GB/T 36779-2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36779—2018

　　芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofFusariumoxysporum f.sp.api

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36779—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：张卫东、黄永辉、权永兵、宋凤鸣、迟远丽、徐淼锋、廖力、林伟、李金庆、于金迪。

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　　芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了芹菜枯萎病菌检疫鉴定的方法。

　　本标准适用于可能携带芹菜枯萎病菌的种子、种苗、植物残体及土壤中芹菜枯萎病菌的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　SN/T 2589 植物病原真菌检测规范

　　3 芹菜枯萎病菌基本信息

　　中文名：芹菜枯萎病菌

　　学名：Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.apii Snyder et Hansen.1940

　　异名：Fusariumbulbigenum Cooke et Massee.1887、Fusarium orthocerasAppel et Wollenw.1910、 Fusarium angustum Sherb.1915、Fusarium orthoceras var.apii(Nelson et Sherb.) Wollenw et Rein- king.1935、Fusarium apiiNelson et Sherb.1937、Fusarium apiivar.pallidum Nelson et Sherb.1937、 Fusarium oxysporum f.apii(Nelson et Sherb.) Snyder et Hansen. 1940、Fusarium bulbigenum var. apii(Nelson & Sherb.) Raillo.1950

　　分类地位：真菌界(Kingdom Fungi) 半知菌门 (Deuteromycota)、丝孢纲 (Hyphomycetes)、瘤座孢目 (Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)。

　　芹菜枯萎病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 原理

　　芹菜枯萎病菌的危害症状、菌落的培养性状、寄主范围、分子生物学特性、致病性测定结果等特征是其鉴定的主要依据。

　　5 仪器设备、用具和主要试剂

　　5 . 1 仪器

　　PCR仪、光照培养箱、生物显微镜(100× ~1 000×)、体视显微镜、组织研磨仪、生物安全柜、高速冷冻离心机、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平(感量 0 . 000 1 g) 、pH 计、高压灭菌锅。

　　5 . 2 用具

　　酒精灯、纱布、烧杯、接种针、接种环、培养皿、锥形瓶、棉花塞、载玻片、盖玻片、铝铂纸、解剖刀、解剖

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　　剪、镊子、记号笔、移液器(1 000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL) 和离心管。

　　5 . 3 主要试剂

　　无水乙醇、氯化钠、饱和酚、氯仿、次氯酸钠(NaClO)、异丙醇、异戊醇、五氯硝基苯(PCNB)、冰醋酸 、β-巯基乙醇、Tris-盐酸、Na2EDTA、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、溴化乙锭、DNA分子量标准、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 。

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。

　　6 现场检疫

　　取样时应针对性检查，注意检查有无可疑病株，若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室进一步检验鉴定。 在以上针对性检查基础上，再按照 SN/T 2122 的规定执行。

　　7 检疫鉴定方法

　　7 . 1 症状检查

　　7 . 1 . 1 种子症状检查

　　在解剖境下挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的或有霉变的种子，分成 2 份，每份种子样品不少于 500 粒，其中一份用于 PCR 初筛，另一份用于病原菌的分离鉴定。

　　7 . 1 . 2 植株症状检查

　　取待检植株，观察植株是否存在生长不良、矮小衰弱、叶柄褪色、叶片变黄等外观变化，纵切叶柄检查维管束是否变褐褪色(参见附录 B),检查植株有无附着土壤。

　　7.2 PCR初筛

　　7 . 2 . 1 样品 DNA提取

　　取挑选的种子、植株可疑病变组织或土壤提取 DNA(见附录 C) 。

　　7.2.2 PCR检测

　　PCR检测方法见附录 D, PCR初筛检测结果阳性进行 7 . 3 病菌分离培养;PCR初筛检测结果阴性，则可报告未检出芹菜枯萎病菌。

　　7 . 3 病菌分离培养

　　7 . 3 . 1 种子

　　将种子用有效成分为 1 . 25%的次氯酸钠(NaClO)溶液表面灭菌 3 min~4 min,无菌水洗涤 2 次，放在垫有 3 层无菌湿滤纸的培养皿中，每皿 10 粒，在 20 ℃ ~22 ℃下放置 24 h 后，-20 ℃冷冻 24 h,转至25 ℃光照培养箱里黑暗 12 h光照 12 h培养，观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移置 PDA培养基平板上纯化。 包衣种子可用双蒸水洗去表面的种衣剂。

　　7 . 3 . 2 植物组织

　　取待检样品的组织切成 1 cm 长的小段，冲洗掉表面的泥土杂物后，在 75%乙醇中浸泡 1 min,经无

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　　菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为 2 mm~4 mm 的小方块，放置在垫有 3 层无菌湿滤纸的培养皿中，每皿 5 片 ~10 片，转至 25 ℃光照培养箱里黑暗 12 h光照 12 h培养，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移置 PDA培养基平板上纯化。

　　7 . 3 . 3 土壤

　　取 2 g 土壤放入 200 mL无菌水中，混匀 30 min,悬浮液稀释 10 倍，取 1 mL 土壤稀释液涂抹于含五氯硝基苯(PCNB)的 PDA平板上，5 个重复，转至 25 ℃光照培养箱里黑暗 12 h 光照 12 h 培养，观察菌落的产生情况，将可疑菌落转移至 PDA培养基平板上纯化。

　　7 . 4 分离物的纯化

　　分离物的纯化采用琼胶平板表面单孢子挑取法进行纯化。 将分离物上产生的孢子用灭菌水洗下，稀释到每个培养皿中 30 个左右的孢子，取一定量的孢子悬浮液加到洁净的硬琼胶培养基平板上，25 ℃条件下过夜放置。 在生物显微镜下检查，用消毒的解剖刀或接种针将初萌发单个孢子的小菌块转移到PDA培养基上。

　　7 . 5 形态学观察

　　纯化后的分离物转到 PDA上培养，观察记录菌落形态、颜色，大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形态特征;测量菌丝生长速率及分生孢子、厚垣孢子的大小。

　　7 . 6 病菌分离物的 PCR检测

　　采用 CTAB法(见附录 C)提取疑似分离物 DNA, PCR检测见附录 D。

　　7 . 7 测序

　　PCR扩增结果为阳性，需将 PCR扩增产物进行测序比对，以进一步确证是否为尖孢镰刀菌。

　　7 . 8 致病性试验

　　将在 PDA上培养 10 d 的分离物用 100 mL无菌水冲洗分生孢子，制成 1 . 0 × 10 6 个/mL分生孢子悬浮液，与商业栽培土充分混匀，装入塑料盆中，对照采用清水代替孢子悬浮液接种。 将 4 叶 ~5 叶期苗龄的健康芹菜苗移植盆中，置于温室(25 ℃ ~28 ℃),每天 14 h~16 h光照，正常淋水管理，接种 5 周后检查芹菜植株有无发病，并再次从发病部分离病原菌，观察其形态。

　　8 鉴定特征

　　8 . 1 培养性状

　　该病菌在 PDA平板上，生长迅速，培养 5 d后，菌落直径通常 4 cm~5 cm,菌落突起絮状，菌丝由白色变为淡紫色、淡橙色或米黄色，基物表面淡紫色(参见附录 B) 。

　　8 . 2 病原特征

　　菌丝无色透明，具隔膜，气生菌丝有隔，直径 1 . 5 μm~3 μm。 小型分生孢子单胞，无色透明，椭圆形或卵形，大小 4 . 7 μm~7 . 4 μm×1 . 5 μm~3 . 7 μm;大型分生孢子镰刀形，较稀少，多数为 3 个隔膜，顶细胞较尖细，底部具足细胞，大小 18 . 7 μm~29 . 6 μm× 3 . 7 μm~4 . 8 μm。 厚垣孢子间生或顶生，球形，单

　　个或成对。

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　　8 . 3 致病性试验

　　接种 5 周，受侵染的芹菜植株表现生长缓慢，叶片无光泽，变暗淡，叶片失绿或脉间叶肉出现黄绿相间斑驳，维管束变为褐色至黑褐色，根、根颈部、叶柄变为红色，根部和根茎部腐烂。 从发病植株上进行病菌再分离培养，分离物的培养性状和形态特征与芹菜枯萎病菌相符合。

　　9 结果判定

　　若 7 . 2 PCR初筛试验结果为阴性，可报告未检出芹菜枯萎病菌;若 7 . 2 PCR初筛结果和 7 . 6 病菌分离物的 PCR检测结果为阳性，且获得的分离物在形态学、致病性两个方面符合芹菜枯萎病菌特征，则鉴定为芹菜枯萎病菌。

　　10 样品保存和复核

　　10 . 1 样品的保存

　　若鉴定为芹菜枯萎病菌，将获得的分离物转接种于 PDA斜面培养基置 4 ℃ ~8 ℃保存。 标签上应注明样品编号、种名、寄主、产地、制作人和制作时间等。 有条件可进行冷冻干燥保存。

　　对已鉴定出带有芹菜枯萎病菌的植物材料，经登记后，要保存在 5 ℃ ~ 10 ℃及干燥、防鼠防虫处，并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具名称、来源国等，样品需至少保存 6 个月，以备复验、谈判和仲裁。 保存期满灭活处理。

　　10 . 2 复核

　　检验结果的复核由国家质量监督检验检疫局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　芹菜枯萎病菌基本资料

　　A.1 寄主范围

　　芹菜枯萎病菌的自然寄主为芹菜(Apiumgra℃eolens L. ) 。

　　A.2 分布地区

　　北美洲：美国、加拿大。

　　南美洲：阿根廷。

　　亚洲：日本、中国(广东)。

　　A.3 传播方式

　　病菌主要通过芹菜苗及其粘附的土壤进行远距离传播。 病菌以厚垣孢子在土壤或植株病残体中越冬，病株根或叶柄的腐烂处在潮湿环境中产生子实体，孢子借气流、雨水、灌溉水的泼溅传播，通过幼根和叶柄基部或扦插苗的伤口侵入为害。

　　A.4 危害

　　芹菜枯萎病菌自然条件下只能侵染芹菜，可引起多种症状。 受侵染的芹菜植株表现生长缓慢，叶片无光泽，叶色变暗淡，严重时叶片失绿或脉间叶肉出现黄绿相间斑驳，脱落，病菌多寄生在根或根颈及叶柄维管束中，由于菌丝大量繁殖，引起植株营养物质或水分向上运输受到妨碍，从而表现出枯萎症状，甚至整株枯死。 维管束变为褐色至黑褐色，根、根颈部、叶柄变为红色，根部和根茎部腐烂。 该病潜育期20 d左右，最适宜的发病温度为 25 ℃ ~32 ℃ ,气温低于 7 . 7 ℃或高于 36 ℃则发病轻。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　芹菜枯萎病的症状和病原菌形态特征

　　芹菜枯萎病菌危害芹菜症状见图 B. 1 。

　　a)健康植株(左)及不同发病程度的植株

　　b)健康植株根部(右)及不同发病程度的根部 c)根部症状

　　注 ：图片引 自 Lori G. A。

　　图 B.1 芹菜枯萎病菌危害芹菜症状图

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　　芹菜枯萎病菌的培养性状见图 B. 2 。

　　图 B.2 芹菜枯萎病菌的培养性状

　　芹菜枯萎病菌的形态特征见图 B. 3 。

　　a)分生孢子 b)厚垣孢子

　　图 B.3 芹菜枯萎病菌的形态特征

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　基因组 DNA提取方法

　　C.1 种子、病组织、菌丝 DNA提取

　　取适量待检测菌丝、种子或新鲜病组织，置于灭菌研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉状，将研磨

　　后的 0.1 g样品转移至 1.5 mL离心管中，加入 1.2 mL DNA抽提缓冲液(2% CTAB, 100 mmol/L Tris- HCl, 25 mmol/L Na2 EDTA, 1.4 mol/L NaCl, 2% β-巯基乙醇，pH 8.0),充分混匀，65 ℃水浴中孵育30 min。室温 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 700 μL移至 1.5 mL离心管中，加入 5 μL Rnase A (10 μg/mL) , 37 ℃水 浴 孵 育 30 min。 加 入 等 体 积 的 三 氯 甲 烷-异 戊 醇 ( 24 ∶ 1) , 颠 倒 混 匀。 室 温12 000 r/min 离心 10 min,取上清液 600 μL移至另一 1.5 mL离心管中，加入等体积 CTAB沉淀液，混匀，室温 12 000 r/min离心 10 min,弃上清液。加入 600 μL氯化钠(1.2 mol/L) 室温静置 5 min, 加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1),颠倒混匀。 室温 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 600 μL 移至另一 1.5 mL离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温静置 30 min。12 000 r/min 离心 10 min,弃上清液。 用 70%冷乙醇洗涤沉淀 2 次，无水乙醇洗涤沉淀一次，晾干。 加入 50 μL TE 缓冲液溶解DNA沉淀，-20 ℃长期保存。 镰刀菌 DNA 的提取也可使用相应市售 DNA提取试剂盒。

　　C.2 土壤中病菌 DNA 的提取

　　土壤中病菌 DNA 的提取见 SN/T 2589,样品在室温下晾干后碾碎过筛，剔除石砾等相关杂质，装袋后置于 4 ℃冰箱保存。 土壤总 DNA 提取方法如下：称取 10 . 0 g 土样，放入盛有 10 粒无菌玻璃珠(直

　　径 3 mm) 的 锥 形 瓶 中，加 15 mL 提 取 缓 冲 液 ( 100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L Na2 EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1%PVP, 2% CTAB, pH 8.0)。在 180 r/min, 37 ℃ 条件下振荡 30 min, 加 2 mL 20%SDS 继续振荡 10 min。65 ℃ 水浴 1 h 后 6 000 r/min 离心 15 min, 收集上清液，加 0. 5 倍体积PEG(30%)-NaCl(1.6 mol/L), 混匀后室温下静止 2 h, 10 000 r/min 离心 20 min, 沉淀用 2 mL TE 重

　　新悬浮。 加 4 mol/L乙酸钠(pH 5 . 4)至终浓度 0 . 3 mol/L,用苯酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1)抽提一次，0.6 倍体积异丙醇沉淀 2 h, 12 000 r/min离心 20 min,沉淀干燥后，200 μL TE 溶解，置于 -20 ℃ 保存备用。 镰刀菌 DNA 的提取也可使用相应市售 DNA提取试剂盒。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)PCR检测方法

　　D.1 引物信息

　　PCR检测引物根据尖孢镰刀菌 β-微管蛋白基因(β-tubulin, TUB)序列设计，序列见表 D. 1 。

　　表 D.1 PCR引物

　　D.2 PCR反应体系

　　PCR扩增反应体系为 25 μL, 每个反应分别加入 10 × PCR 缓冲液 2. 5 μL, dNTP( 10 mmol/L)

　　1 μL,上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL, DNA模板 1 μL, 最后补充

　　双蒸水至总体积为 25 μL。 用尖孢镰刀菌 DNA作阳性对照，以非尖孢镰刀菌作为阴性对照，同时设置空白提取对照和空白对照，每个样品重复 3 次 。

　　D.3 PCR反应条件

　　PCR反应条件为：95 ℃预变性 5 min; 30 个循环为 95 ℃变性 30 s、60 ℃退火 45 s、72 ℃延伸1 min;最后 72 ℃延伸 5 min, PCR结束后产物于 4 ℃冰箱保存。

　　D.4 电泳分析

　　取 5 μL扩增产物与 1 μL 的 6×上样缓冲液混合均匀，在 0 . 5×TBE缓冲液配制的 1 . 5%琼脂糖凝胶中，4 V/cm~6 V/ cm 电泳 50 min,溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。

　　D.5 PCR结果判定

　　阳性对照在 650 bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为尖孢镰刀菌阳性。

　　阳性对照在 650 bp处出现扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。

　　D.6 测序结果

　　PCR扩增结果为阳性，需将 PCR扩增产物进行测序比对，以进一步确证是否为尖孢镰刀菌。 芹菜

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　　枯萎病菌的 TUB序列如下：

　　AGGAGGCCATCGATGTTGTGCGACACGAGGTTGAGAACTGTGACCATCTTCAGGGTTT CCAGCTCACCCACTCTCTGGGCGGTGGTACCGGTTCCGGTATGGGAACGCTTCTTCTGTCGA AAATCCGTGAGGAGTTTCCCGATCGTATGATGGCTACTTTTTCTGTTATGCCTTCGCCCAA GGTTTCTGATACCGTTGTCGAACCATACAACGCCACTTTGTCATTGAACCAGCTTGTCGAG AACTCCGATGAGACCTTCTGTATCGATAACGAGGCTTTGTACGACATTTACGAGAAGACCT TGAAGATCGCTGATCCTTCTTATGCCGATCTTAACTACCTGATCTCGACAGTTATGGCCGG CGTGACAACATGTTTCCGATTCCCCGGTCAGCTTAACTCCGATCTGCGCAAGTTGGCCGTCA ACATGATTCCGTTCCCTCGACTTCACTTCTTCATGGTTGGATTTGCGCCTTTGACTGGTCGC AAGATGCAGGGCTTCCAACATCTTACCGTGCCCAGTCTGGCTCAGCAGATTTTCGATAACA AGAACGTTATGGCTGCTGCTGATTTCCGCAACGGTCGATACCTCACTTGTTCCGCGATTTT GTAAGTTTTGATTTGAAAAGATGCATGAGATGAGATGGAC

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　　参 考 文 献

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