件见附录A 中表A.1。

　　d) 电喷雾电压：-3 000V。

　　e) 锥孔电压：30V。

　　f) 去溶剂气温度：500 ℃。

　　g) 去溶剂气流速：600 L/h。

　　8.3 定性测定

　　被测组份选择 1个母离子，2个子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准工作液中对应的保留时间偏差在 ±2.5%之内;定性离子对的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2 的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。

　　表2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

　　相对离子丰度/%

　　>50

　　>20~50

　　>10~20

　　≤ 10

　　允许的相对偏差/%

　　±20

　　±25

　　±30

　　±50

　　8.4 定量测定

　　取试样溶液和相应的标准溶液，以色谱峰面积定量，按内标法计算，标准溶液及试样溶液中的被

　　3

　　SN/T 5729—2025

　　测化合物响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述液相色谱-质谱/质谱条件下，被测物的保留时间色谱-质谱/质谱图见附录B 中图B.1~ 图B.3。

　　8.5 空白试验

　　除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

　　8.6 结果计算和表述

　　试样中的被测物含量用LC-MS/MS 的数据处理软件或按公式(1)计算。

　　A ×mi

　　X= ……………………………(1)

　　Ai ×R ×m

　　式中：

　　X ——试样中待测物的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

　　A ——实测样品中待测物的峰面积;

　　Ai ——实测样品中同位素内标物的峰面积;

　　m ——样品的质量，单位为克(kg);

　　mi ——实测样液中内标物的量，单位为克(mg);

　　R ——待测物与其同位素内标的相对校正因子。

　　计算结果需扣除空白值。

　　9 定量限、回收率

　　9.1 定量限

　　本标准对于胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸的定量限均为0.01mg/kg。

　　9.2 回收率

　　胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸在0.01mg/kg～0.1 mg/kg范围内，回收率84.4%～ 115.3%，相对标准偏差为2.6%～ 13.3%，符合残留检测的要求。

　　4

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　质谱参考条件

　　质谱参考条件见表A.1。

　　表A.1 化合物的母离子，子离子，碎裂电压和碰撞能量

　　化合物

　　CAS号

　　RT

　　min

　　母离子(Q1)

　　子离子(Q3)

　　碎裂电压V

　　碰撞能量eV

　　胆酸

　　81-25-4

　　2.42

　　406.7

　　343.0a

　　90

　　32

　　289.0

　　36

　　脱氧胆酸

　　83-44-3

　　2.52

　　390.7

　　343.0a

　　88

　　36

　　327.0

　　36

　　脱氢胆酸

　　81-23-2

　　2.15

　　400.7

　　330.9a

　　84

　　24

　　248.9

　　32

　　胆酸- D4

　　116380-66-6

　　2.42

　　410.7

　　346.9a

　　98

　　34

　　脱氧胆酸- D4

　　112076-61-6

　　2.52

　　394.7

　　330.1a

　　92

　　34

　　a 定量离子。

　　5

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　多反应监测色谱图

　　多反应监测色谱图见图B.1~ 图B.3。

　　t/min

　　a)

　　t/min

　　b)

　　t/min

　　c)

　　图B.1 胆酸及胆酸-D4 标准溶液(0.01 mg/L)的多反应监测色谱图

　　6

　　SN/T 5729—2025

　　a)

　　b)

　　

　　t/min

　　t/min

　　t/min

　　c)

　　图B.2 脱氧胆酸及脱氧胆酸-D4 标准溶液(0.01 mg/L)的多反应监测色谱图

　　t/min

　　a)

　　t/min

　　b)

　　图B.3 脱氢胆酸标准溶液(0.01 mg/L)的多反应监测色谱图

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