GB/T 36820-2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36820—2018

　　甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法

　　Detectionmethodofsugarcanestreakmosaicvirusbyreal-timereverse

　　transcriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36820—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室。

　　本标准主要起草人：高三基、黄美婷、傅华英、孙生仁、张慧丽、王锦达、陈如凯。

　　GB/T 36820—2018

　　甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶

　　链式反应(RT-PCR)检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了甘蔗条纹花叶病毒(sugarcanestreakmosaic℃irus)实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法的仪器与设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等。

　　本标准适用于可能带有甘蔗条纹花叶病毒的活体寄主植物的快速检测、诊断。

　　2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CP：外壳蛋白(coat protein)

　　Ct值：实时荧光 PCR反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold)

　　cDNA：与 RNA链互补的单链 DNA(complementary DNA)

　　Ex Taq HS酶：热启动 DNA 聚合酶(hot start DNA polymerase)

　　FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction)

　　SCSMV：甘蔗条纹花叶病毒(sugarcanestreakmosaic℃irus)

　　TAMRA:6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine)

　　Tip：吸头

　　3 方法原理

　　根据甘蔗条纹花叶病毒 CP基因序列设计一对仅在该病毒 CP 基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记水解型寡核苷酸探针(TaqMan 探针)。 首先利用反转录酶将病毒 RNA 反转成cDNA,再以 cDNA 为模板在同一反应管内连续进行实时荧光 PCR 扩增反应，水解型寡核苷酸探针(TaqMan探针)的荧光信号强度伴随着 目标序列 PCR 扩增产物的增加呈正比关系，通过收集 PCR 扩增过程的荧光信号值，即可判断试样是否带有目标序列。 甘蔗条纹花叶病信息参见附录 A。

　　4 仪器与设备

　　4. 1 实时荧光 PCR检测仪：激发/检测波长范围 350 nm~750 nm;可用荧光染料(SYBR Green I)和水解型寡核苷酸探针(TaqMan探针);升降温速度 ≥2 . 0 ℃/s;均一性 +/- 0 . 5 ℃;准确性 +/- 0 . 3 ℃;温度范围 4 ℃ ~100 ℃。

　　4 . 2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

　　4 . 3 电子天平：感量 0 . 01 g。

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　　4.4 高速台式冷冻离心机：离心力 12 000g 以上。

　　4.5 微量加样器：0. 1 μL~2. 5 μL、0. 5 μL~ 10 μL、2 μL~ 20 μL、10 μL~ 100 μL、20 μL~ 200 μL、 50 μL~1 000 μL。

　　4.6 无核酸酶(Nuclease) 的 1. 5 mL、2. 0 mL 离心管，PCR 反应管、带滤芯 Tip 头、实时荧光 PCR 反应管。

　　4 . 7 恒温水浴锅。

　　4 . 8 鼓风干燥箱。

　　4.9 冰箱：2 ℃ ~8 ℃、-20 ℃、-80 ℃。

　　4 . 10 生物安全柜。

　　4 . 1 1 采样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子。

　　5 试剂与材料

　　5 . 1 试剂

　　除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合 GB/T 6682 的二级水指标，其中涉及PCR 的用水要求达到一级水指标。

　　5 . 1 . 1 氯仿 。

　　5 . 1 . 2 异丙醇 。

　　5 . 1 . 3 无水乙醇 。

　　5. 1 .4 无核酸酶(Nuclease)水。

　　5 . 1 . 5 裂解液：主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，为 RNA提取试剂。

　　5. 1 .6 75%乙醇。

　　5 . 1 . 7 定量荧光 PCR检测引物

　　5′-引物：5′-CGGGAAACCCATAATACCAC-3′。

　　3′-引物：5′-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3′。

　　扩增片段大小为 130 bp。

　　5 . 1 . 8 水解型寡核苷酸探针(TaqMan探针)

　　5′-FAM-TGCTGCATTGATTTCGTGATGGTG-TAMRA-3′。

　　5 . 1 . 9 用于一步法的荧光反转录聚合酶链式反应混合液

　　包括一步法反转录聚合酶链式反应缓冲液、5′-引物、3′-引物、水解型寡核苷酸探针(TaqMan 探针)、逆转录酶混合液、ExTaq HS DNA 聚合酶等，具体配制方法见附录 B。

　　5 . 2 材料

　　5 . 2 . 1 阳性对照：用已知含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阳性对照。

　　5 . 2 . 2 阴性对照：用已知不含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阴性对照。

　　5 . 2 . 3 空白对照：用无核酸酶的无菌一级水代替样品。

　　6 样品的采集与前处理

　　6 . 1 取样工具准备

　　砍刀、剪刀、镊子等取样工具应经 121 ℃ ±2 ℃ 、1 . 1 × 10 5 Pa高压灭菌 15 min或经 160 ℃干热灭菌2 h 。

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　　6 . 2 采样方法

　　6 . 2 . 1 采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，每采一个样品后，采样工具用 75%乙醇进行消毒。

　　6 . 2 . 2 叶片样品：用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(- 1 叶)叶片，编号备用。

　　6 . 2 . 3 蔗茎样品：用带槽钻子钻取甘蔗植株上部蔗茎蔗汁 1 mL 于 1 . 5 mL离心管，若为甘蔗蔗种，取中部种茎，编号备用。

　　6 . 3 存放与运送

　　采集或处理的样本在 2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存，要求放置- 80 ℃冰箱，但应避免反复冻融。 采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，或用液氮处理，尽快运送到实验室。

　　7 检测

　　7 . 1 RNA提取

　　7 . 1 . 1 RNA提取应在样品处理区进行。 取 1 . 5 mL无核酸酶(Nuclease)离心管，并对每个管进行编号。

　　7 . 1 . 2 称取 0 . 1 g~0 . 2 g样品材料，并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干净)。

　　7 . 1 . 3 向 1 . 5 mL离心管中加入粉末，等液氮刚挥发完立即加入 1 mL 裂解液，充分混匀，室温下静置10 min 。

　　7. 1 .4 加入 0 . 2 mL氯仿，盖住管盖，剧烈振荡混匀约 15 s, 室温静置 5 min 后，于 4 ℃ , 12 000g 离心10 min 。

　　7. 1 .5 取上清液转入另一新的 1 . 5 mL离心管，加入等体积异丙醇，室温静置 10 min, 于 4 ℃ , 12 000g离心 10 min。

　　7. 1 .6 弃上清液，加入 1 mL 75%乙醇洗涤，于 4 ℃ , 12 000g 离心 10 min,重复该步骤洗涤两次。

　　7. 1 .7 弃上清液，加入 1 mL 无水乙醇洗涤，于 4 ℃ , 12 000g 离心 10 min, 洗涤沉淀一次，室温晾干10 min 。

　　7. 1 .8 加入 50 μL 无核酸酶的水溶解，提取的 RNA 应在 2 h 内进行检测;若需长期保存，应放置

　　-80 ℃冰箱备用。

　　7 . 1 . 9 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测 260 nm 和 280 nm处的吸光值 A260 和 A280 ,并估算

　　提取的 RNA浓度。 RNA浓度按式(1)计算：

　　c=A260 × N × 40/1 000 ……………………………( 1 )

　　式中：

　　c —RNA浓度，单位为微克每微升(μg/μL) ;

　　A260 — 260 nm处的吸光值;

　　N —RNA稀释倍数。

　　当 A260/A280 比值在为 1 . 8~2 . 0 之间时，适合于实时荧光反转录聚合酶链式反应扩增。

　　7 . 2 实时荧光反转录聚合酶链式反应

　　7 . 2 . 1 实时荧光反转录聚合酶链式反应应在核酸检验区进行。 从试剂盒中取出荧光反转录聚合酶链式反应反应液，在冰上融化后，2 000g 离心 5 s。 每个测试样本反应体系见附录 B。

　　7 . 2 . 2 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，全部加完后，充分混合均匀，向每个实时荧光 PCR管中各分装 18 . 0 μL。

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　　7.2.3 在各设定的实时荧光 PCR管中分别加入待测的 RNA样品 2 . 0 μL(RNA 约 100 ng),盖紧管盖后，500 g离心 30 s。

　　7 . 2 . 4 将 7 . 2 . 3 中加样后的实时荧光 PCR反应管放入荧光 PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 实时荧光 PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：第一阶段为 RNA 样品反转录反应：42 ℃ 5 min 反转录，95 ℃ 10 s终止反转录;第二阶段为 PCR反应：95 ℃ 10 s, 60 ℃ 34 s, 40 个循环。在每次循环的退*时收集荧光。

　　8 结果判断与表述

　　8 . 1 结果分析条件设定

　　实时荧光 PCR反应结束后，设置荧光信号阈值，阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准。

　　8 . 2 对照结果

　　检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。 采用感染了甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗叶片总RNA作为阳性样品;采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片总 RNA 为阴性对照;用等体积的无核酸酶的无菌一级水代替模板 RNA作空白对照。

　　空白对照，无 Ct值且无扩增曲线;阴性对照，无 Ct值且无扩增曲线;阳性对照，Ct值应小于或等于

　　30 . 0,并出现典型的扩增曲线。 否则，此次实验视为无效，需要查明原因重新检测。

　　8 . 3 检测结果的判定

　　8 . 3 . 1 阴性

　　Ct值大于或等于 40 . 0,且无典型的扩增曲线，表示样品中不含甘蔗条纹花叶病毒。

　　8 . 3 . 2 阳性

　　Ct值小于或等于 35 . 0,且出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗条纹花叶病毒。

　　8 . 3 . 3 有效原则

　　Ct值大于 35 . 0 且小于 40 . 0,并出现典型的扩增曲线的样本应进行重做检测实验。 重复实验的结果 Ct值仍然大于 35 . 0 且小于 40 . 0,并出现典型的扩增曲线，则判定样本检测结果为阳性;Ct值大于或等于 40 . 0,则判定样本检测结果为阴性。

　　8 . 4 结果表述

　　该试样中检出甘蔗条纹花叶病毒。

　　该试样中未检出甘蔗条纹花叶病毒。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　甘蔗条纹花叶病信息

　　A.1 甘蔗条纹花叶病毒基本信息

　　甘蔗条纹花叶病毒属于马铃薯 Y病毒科(poty℃iridae)禾本科病毒属(poace℃irus)成员，英文名称为 sugarcanestreakmosaic℃irus，缩写为 SCSMV。

　　A.2 病毒粒子形态特征

　　甘蔗条纹花叶病毒粒子为弯曲线状，大小约 890 nm× 15 nm,为单链正义 RNA 病毒，基因组大小约 10 kb。

　　A.3 寄主范围

　　甘蔗条纹花叶病毒自然寄主为甘蔗属中的热带种(saccharum oficinarum)、大茎野生种(saccha- rumrobustum)、中国种(saccharum sinensis)、割手密(saccharumspontaneum)和甘蔗栽培种(saccha- rum spp.hybrid)以及高粱，实验寄主包括其他禾本科植物如玉米、小米、苏丹草、石茅、高粱等。

　　A.4 病害症状

　　甘蔗条纹花叶病毒主要为害叶片，以新叶基部症状最为明显。 病叶上有许多不规则的黄绿色或浅黄色的纵短条纹，此条纹与叶脉平行，但其宽度不受叶脉的限制。 条纹的形状有长圆形、卵圆形或条形，有时成短小针状，或沿叶脉作放射状。 褪绿条纹与正常绿色相间成花叶症状。

　　A.5 分布地区

　　由甘蔗条纹花叶病毒引起的甘蔗花叶病于 1998 年最早发生在印度，随后陆续在巴基斯坦、孟加拉、斯里兰卡、泰国、越南、印度尼西亚、缅甸、中国等亚洲国家也有发现。

　　A.6 传播途径

　　主要通过感病的无性繁殖材料(种质)传播，也可通过收获机械和摩擦接种方式传播，昆虫传播媒介尚不清楚。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应体系

　　每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应扩增体系见表 B. 1 。

　　表 B.1 每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应扩增体系

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　　参 考 文 献

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