GB/T 36822-2018 瓜类果斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36822—2018

　　瓜类果斑病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofAcidovoraxcitrulli

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36822—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、深圳市检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中国农业科学院植物保护研究所、国家瓜类工程技术研究中心、江苏省植物保护植物检疫站。

　　本标准主要起草人：赵文军、冯建军、田茜、田艳丽、张祥林、赵廷昌、胡白石、龚伟荣。

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　　瓜类果斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了瓜类果斑病菌的症状观察、分离培养、免疫学及分子生物学检测方法。

　　本标准适用于可能带有瓜类果斑病菌的西瓜、甜瓜等葫芦科作物植株及种子的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T1465 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法

　　3 瓜类果斑病菌基本信息

　　学名：Acido℃oraxcitrulli(Schaad et al.) Schaad et al. , 2008

　　异名：Acido℃oraxa℃enae subsp.citrulli(Schaad et al. , 1978) Willems et al. , 1992

　　pseudomonasa℃enae subsp.citrulli(Schaad et al. , 1978) Hu et al. , 1991

　　pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli Schaad et al. , 1978

　　传播途径：主要通过带菌种子进行远距离传播，田间扩散主要依靠雨水、农事操作和昆虫传播。

　　瓜类果斑病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据瓜类果斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养;根据瓜类果斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测;根据瓜类果斑病菌的特异性 DNA 序列进行分子生物学检测。

　　5 仪器设备

　　5. 1 PCR仪：温度范围 4 ℃ ~99 ℃ , 控温精度 ±0.25 ℃。

　　5.2 实时荧光 PCR仪：温度范围 4 ℃ ~99 ℃ , 控温精度 ±0.25 ℃。

　　5.3 电泳仪：输出电压 5 V~600 V,输出电流 2 mA~200 mA。

　　5 . 4 杂交炉：温度范围室温至 99 . 9 ℃ , 控温精度 ±0 . 1 ℃ 。

　　5 . 5 凝胶成像分析仪：光强连续可调 302 nm 紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV 干涉滤光片、机载头像捕捉软件、图像分析软件。

　　5 . 6 显微镜：目镜放大倍数 10,物镜放大倍数 100 。

　　5 . 7 高速冷冻离心机：最大转速 15 000 r/ min。

　　5 . 8 恒温培养箱：温度范围 5 ℃ ~65 ℃ , 波动度 ±0 . 5 ℃ 。

　　5.9 超净工作台：高效滤膜可除去 99 . 99%以上的 0 . 3 μL粒子。

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　　5. 10 灭菌锅：最大压力为 0.235 MPa,可调控温度范围为 105 ℃ ~135 ℃。

　　5 . 1 1 台式小型离心机：最大转速 7 000 r/ min。

　　5. 12 超低温冰箱：-80 ℃。

　　5 . 13 常规冰箱：4 ℃ 。

　　5 . 14 小型电动粉碎机：电机转速 20 000 r/ min。

　　5. 15 全钢大号指甲钳：10 cm×1.5 cm。

　　5 . 16 旋涡振荡器：最大转速为 2 800 r/ min。

　　5. 17 微量进样器：2.5 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL。

　　6 主要试剂

　　6. 1 75%乙醇。

　　6 . 2 1%次氯酸钠。

　　6 . 3 生理盐水。

　　6.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液：氯化钠(NaCl) 7.9 g, 氯化钾(KCl)0.2 g, 磷酸氢二钠(Na2 HPO4) 1.44 g,磷酸二氢钾(KH 2 PO4)0 . 24 g,溶于 800 mL 蒸馏水中，用盐酸(HCl) 或氢氧化钠(NaOH)调节溶液的pH 至 7 . 0,最后加蒸馏水定容至 1 L。

　　6 . 5 PCR凝胶电泳检测试剂见附录 B。

　　6 . 6 实时荧光 PCR检测试剂见附录 C。

　　6 . 7 锁式探针检测试剂见附录 D。

　　6 . 8 NA、KB、EBBA及 TWZ培养基配方见附录 E。

　　7 田间观察检测

　　7 . 1 症状观察

　　对于植株样品，参照附录 A 中的症状描述观察有无瓜类果斑病的典型症状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样。

　　7 . 2 现场检测

　　利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测，按照说明书进行操作及结果判定。

　　8 实验室检测鉴定

　　8 . 1 样品制备

　　8 . 1 . 1 植株样品

　　对于有症状植株，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜的病健交界处组织(对于无症状样品，随机选取植物组织)，切成 0 . 5 cm×0 . 5 cm 左右的小块，用 75%的乙醇(或 1%的次氯酸钠)进行表面消毒，晾干，放入装有 1 mL 无菌水的 2 mL 离心管中，用灭菌玻棒捣碎，制成悬浮液，1 000 r/min离心 1 min,弃去沉淀，上清液转入另一干净的 2 mL 离心管中。 可将 2 份 ~ 3 份同一样品的悬浮液合并成一管，最终制成 1 mL~2 mL 悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。

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　　8 . 1 . 2 种子样品

　　对于种子样品，根据实验室条件，可利用种植观察法，亦可直接进行免疫学或分子生物学检测。

　　种子样品制备：随机抽取待检瓜种 300 g左右，平均分成 3 份 ~5 份，将种子剥开(如利用灭菌的大号指甲钳刀)，或用微型粉碎机轻微破碎(至 2/3 以上种子破碎)，加入适量 pH 7 . 0 的 0 . 01 mol/L磷酸缓冲液 或 生 理 盐 水，使 种 子 完 全 浸 没，室 温 振 荡 4 h ( 100 r/ min 左 右)，4 ℃ 浸 泡 过 夜。 将 浸 泡 液 1 000 r/min 离心 1 min,去沉淀，上清液 10 000 r/min离心 10 min,弃上清液，取沉淀。用无菌水悬浮，制成 1 mL~2 mL样品悬浮液，用于分离培养、免疫学检测以及分子生物学检测。

　　8 . 2 种植观察

　　种植观察法：取 30 000 粒 ~ 50 000 粒种子，或根据实际情况取适量种子，于 24 ℃ ~ 35 ℃(最适 29 ℃),相对湿度 70%以上，种植 18 d,观察症状。 若观察到疑似症状，初步判定为阳性，再用免疫学、分子生物学方法或分离培养方法检测。

　　8 . 3 免疫学检测

　　利用商品化 ELISA检测试剂盒进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。

　　8 . 4 分子生物学检测

　　8 . 4 . 1 模板制备

　　植物样品及种子样品制备的悬浮液提取 DNA 后(可按 CTAB 方法提取，也可使用商品化的 DNA提取试剂盒提取，提取核酸 -20 ℃保存)用于分子生物学检测。

　　8.4.2 PCR凝胶电泳检测

　　对于种子，以健康的瓜种子和带果斑病菌的瓜种子洗涤液作为阴性对照和阳性对照。 对于植株样品，以已知感染瓜类果斑病的植物病组织或标准菌株做阳性对照，用健康植物组织做阴性对照，用双蒸水代替模板作为空白对照进行 PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录 B。

　　8 . 4 . 3 实时荧光 PCR检测

　　检测步骤见附录 C,对照设置见 8 . 4 . 2 。

　　8 . 4 . 4 锁式探针技术检测

　　检测步骤见附录 D,对照设置见 8 . 4 . 2 。

　　8 . 5 分离培养鉴定

　　用灭菌接种环蘸取 8 . 1 方法制备的样品悬浮液在半选择性培养基 EBBA 或 TWZ 上划线分离，同时，将悬浮液进行 10×梯度稀释 3 次，各取 100 μL稀释液涂布培养皿，重复 3 次，28 ℃恒温培养 48 h,挑取疑似菌落进行转接纯化，菌落形态特征参见附录 A,再采用 8 . 3 或 8 . 4 方法进一步鉴定。

　　9 结果判定

　　9 . 1 植株样品

　　对于有典型症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出瓜类果斑病菌。 无

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　　症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果阳性，分离培养鉴定为阳性，判定检出瓜类果斑病菌。 其中，分子生物学检测可根据实验窒条件，选择 8 . 4 . 2、8 . 4 . 3 或 8 . 4 . 4 中的任意一种进行检测，任意一种检测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性。

　　9 . 2 种子样品

　　种子经种植观察有症状，且免疫学或分子生物学结果为阳性，即可判定该种子样品检出具有活性的瓜类果斑病菌。

　　对于种子样品的直接检测，免疫学或分子生物学检测为阳性，初步判定为检出瓜类果斑病菌，若分离培养鉴定为阳性，确定种子样品检出具有活性的瓜类果斑病菌。

　　其中，分子生物学检测可根据实验窒条件，选择 8 . 4 . 2、8 . 4 . 3 或 8 . 4 . 4 中的任意一种进行检测，任意一种检测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性。

　　10 样品及检测结果保存

　　10 . 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存。 对检出瓜类果斑病菌的样品应妥善保存，以备复核。 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。

　　10 . 2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为瓜类果斑病菌的菌株，应妥善保存。 可采用甘油保存或冻干保存。 对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。

　　10 . 3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员的签字。 现场检疫发现的可疑症状等应及时拍照保存，PCR 凝胶电泳检测需有电泳结果照片，分子生物学检测方法需有原始实验数据及相关结果图片。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　瓜类果斑病菌其他信息

　　A.1 名称与分类地位

　　中文名称：瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌、西瓜细菌性果腐病菌

　　英文名称：bacterial fruit blotch

　　英文缩写：BFB

　　分类地位：细菌域 Bacteria, 变形菌门 Proteobacteria,β-变形菌纲 Betaproteobacteria, 伯克氏菌 目Burkholderiales,丛毛单胞菌科 Comamonadaceae, 嗜酸菌属 Acido℃orax，西瓜种 Acido℃oraxcitrulli。

　　A.2 植株症状

　　西瓜、甜瓜在整个生育期均可被瓜类果斑病菌侵染，主要在子叶、真叶和果实上显症。 子叶张开时，病叶背面出现水浸状，沿叶脉逐渐发展成黑褐色坏死斑，随后侵染真叶，水浸状斑周围逐渐形成黄色晕圈，病斑沿叶脉发展成暗棕色角斑或不规则大斑。 植株生长中期，田间湿度大，叶背面病斑处可见水浸状，严重时叶正面也会出现不明显的褐色小病斑，对整株直接影响不大。 苗期、生长期发病症状参见图 A. 1 及图 A. 2 。

　　图 A.1 苗期发病症状

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　　图 A.2 田间植株发病症状

　　A.3 果实症状

　　果实感病后，最初果皮上出现直径仅几毫米的水浸状斑点，随后迅速扩展呈暗绿色或褐色不规则边缘的病斑。 病原菌可透过果皮进入果肉，有时呈孔洞状，果实腐烂，有的病斑表皮龟裂，常溢出黏稠、透明、琥珀色菌脓，严重时果实很快腐烂，并使种子带菌。 西瓜果实发病症状参见图 A. 3,甜瓜果实参见图 A. 4,籽瓜果实症状参见图 A. 5 。

　　图 A.3 西瓜果实发病症状

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　　图 A.4 甜瓜果实发病症状

　　图 A.5 籽瓜果实发病症状

　　A.4 寄主范围

　　主要危害西瓜(citrulluslanatus)、甜瓜(cucumismelo)以及黄瓜(cucumissati℃us)、南瓜(cucur- bitamoschata)、葫芦(cucurbitapepo)等多种葫芦科植物。

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　　A.5 分布

　　亚洲：中国(河北、内蒙古、辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖南、广西、甘肃、宁夏、新疆、台湾)、印度尼西亚、伊朗、以色列、日本(本州)、韩国、马来西亚(沙捞越)、泰国、土耳其。

　　北美洲：加拿大(安大略省)、美国(阿拉巴马州、阿肯色州、加利福尼亚州、特拉华州、佛罗里达州、佐治亚州、伊利诺斯州、印第安那州、爱荷华州、马里兰州、密西西比州、密苏里州、北卡罗来那州、俄克拉荷马州、俄勒冈州、南卡罗来那州、德克萨斯州)。

　　中美洲及加勒比海地区：哥斯达黎加、尼加拉瓜。

　　南美洲：巴西(塞阿拉州、米纳斯吉拉斯、伯南布哥州、北里奥格兰德州、南里奥格兰德州、罗赖马州)。

　　欧洲：希腊、匈牙利、意大利、荷兰。

　　大洋洲：澳大利亚(昆士兰州)、北马里亚纳群岛、关岛。

　　A.6 病原菌形态及培养性状

　　瓜类果斑病菌为革兰氏阴性菌，菌体短杆状，大小(0 . 2 μm~0 . 8 μm) × (1 . 0 μm~5 . 0 μm),严格好

　　氧，极生单根鞭毛。

　　在 KB培养基上形成不透明、圆形、光滑、略有扇形扩展的边缘和突起的菌落，28 ℃培养 2 d~3 d菌落直径可达 1 mm~2 mm,不产生荧光。 在 YDC培养基上菌落呈黄褐色、凸起并边缘扩展为圆形的菌落，28 ℃培养 5 d直径可达 2 mm~3 mm。 在 EBBA培养基中 37 ℃黑暗培养 5 d,其菌落直径约为1 . 5 mm~ 2 . 0 mm, 微凸起、带有透明边缘的轻微扩展，菌落颜色呈绿色至蓝绿色。 在 TWZ 培养基28 ℃ 培养 24 h 以上产生深红色、光滑、球形凸起的菌落。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　PCR凝胶电泳检测

　　B.1 引物序列

　　BX-L1/BX-S-R2 :

　　BX-L1 : 5′-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3′;

　　BX-S-R2 : 5′-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3′。

　　SEQID4/ SEQID5 :

　　SEQID4 : 5′-GTCATTACTGAATTTCAACA-3′;

　　SEQID5 : 5′-CCTCCACCAACCAATACGCT-3′。

　　B.2 PCR反应体系

　　25 μL反应体系，PCR Premix 12.5 μL, H2 O 9.5 μL, DNA模板 1 μL, 20 μmol/L 引物各 1 μL。

　　B.3 PCR反应程序

　　BX-L1/BX-S-R2 :

　　94 ℃ /5 min; 94 ℃ /30 s, 68.1 ℃ /30 s, 72 ℃ 30 s, 35 个循环;72 ℃ /8 min; 4 ℃保存。

　　SEQID4/ SEQID5 :

　　95 ℃ /5 min; 95 ℃ /30 s, 53 ℃ /30 s, 72 ℃ /30 s, 35 个循环;72 ℃ /5 min; 4 ℃保存。

　　不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。

　　B.4 琼脂糖凝胶电泳

　　PCR产物用 1 . 5%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观察、拍照。 BX-L1/BX-S-R2 引物对扩增片段大小为 279 bp。SEQID4/SEQID5 引物对扩增片段大小为 246 bp。

　　B.5 结果判定

　　阳性对照在预期大小位置产生明显条带，阴性对照及空白对照在预期大小位置未产生条带，若样品出现与阳性对照大小一致条带，判定为阳性，否则为阴性。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　实时荧光 PCR检测

　　C.1 引物及探针序列

　　AC-FP: 5′-CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3′。

　　AC-RP: 5′-TGAGCGCATTTCTGACGAG-3′。

　　AC-P: 5′(FAM)-AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-(BHQ1)-3′。

　　C.2 实时荧光 PCR反应组分及条件

　　25 μL反应体系：荧光 PCR premix 12.5 μL, 引物 AC-FP(10 μmol/L) 1 μL, 引物 AC-RP(10 μmol/L) 1 μL,TaqMan 探针 AC-P(10 μmol/L)0.5 μL,模板 1 μL,补充超纯水至 25 μL。

　　C.3 PCR反应程序

　　第一个循环为 95 ℃ 10 min;随后 40 个循环，94 ℃ 15 s, 58 ℃ 1 min。

　　C.4 结果判定

　　在阳性对照 Ct值≤34, 阴性对照和空白对照的 Ct值 ≥40 前提下：

　　如果检测样品的 Ct值≤35 时，则判定为阳性;

　　如果检测样品的 Ct值 ≥40 时，则判定为阴性;

　　如果 35

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　锁式探针技术检测

　　D.1 用于检测瓜类果斑病菌的锁式探针序列

　　5 -CCGGCGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGT- ACCGCTATCGTCCTTACGCTAGGTCGAGAGTTCAAATTTTTGTCA-3′。

　　D.2 锁式探针检测步骤

　　D.2 . 1 探针的连接与外切酶处理

　　首先将锁式探针和待测 目标 DNA进行杂交，在 Taq DNA 连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的 DNA序列互补而结合，探针的 5′末端和 3′末端连成环状。 采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。

　　连接反应液：20 mmol/L Tris-HCl, pH 9.0 , 25 mmol/L KAc, 10 mmol/L Mg(Ac)2 , 10 mmol/L DTT, 1 mmol/L NAD, 0.1% Triton X-100 ,2.4 U Taq DNA连接酶，1 μL待测 DNA模版，100 pmol/L探针 P-a.a.c。

　　连接反应程序：95 ℃预变性 5 min;然后进入循环，95 ℃变性 30 s, 65 ℃连接 5 min, 反应共进行20 个循环;然后 95 ℃灭活 15 min。

　　采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入 2 U 的核酸外切酶 Ⅰ 和 2 U 的核酸外切酶Ⅲ , 37 ℃反应 0 . 5 h,然后将反应后的产物 95 ℃灭活 0 . 5 h。

　　D.2 . 2 探针的扩增

　　采 用 引 物 P1-F ( 5′-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3′) 和 P2-R ( 5′-TCATGCTGCTAACG- GTCGAG-3′)对连接产物进行 PCR扩增。

　　扩增反应液：0.5 μmol/L P1-F 和 P2-R, 4 种 dNTP 各 50 μmol/L, 2.5 μL 10 × PCR 反应缓冲液， 2 mmol/L Mg2+ ,2.5 μL 1% BSA, 1.25 U Taq DNA 聚合酶，3 μL经核酸外切酶处理后的连接产物。

　　扩增反应程序：94 ℃预变性 5 min;然后进入循环，94 ℃变性 15 s, 60 ℃退火 60 s,共 40 个循环;最后 72 ℃延伸 7 min。 利用 2 . 5%的琼脂糖凝胶电泳分析检测结果。

　　D.2 . 3 多重检测

　　将 1 μL扩增产物探针点于尼龙膜上，每个扩增产物重复 1 次，经紫外交联 30 s 固定。 将固定好的膜放入杂交管中，加入预杂交液于杂交炉中 42 ℃预杂交 1 h,弃预杂交液，将经地高辛标记的 cZipcode

　　(5′-ACTCTCGACCTAGCG TAAGG-3′)沸水浴中变性 1 min,迅速移至冰上，5 min 后加入预杂交液中，42 ℃杂交过夜后，用大量 2 × SSC、0.1% SDS室温洗膜 2 次，每次 5 min,再用 0.5 × SSC、0.1% SDS于 68 ℃洗膜 2 次，每次 5 min。 洗膜后把膜加入洗涤液中洗膜 2 次，弃去，用封闭液封闭 30 min后，加入用封闭液稀释了 500 倍的 Anti-DIG-AP,轻摇 30 min。 最后，将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜 2 次 ，每次 15 min,加入检测液平衡 3 min,再加入 NBT/BCIP溶液，黑暗中静置显色 2 h,待观察到理想的显

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　　色后，用无菌水浸泡 10 min终止反应，进行拍照。

　　D.3 结果判定

　　若膜上的地高辛标记显示信号(如图 D. 1)可判定为阳性，否则为阴性。

　　图 D.1 样品在膜上的杂交信号

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　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　培养基配制

　　E.1 NA培养基

　　酵母膏 1 . 0 g

　　牛肉浸膏 3 . 0 g

　　蛋白陈 5 . 0 g

　　葡萄糖 10 . 0 g

　　琼脂 15.0 g

　　双蒸水 1 000 mL

　　调节 pH 至 7.2,湿热灭菌(121 ℃ , 15 min)。

　　E.2 KB培养基

　　多聚蛋白陈 20 g

　　甘油 10 g

　　七水硫酸镁 1 . 5 g

　　琼脂 15 g

　　双蒸水 1 000 mL

　　调节 pH 至 7.2,湿热灭菌(121 ℃ , 15 min)。

　　E.3 EBBA培养基

　　调节 pH 为 5.3~5.5, 加入 600 μL 的 15 mg/mL 溴甲酚紫母液和 1 mL 的 10 mg/mL 亮蓝 R 母液;121 ℃高温灭菌 15 min 后冷却至 55 ℃ ,再加入 10 mL 95%的乙醇，1 mL 过滤灭菌的 250 mg/mL放线菌酮以及 1 mL 10 mg/mL氨苄青霉素。

　　E.4 TWZ培养基

　　蛋白陈 5 g

　　氯化钙 0 . 25 g

　　琼脂粉 15 g

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　　蒸馏水 1 000 mL

　　高压灭菌，待冷却至 50 ℃时加入以下药剂：

　　吐温-80(灭菌) 10 mL

　　放线菌酮(25 mg/mL) 2 mL

　　小蘖碱(30 mg/mL) 5 mL

　　氯化三苯基四氮唑(10 mg/mL) 5 mL

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　　参 考 文 献

　　[1] TIAN Y, ZHAO Y, WALCOTT R R, et al. Reliable and Sensitive Detection of Acido℃orax citrulli in Cucurbit Seed Using a Padlock-Probe-Based Assay[J].Plant disease, 2013 , 97(7) : 961-966.

　　[2] QIAN T, FENG J , JIE H , et al. Selective detection of viable seed-borne Acido℃orax citrulli by real-time PCR with propidium monoazide[J].Scientific Reports , 2016 , 6 : 35457.

　　[3] BAHAR O,EFRAT M, HADAR E,et al.New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection of Acido℃oraxa℃enae subsp.citrulli[J].Plant Pathology,2008,57 : 754-763.

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　　[5] WALCOTT R R, GITAITIS R D, CASTRO A C. Role of Blossoms in Watermelon Seed In- festation by Acido℃oraxa℃enae subsp.citrulli[J].Phytopathology,2003,93(5) : 529-534.