GB/T 36778-2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36778—2018

　　燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofoatmosaicvirus

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36778—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、浙江省农业科学院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：郭立新、段维军、梁新苗、杨永生、孙丽英、吴薇、荣德福。

　　GB/T 36778—2018

　　燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了燕麦花叶病毒的血清学、分子生物学及免疫电镜检测与鉴定方法。

　　本标准适用于燕麦属(A℃ena)植株、种子及种子中夹杂的土壤上的燕麦花叶病毒的检疫和鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　3 燕麦花叶病毒基本信息

　　学名：oatmosaic℃irus。

　　异名：Soil-borne oat mosaic virus 。

　　缩写：OMV。

　　分类地位：马铃薯 Y病毒科(pity℃iridae)、大麦黄花叶病毒属(Bymo℃irus)。

　　燕麦花叶病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 及免疫电镜(IEM)检测是本标准制定的主要依据。

　　5 仪器设备和主要试剂

　　5 . 1 仪器设备

　　电子天平(感量 0. 001 g)、普通天平(感量 0. 1 g)、高速冷冻离心机、小型离心机、超低温冰箱( -80 ℃)、制冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH 计、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、电泳

　　槽、凝胶分析成像系统、酶标仪、洗板机、透射电子显微镜。

　　5 . 2 主要试剂

　　所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 DAS-ELISA 检测试剂见附录 B ; RT-PCR 检测试剂见附录 C ; IEM 检测试剂见 SN/T 1840 。

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　　6 检测样品制备

　　6 . 1 种子

　　抽样按照 SN/T 2122 的规定执行。

　　挑取至少 1 000 粒种子样品，将其分成若干份，每份 25 粒~100 粒。用灭菌蒸馏水浸泡种子，待种子泡软后(约 12 h~24 h)进行试验。

　　6 . 2 植株

　　抽样按照 SN/T 2122 的规定执行。

　　对于有症状的植株样品编号单独检测，检测时选取全部表现症状的叶片。 未表现症状的植株样品分组(10 株为 1 组)并编号检测，检测时选取幼嫩叶片进行试验。

　　7 检测与鉴定

　　7 . 1 DAS-ELISA方法

　　DAS-ELISA检测时，将使用的点样孔安排在酶联板内部，避免使用酶联板周围一圈的点样孔，防止边际效应的发生，影响检验结果的准确性。 在一次血清学检测试验中，一般设置 2 个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2 个空白对照孔作为质量控制，并根据送检样品数量设置待检样品孔数量，要求每个待检样品设置两次重复。

　　具体检测方法见附录 B。

　　7 . 2 一步 RT-PCR方法

　　RT-PCR 检测时，每个样品设置两个平行反应。 检测时以感染燕麦花叶病毒的植物组织作为阳性对照，以健康植物组织作为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照。

　　具体检测方法见附录 C。

　　7 . 3 IEM 检测方法

　　利用燕麦花叶病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，

　　具体检测方法见 SN/T 1840。如观察到长 600 nm~750 nm,宽 12 nm~14 nm 弯曲线状的病毒粒子，

　　即可判定 IEM 检测结果阳性。

　　8 结果判定

　　若样品经酶联免疫检测结果为阳性，且 RT-PCR检测为阳性或 IEM 检测为阳性，则判定为检出燕麦花叶病毒。

　　若样品经 RT-PCR 检测为阳性，且序列测定结果与已知燕麦花叶病毒核苷酸序列一致性不低于

　　80% ,则判定为检出燕麦花叶病毒。

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　　9 样品、结果记录与资料保存

　　9 . 1 样品保存与处理

　　经检验确定携带燕麦花叶病毒的样品经登记人和经手人签字后妥善保存 1 年，以备复核，种子保存

　　在干燥条件下或 4 ℃冰箱内，病叶冷冻干燥后保存于- 20 ℃或- 80 ℃冰箱内。保存期满后应经高压

　　蒸汽灭菌后方可处理。

　　9 . 2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。 酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，RT-PCR 凝胶电泳检测需有电泳结果照片及序列测定结果，IEM 检测需有电镜照片。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　燕麦花叶病毒其他信息

　　A.1 病害症状

　　引起秋播燕麦(A℃enasati℃a L.)发病，燕麦受燕麦花叶病毒侵染后，最初叶片上出现短的褪绿条纹

　　或条斑，后变为黄斑或叶片萎黄，而随着气温升高，通常会隐症。 早春田间发病燕麦植株成片矮化、褪绿

　　(图 A.1)。耐病 品种受燕麦花 叶病毒侵染，燕麦产量损失 25% ~ 50% , 易感病 品种产量损失 高

　　达 100% 。

　　注：引 自 http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm? imgnum= 1436034

　　图 A.1 燕麦花叶病毒在燕麦上引起的症状

　　A.2 寄主范围

　　寄主范围较窄，只局限于燕麦属(A℃ena)作物。

　　A.3 分布

　　分布于英格兰、威尔士、爱尔兰、意大利、法国、美国。

　　A.4 粒体形态

　　病毒粒体为弯曲线状，长 600 nm~750 nm,宽 12 nm~14 nm(见图 A.2)。

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　　注 1 ：黑色粗线表示 100 nm。

　　注 2 ：引 自 Tomio U。

　　图 A.2 燕麦花叶病毒粒体形态

　　A.5 传播方式

　　主要通过土壤中的禾谷多黏菌(polymyxagraminis L.)进行传播;也可通过汁液摩擦接种传播，

　　但较困难;不能通过种子传播，但种子能带毒，带毒的种子在含禾谷多黏菌的土壤中能传播燕麦花叶病毒。

　　A.6 抗原特性

　　具有中等免疫原性，与其他燕麦属作物病毒无血清学关系。

　　A.7 基因组

　　二分体基因 组，由 2 条 线 形 正 义 核 糖 核 酸 (RNA) 组 成，即：RNA1 和 RNA2 。 RNA1 全 长 为

　　7 550 nt,编码产生 1 个分子质量为 262.8 ku 的多聚蛋白，随后切割成一些功能产物，外壳蛋白(CP)在C端，分子量为 28.8 ku; RNA2 长约 3 500 nt,长期摩擦接种可导致其基因缺失突变。

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　　附 录 B

　　(规范性附录) DAS-ELISA方法

　　B.1 主要试剂

　　B.1 . 1 包被抗体

　　特异性的燕麦花叶病毒抗体。

　　B.1 . 2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的燕麦花叶病毒抗体。

　　B.1 . 3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(ρNPP)。

　　B.1 .4 磷酸盐吐温缓冲液(PBST)(洗涤缓冲液)

　　溶于蒸馏水，调 pH 值至 7.4,蒸馏水定容至 1 L, 4 ℃冰箱保存。

　　B.1 . 5 包被缓冲液

　　碳酸钠(Na2 CO3) 1.59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93 g

　　叠氮化钠(NaN3) 0.2 g

　　溶于蒸馏水，调 pH 值至 9.6,蒸馏水定容至 1 L, 4 ℃冰箱保存。

　　B.1 . 6 样品抽提缓冲液

　　1 × PBST 1 . 0 L

　　亚硫酸钠(Na2 SO3) 1.3 g

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW 24 000~MW 40 000) 20.0 g

　　叠氮化钠(NaN3) 0.2 g

　　吐温-20 ( Tween-20) 20 . 0 mL

　　调 pH 值至 7.4 , 4 ℃冰箱保存。

　　B.1 . 7 酶标抗体稀释缓冲液

　　1 × PBST 1 . 0 L

　　PVP(MW 24 000~MW 40 000) 20.0 g

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　　牛血清白蛋白(BSA) 2.0 g

　　叠氮化钠(NaN3) 0.2 g

　　调 pH 值至 7.4 , 4 ℃冰箱保存。

　　B.1 .8 底物(ρNPP)缓冲液

　　二乙醇胺 97 . 0 mL

　　氯化镁(MgCl2) 0.1 g

　　叠氮化钠(NaN3) 0.2 g

　　溶于蒸馏水，调 pH 值至 9.8,蒸馏水定容至 1 L, 4 ℃冰箱保存。

　　B.1 . 9 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH) 12.0 g

　　蒸馏水定容到 100 mL。

　　B.2 试验步骤

　　B.2 . 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释，加入酶联板孔中，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2h 或 4 ℃冰箱孵育过夜，清空孔中溶液，PBST洗涤 4 次，每次 3 min。

　　B.2 . 2 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2 000 g离心 10 min,上清即为

　　制备好的检测样品。 对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。

　　B.2 . 3 加样

　　加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2h 或 4 ℃冰箱孵育过夜，PBST洗涤 4 次，每次 3 min。

　　B.2 . 4 加酶标抗体

　　根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2 h, PBST洗涤 4 次，每次 3 min。

　　B.2 . 5 加底物

　　将底物 ρNPP 加入到底物缓冲液中，终浓度为 1 mg/mL(现配现用)，按每孔加入 100 μL,室温避光孵育 30 min。必要时每孔加入 50 μL 3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应。

　　B.2 . 6 读数

　　30 min后用酶标仪在 405 nm 处读 OD值。

　　B.3 结果判断

　　B.3 . 1 对照孔的 OD405 值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：

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　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405 值均<0.15,当阴性对照孔的 OD405 值<0.05 时，按 0.05 计算;阳性对照 OD405 值/阴性对照 OD405 值>5~10;同一样品的重复性基本一致。

　　B.3 . 2 在满足了 B. 3 . 1 质量要求后，结果可判断如下：

　　样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值明显>2,判为阳性;样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值在阈值附近，判为可疑样品，需重新进行试验，或用其他方法加以验证;样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值明显<2,判

　　为阴性。

　　B.3 . 3 若满足不了 B. 3 . 1 质量要求，则不能进行结果判断。

　　B.3 . 4 若采用商品化试剂盒，按照试剂盒说明操作并判定结果。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　一步 RT-PCR检测方法

　　C.1 主要试剂

　　C.1 . 1 50 ×TAE缓冲液

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris)碱 242 g

　　冰乙酸 57 . 1 mL

　　乙二胺四乙酸(EDTA )(0.5 mol/L, pH 8.0) 100 mL

　　双蒸水定容到 1 L。

　　C.1 .2 6×Loading缓冲液

　　溴酚蓝 0.25%(质量 ∶ 体积)

　　二甲苯青 FF 0.25%(质量 ∶ 体积)

　　蔗糖水溶液 40%(质量 ∶ 体积)

　　贮存于 4 ℃ 。

　　C.2 引物序列

　　正向引物 OMVCPF: 5 ’-GAC AAT GGA ACA GGA TCA ATG -3 ’;反向引物 oligo-d(T) Not1 primer: 5 ’-CAA TTC GCG GCC GC(T)15-3’;扩增区域在外壳蛋白基因和 Poly(A)上，扩增片段大小为 758 bp。

　　C.3 试验步骤

　　C.3 . 1 植物总 RNA 的提取

　　C.3. 1 . 1 取 0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL Trizol Reagent,颠倒混匀，2 ℃ ~8 ℃ , 12 000 g，离心 10 min。

　　C.3. 1 .2 取上清，15 ℃ ~30 ℃ ,放置 5 min;加入 0. 2 mL 三氯甲烷，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15 s。15 ℃ ~30 ℃ ,放置 2 min~3 min; 2 ℃ ~8 ℃ , 12 000 g，离心 15 min。

　　C.3. 1 .3 小心吸取约为 600 μL 的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加 500 μL 异丙醇混合上清液， 15 ℃ ~30 ℃ ,放置 10 min。2 ℃ ~8 ℃ , 12 000 g，离心 10 min。

　　C.3. 1 .4 去除上清液，沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，洗涤;2 ℃ ~8 ℃ , 7 500 g，离心 5 min。

　　C.3. 1 .5 去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于 30 μL ~50 μL无 RNase 的双蒸水中。

　　注：植物总 RNA 的提取也可使用相应市售 RNA提取试剂盒提取。 土壤中 RNA 的提取可使用相应市售 RNA 提取试剂盒提取。

　　C.3 . 2 RT-PCR

　　在 25 μL反应体系中加入 2.5 μL 10 × RT-PCR 缓冲液，5 μL MgCl2 (25 mmol/L) , 2.5 μL dNTP

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　　Mixture(各 10 mmol/L) , 0. 5 μL RNase Inhibitor (40 U/μL) , 0. 5 μL AMV RTase XL( 5 U/μL) , 0.5 μL AMV-optimi≈edTaq(5 U/μL) ,0.5 μL 引物 OMVCPF (20 μmol/L) , 0.5 μL 引物 oligo-d(T) Not1 primer (20 μmol/L) , 1 μL RNA, RNase Free ddH2 O 补至 25 μL。反应条件为：50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min;然后 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s,共 35 个循环;72 ℃ 5 min。

　　注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。 也可采用其他商业 RT-PCR 试剂盒。

　　C.3 .3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

　　灌制 1.5%琼脂糖凝胶板，室温凝胶 30 min,取 5 μL PCR产物与 6×loading缓冲液混匀后点样，用DNA Marker 作 分 子 量 标 记，在 1 × TAE 中 以 5 V/ cm 的 电 压 电 泳 30 min。 溴 化 乙 锭 溶 液(0.5 μg/mL)染色 10 min,用凝胶成像仪照相。

　　注：可用溴化乙锭替代产品染色。

　　C.4 结果判断

　　阴性对照和空白对照在 758 bp 处未出现扩增条带，待测样品与阳性对照在 758 bp 处出现扩增条

　　带，判定结果为阳性。

　　阴性对照和空白对照在 758 bp 处未出现扩增条带，阳性对照在 758 bp 处出现扩增条带，且样品无

　　特异性扩增，判定结果为阴性。

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　　参 考 文 献

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