GB/T 36780-2018 辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36780—2018

　　辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofpeppermildmottlevirus

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36780—2018

　　GB/T 36780—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：魏梅生、郭京泽、朱水芳、孔君、李桂芬、赵文军、王军平、文朝慧、尤佳。

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　　辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了辣椒轻斑驳病毒(peppermildmottle℃irus)的检疫鉴定方法。

　　本标准适用于寄主植株和未处理种子上辣椒轻斑驳病毒的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 病毒基本信息

　　学名：peppermildmottle℃irus

　　缩写：PMMoV

　　中文名：辣椒轻斑驳病毒

　　异名：烟草花叶病毒潜隐株系;烟草花叶病毒 Samsun潜隐株系

　　分类地位：植物杆状病毒科(virga℃iridae)，烟草花叶病毒属(Tobamo℃irus)

　　PMMoV 的其他信息参见附录 A。

　　4 原理

　　PMMoV 的蛋白和基因组特征是该病毒检测鉴定的依据。 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　(DAS-ELISA)、斑 点 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (Dot-ELISA)、胶 体 金 免 疫 层 析 测 定、RT-PCR、实 时 荧 光RT-PCR等方法来特异性检测该病毒，并判断样品是否带有 PMMoV。

　　PMMoV 的侵染性是该病毒生物学活性的重要指标。 采用生物学接种的方法来判断病毒的活性。

　　5 仪器、用具及试剂

　　5 . 1 仪器

　　电子天平(感量 0 . 001 g) 。

　　高速冷冻离心机(最大转速 15 000 r/ min) 。

　　小型瞬时离心机(最大转速 7 000 r/ min) 。

　　普通冰箱(4 ℃ ) 。

　　超低温冰箱(-80 ℃ ) 。

　　制冰机(每日制冰能力为 110 kg) 。

　　旋涡振荡器(最大转速 2 800 r/ min) 。

　　磁力搅拌器(搅拌容量 50 mL~2 000 mL) 。

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　　高压灭菌锅(最大压力为 0 . 235 MPa ,可调控温度范围为 105 ℃ ~135 ℃ ) 。

　　pH 计(量程 0.00~14.00, 精度 ±0.01)。

　　超净工作台(高效滤膜可除去 99 . 99%以上的 0 . 3 μm 粒子)。

　　PCR仪(温度范围 4 ℃ ~99 ℃ , 控温精度 ±0.25 ℃ )。

　　微波炉(烧烤型)。

　　电泳仪(输出电压 5 V~600 V,输出电流 2 mA~200 mA)。

　　电泳槽(长度 ×宽度 ×高度为 310 mm×150 mm×90 mm)。

　　凝胶成像分析仪(光强连续可调 302 nm 紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV 干涉滤光片、机载图像捕捉软件、图像分析软件)。

　　酶标仪(波长范围 340 nm~850 nm)。

　　5 . 2 用具

　　酶联板。

　　可调移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)。

　　可调移液器头。

　　离心管。

　　研钵、微型磨杵等。

　　5 . 3 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。

　　DAS-ELISA试剂见附录 B。

　　Dot-ELISA试剂见附录 C。

　　胶体金免疫层析测定试剂见附录 D。

　　RT-PCR检测试剂见附录 E。

　　实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 F。

　　6 取样

　　6 . 1 种子取样

　　6 . 1 . 1 防交叉污染

　　依据取样的大小，按种子的千粒重，取出小样的分量。 取样时要避免交叉污染，保持设备、台面、容器、手等的清洁。

　　6 . 1 . 2 待测种子的取样

　　种子的取样和病害的感染水平有关，为确保种传病害检测到的概率为 95%或 99%,可根据病害的感染水平或健康的容许水平来确定取样大小，具体可参见附录 G。

　　为保证感染水平在 0 . 1%以上的病种子检测到的概率为 95%,辣椒种子的最少取样量为 3 000 粒种子，每个小样的量最多为 250 粒种子。 可根据种子的千粒重来推算出所取样品的重量。

　　6 . 2 生长期植株取样

　　在植物的生长前期或中期，从具有典型花叶或斑驳症状的植株上采集叶片。

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　　7 检测鉴定

　　7 . 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　把制备的样品上清液加入已包被 PMMoV抗体的酶联板中，进行 DAS-ELISA 检测。 每个样品平行加到两个孔中。 健康的植物组织作为阴性对照，感染 PMMoV 的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致。 具体操作见附录 B。

　　7 . 2 斑点酶联免疫吸附测定

　　斑点酶联免疫吸附测定，见附录 C。

　　7 . 3 胶体金免疫层析测定

　　病叶中病毒的检测也可采用胶体金免疫层析测定，见附录 D。

　　7 . 4 RT-PCR检测

　　RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同 7 . 1,灭菌双蒸水作为空白对照。 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成 cDNA后进行 PCR检测，具体操作见附录 E。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。

　　7 . 5 实时荧光 RT-PCR检测

　　实时荧光 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同 7 . 1,灭菌双蒸水作为空白对照。 分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后进行实时荧光 PCR检测，具体操作见附录 F。 如采用商品化 一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。

　　7 . 6 接种反应

　　接种反应参见附录 H。

　　8 结果判定

　　样品检测流程及结果判定按下述原则进行：

　　— 酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阳性，同时 RT-PCR(或实时荧光 RT-PCR) 的检测结果为阳性，则判定样品携带 PMMoV;

　　— 酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阴性，则判定样品不携带 PMMoV。

　　9 样品保存与结果记录

　　9 . 1 样品保存

　　经检测确定携带 PMMoV 的样品应在适合的条件下保存以备复核。 种子应干燥低温保存，活体的病株在隔离温室中保存，其他的离体材料如叶片等样品可保存在- 80 ℃冰箱中。 做好登记和标记工作，保存期限至少 1 年 。

　　9 . 2 结果记录

　　记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。 DAS-ELISA 检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光 RT-PCR检测应有荧光曲线图。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　辣椒轻斑驳病毒其他信息

　　A.1 寄主范围

　　自然寄主主要为辣椒属植物(capsicum spp.) 。番茄和光烟草(Nicotianaglauca)之外的多数茄科植物易感染该病毒。PMMoV感染苋色藜(chenopodium amaranticolor)和昆诺阿藜(c.quinoa)引起局部褪绿斑，无系统感染。感染曼陀罗(Daturastramonium)、心叶烟(Nicotianaglutinosa)、白肋烟(N.tabacum cv.White Burley)、枯斑珊西烟(N.tabacum cv.Xanthi-nc)、林烟草(N.syl℃estris)产生局部坏死斑，无系统感染。感染 capsicum chacoense、c.praetermissum 引起严重的顶部坏死。

　　A.2 危害症状

　　引起辣椒植株矮化，叶片轻微褪绿，果实变小、畸形、斑驳。 有时果实上出现凹陷坏死区域。

　　A.3 分布

　　美国、加拿大、墨西哥、丹麦、冰岛、英国、法国、比利时、希腊、意大利、荷兰、西班牙、捷克、匈牙利、保加利亚、埃及、塞内加尔、赞比亚、埃塞俄比亚、南非、突尼斯、阿根廷、苏里南、巴西、委内瑞拉、安提瓜和巴布达、巴巴多斯、海地、牙买加、蒙塞拉特岛、圣卢西亚、特立尼达和多巴哥、巴拿马、澳大利亚、新西兰、土耳其、以色列、日本、韩国、中国。

　　A.4 传播方式

　　病毒可通过种子和机械接种传播，介体不易传毒。 病毒通过辣椒种子传播，病毒存在于种皮的外部，基本上不侵染胚乳。 种传率在 22%~29%,种子收获贮藏后种传率下降。 病种子、植株病残体和带病毒的土壤是病毒重要的侵染来源。 幼苗在田间移栽的过程中，容易被感染。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体直杆状，大小为 312 nm× 12 nm,粒体中央有明显轴心。 病毒蛋白亚基螺旋排列，螺距为

　　2 . 3 nm 。

　　A.6 基因组

　　单分体基因组，正单链 RNA,基因组 RNA 由 6 357 个核苷酸组成。 共有 4 个 ORF,编码 4 个蛋

　　白，分别为 126 kDa、183 kDa 病毒复制酶、30 kDa 细胞间移动蛋白和 17 . 5 kDa病毒外壳蛋白。

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　　A.7 致病型

　　辣椒属植物中有 L1 、L1a 、L2 、L3 、L4 等抗性基因。 烟草花叶病毒属病毒能否克服 L 基因介导的抗性，由病毒的致病型所决定，烟草花叶病毒属病毒有 P0、P1、P1,2、P1,2,3、P1,2,3,4 等 5 种致病型。 已发现PMMoV有 P1,2、P1,2,3、P1,2 ,3,4 等 3 种致病型，分别能够系统侵染带有 L2 、L3 、L4 抗性基因的辣椒。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　B.1 试材

　　B.1 . 1 酶联板的要求

　　使用质量有保证厂商生产的酶联板。

　　B.1 . 2 包被抗体

　　特异性的辣椒轻斑驳病毒抗体。

　　B.1 . 3 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的辣椒轻斑驳病毒抗体。

　　B.1 . 4 底物

　　对硝基苯磷酸钠(pNPP) 。

　　B.1 . 5 样品抽提缓冲液

　　PBST 1 L

　　亚硫酸钠(Na2 SO3) 1.3 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP,相对分子质量 24 000~40 000) 20 g

　　叠氮化钠 (NaN3) 0.2 g

　　调 pH 至 7.4 , 4 ℃储存。

　　B.1 . 6 包被缓冲液

　　碳酸钠 (Na2 CO3) 1.59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93 g

　　叠氮化钠 (NaN3) 0.2 g

　　调 pH 至 9 . 6,蒸馏水定容至 1 L, 4 ℃储存。

　　B.1 . 7 PBST缓冲液(洗涤缓冲液)

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　　牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉 2 . 0 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 (PVP,相对分子质量 24 000~40 000) 20.0 g

　　叠氮化钠 (NaN3) 0.2 g

　　调 pH 至 7.4 , 4 ℃储存。

　　B.1 .9 底物(PNPP)缓冲液

　　氯化镁 (MgCl2) 0.1 g

　　叠氮化钠 (NaN3) 0.2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　用盐酸调 pH 至 9 . 8,蒸馏水定容至 1 L, 4 ℃储存。

　　B.2 程序

　　B.2 . 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100 μL/孔，加盖，37 ℃孵育 2 h,清空孔中溶液，PBST洗涤 3 次，每次 3 min。

　　B.2 . 2 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 10(即 1 g样品加 10 mL抽提缓冲液)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2 000 r/ min离心 10 min,上清即为制备好的检测样品。 阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。

　　B.2 . 3 加样

　　加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100 μL/孔，加盖，4 ℃冰箱孵育过夜，取出的酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤 1 次，PBST洗涤 3 次，每次 3 min。

　　B.2 . 4 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100 μL/孔，加盖， 37 ℃孵育 4 h,酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤 1 次，PBST洗涤 3 次，每次 3 min。

　　B.2 . 5 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用)，按 100 μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。

　　B.2 . 6 读数

　　在不同的时间内如 30 min、1 h 、2 h、或更长时间，用酶标仪在 405 nm处读 OD值，或用肉眼观察显色情况。

　　B.3 结果判断

　　B.3 . 1 对照孔的 OD405 值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405 值小于 0 . 15,当阴性对照孔的 OD405 值小于 0 . 05 时，按 0 . 05 计算;阳性对照 OD405 值与阴性对照 OD405 值之比为 5~10;孔的重复性基本一致。

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　　B.3 . 2 在满足了 B. 3 . 1 质量要求后，结果原则上可判断如下：

　　样品 OD405 值与阴性对照 OD405 值明显大于 2,判为阳性;样品 OD405 值与阴性对照 OD405 值之比在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证;样品 OD405 值与阴性对照 OD405 值之比明显小于 2,判为阴性。

　　B.3 . 3 若满足不了 B. 3 . 1 质量要求，则不能进行结果判断。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　斑点酶联免疫吸附测定

　　C.1 试材

　　C.1 . 1 硝酸纤维素膜

　　硝酸纤维素膜的孔径为 0 . 45 μm。

　　C.1 .2 第-抗体

　　特异性的辣椒轻斑驳病毒抗体。

　　C.1 .3 酶标第二抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的种属特异性抗体，是抗某种动物的酶标抗体，能和第一抗体相结合。

　　C.1 .4 底物

　　四氮唑兰(NBT)

　　5-溴-4-氯-3 吲哚-磷酸盐(BCIP)

　　C.1 .5 PBS缓冲液

　　氯化钠 (NaCl) 8.0 g

　　磷酸氢二钠 (Na2 HPO4) 1.15 g

　　磷酸二氢钾 (KH2 PO4) 0.2 g

　　氯化钾 (KCl) 0.2 g

　　调 pH 至 7 . 4,蒸馏水定容至 1 L。

　　C.1 .6 PBST缓冲液(洗涤缓冲液)

　　用盐酸调 pH 至 9 . 0,蒸馏水定容至 1 L。

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　　C.2 程序

　　C.2 . 1 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 20(即 1 g 样品加入 20 mL PBS 缓冲液)加入 PBS 缓冲液，用研钵研磨成浆， 2 000 r/min离心 10 min,上清即为制备好的检测样品。 阴性对照、阳性对照作相应的处理。

　　C.2 . 2 点样

　　在硝酸纤维素膜上用铅笔画加样方格(5 mm×5 mm),在方格内分别点入 2 . 5 μL 的检测样品、阴性对照和阳性对照，晾干。 并做好标记。

　　C.2 . 3 封闭

　　膜在封闭缓冲液中 37 ℃振荡孵育 1 h。

　　C.2 . 4 加第一抗体

　　用封闭缓冲液稀释抗体，加入工作浓度的第一抗体，37 ℃振荡孵育 1 h。PBST 缓冲液洗涤 3 次 ~ 4 次，每次 3 min。

　　C.2 . 5 加酶标第二抗体

　　加入工作浓度的酶标第二抗体，37 ℃振荡孵育 1 h。 PBST 缓冲液洗涤 4 次 ~5 次，每次 3 min。

　　C.2 . 6 加底物显色

　　在 10 mL底物缓冲液中加入 66 μL 浓度为 50 mg/mL 的 NBT(溶于 70%的二甲基甲酰胺中)和33 μL浓度为 50 mg/mL 的 BCIP(溶于 100%的二甲基甲酰胺中)混匀。 室温避光条件下，将膜在其中振荡孵育，待充分显色后，用蒸馏水漂洗终止反应。

　　C.3 结果判断

　　C.3. 1 当阳性对照出现紫色斑点，阴性对照未出现紫色斑点时，若样品出现紫色斑点，则检测结果为阳性。

　　C.3.2 当阳性对照出现紫色斑点，阴性对照未出现紫色斑点时，若样品未出现紫色斑点，则检测结果为阴性。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　胶体金免疫层析测定

　　D.1 试剂

　　D.1 . 1 PBST样品抽提缓冲液 PH 7.4

　　亚硫酸钠 (Na2 SO3) 1.3 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 (PVP,相对分子质量 24 000~40 000) 20 g

　　氯化钠 (NaCl) 8.0 g

　　磷酸氢二钠 (Na2 HPO4) 1.15 g

　　磷酸二氢钾 (KH2 PO4) 0.2 g

　　氯化钾 (KCl) 0.2 g

　　吐温-20(Tween-20) 0.5 mL

　　溶于蒸馏水中，定容至 1 L。

　　D.1 .2 Tris-Hcl样品抽提缓冲液 PH 8.2

　　三羟甲基氨基甲烷 ( Tris) 1 . 2 g

　　亚硫酸钠 (Na2 SO3) 1.3 g

　　氯化钠 (NaCl) 8.0 g

　　氯化钾 (KCl) 0.2 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 (PVP ,相对分子质量 24 000~40 000) 20 g

　　吐温-20(Tween-20) 0.5 mL

　　溶于蒸馏水中，用盐酸调 pH 至 8 . 2,定容至 1 L。

　　D.2 操作步骤

　　样品制备方法同 B. 2 . 2 。

　　测试前将试纸条恢复至室温。 将试纸条含胶体金复合物的一端插入到样品中，样品液不要超过胶体金试纸条上的 Max线。 测试观察的时间以 10 min~20 min 为好，对于病原浓度低的样品可适当延长至 30 min或更长的时间。

　　D.3 结果判断

　　D.3 . 1 质控 C线显紫红色，测试 T线也显红色，检测结果为阳性(图 D. 1) 。

　　D.3 . 2 质控 C线显紫红色，测试 T线未显色，检测结果为阴性(图 D. 2) 。

　　D.3 . 3 质控 C线和测试 T线均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。

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　　图 D.1 阳性( +)结果

　　图 D.2 阴性( -)结果

　　D.4 贮存

　　试纸条应在 2 ℃ ~8 ℃冰箱内密封干燥保存。 使用时注意未用的试纸条密封。 以免吸湿而失效。

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　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测

　　E.1 试剂

　　E.1 . 1 核酸提取试剂

　　Trizol 或 RNA提取试剂盒。

　　E.1 . 2 电泳缓冲液 TAE(50 × )

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸(C2 H4 O2) 57.1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA ·2H2 O) 37.2 g

　　双蒸水定容至 1 000 mL,用时稀释至 1 × TAE。

　　E.2 检测步骤

　　E.2 . 1 核酸提取

　　称取 0 . 1 g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 1 . 5 mL离心管中，加入 1 mL 的 Trizol试剂，剧烈振荡 3 min; 4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min;将上清液移入一新离心管中，加入 0 . 5 mL 氯仿，猛烈振荡 15 s ; 4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加入等体积异丙醇，混匀;室温静置 10 min; 4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min,弃上清;加入 1 mL 75%的冷乙醇洗涤沉淀; 4 ℃ 10 000 r/min离心 10 min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于 30 μL DEPC 处理过的水中， -20 ℃保存备用。

　　注：此处核酸提取也可按照商品化 RNA提取试剂盒进行操作。

　　E.2 . 2 引物序列

　　正向引物(PMMoV-f) : 5′-AGAACTCGGAGTCATCGGAC-3′;

　　反向引物 (PMMoV-r) : 5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′。

　　扩增片段长度：576 bp。

　　E.2 . 3 反转录

　　反应体系：20 μL;在 0.2 mL PCR管中加入总 RNA 1 μL, dNTPs(10 mmol/L) 1 μL, DEPC处理过的水 10 μL,反向引物 PMMoV-r(20 μmol/L)2 μL, 70 ℃保温 5 min;冰上放置 5 min;再加入 5×反转录缓冲液 4 μL, RNA酶抑制剂(40 U/μL) 1 μL, M-MLV(200 U /μL) 1 μL, 42 ℃保温 1 h, 得到 cDNA

　　后用作 PCR 的模板。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

　　E.2 . 4 PCR扩增

　　反应体系：20 μL;在 0.2 mL PCR管中加入 10×PCR缓冲液(含 Mg2+ )2 μL, dNTPs(10 mmol/L)

　　0.6 μL,正向引物 PMMoV-f 及反向引物 PMMoV-r(均为 20 μmol/L) 各 0. 5 μL, Taq DNA 聚合酶

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　　(2 U/μL) 1 μL,模板 2 μL 和 DEPC处理过的水 13 . 4 μL。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

　　反应程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35 个循环;72 ℃ 7 min。

　　E.2 . 5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1 . 5 %的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR扩增产物，用 DNA 片段作为分子量标记，进行电泳。 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性 DNA条带，并拍摄记录。

　　E.3 结果判定

　　阳性对照在 576 bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现与阳性对照一致的条带，测定序列比对为 PMMoV 的，可判定为阳性。

　　阳性对照在 576 bp左右处有条带，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带，可判定结果为阴性。

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　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测

　　F.1 试剂

　　核酸提取试剂同 E. 1 . 1 。

　　一步法实时荧光 RT-PCR试剂。

　　F.2 引物探针

　　上游引物 (PMMoV-F) : 5′-TTAGATTTCCTGCTACTGGTTTCAA-3′

　　下游引物 (PMMoV-R) : 5 -CAGTTGTAGGATTTTGCGGATTT-3′

　　探针(PMMoV-Probe) : 5′-FAM-TGTCGGCACTTCTCGGAGCCTTTG-TAMRA-3′

　　F.3 核酸提取

　　方法同 E. 2 . 1 。

　　F.4 实时荧光 RT-PCR反应

　　反应体系：0 . 2 mL离心管中加入 2×一步法实时荧光 RT-PCR 试剂缓冲液 Ⅲ10 μL, Ex TaqHS (5 U/μL)0.4 μL, 反转录酶混合液 0. 4 μL, PMMoV-F ( 10 μmol/L) 0. 4 μL, PMMoV-R ( 10 μmol/L)

　　0.4 μL, PMMoV-Probe(10 μmol/L)0.6 μL, ROX参比染料 0.4 μL,模板 RNA 2 μL, 补 DEPC处理过的

　　水至 20 μL。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

　　反应程序：45 ℃ 10 min, 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 共 45 个循环。

　　F.5 结果判定

　　在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct 值 ≤ 30 并出现典型扩增曲线的条件下：

　　待测样品的 Ct值 ≥40 时，判定 PMMoV 阴性。

　　待测样品的 Ct值≤35 时，判定 PMMoV 阳性。

　　待测 样 品的 Ct 值 小 于 40 且 大 于 35 时，应 重 新 进 行 测 试;如 果 重 新 测 试 的 Ct 值 ≥ 40 , 判 定PMMoV 阴性;如果重新测试的 Ct值小于 40 且大于 35,且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。

　　GB/T 36780—2018

　　附 录 G

　　(资料性附录)

　　种子感染水平和取样量

　　种子的取样量见表 G. 1 。

　　表 G.1 种子的取样量

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　　附 录 H

　　(资料性附录)接种反应

　　H.1 试材

　　H.1 . 1 抽提缓冲液

　　氯化钠 (NaCl) 8.0 g

　　磷酸氢二钠 (Na2 HPO4) 1.15 g

　　磷酸二氢钾 (KH2 PO4) 0.2 g

　　溶于 1 L蒸馏水，调 pH 至 7.2~7.4。121 ℃ ,高压灭菌 15 min。

　　H.1 . 2 指示植物

　　辣椒轻斑驳病毒的指示植物心叶烟(Nicotianaglutinosa)或枯斑珊西烟(Nicotianatabacum cv.

　　Xanthi NN),需在光照充分，温度为 20 ℃ ~25 ℃的条件下培育。 选择具有 5 片 ~ 6 片真叶，长势良好的植株。

　　H.2 接种

　　H.2 . 1 抽提样品的接种

　　样品按 1 ∶ 10(即 1 g样品加入 10 mL抽提缓冲液)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆。 每个抽提样品接种 2 株植物，每株接种 2 片叶。 将 320 目 的金刚砂撒在指示植物植物的叶片上。 在叶片上加1 滴接种物(100 μL~200 μL),用带手套的手指轻抹。 接种不同的样品手套要同步更换，或者用碱性肥皂将手彻底洗干净。 接种后立即用自来水冲洗植株。

　　H.2 . 2 阳性和阴性对照的接种

　　辣椒轻斑驳病毒病汁液或提纯的病毒等可作为阳性对照。 样品抽提缓冲液或用健康样品的抽提液可作为阴性对照。 接种方法同 H . 2 . 1 。

　　H.3 培养

　　接种后的植物在温度为 20 ℃ ~25 ℃ ,不少于 12 h 的光照条件下，生长 5 d~7 d。 温度高于 28 ℃不利于发病显症。

　　H.4 结果检查

　　辣椒轻斑驳病毒接种心叶烟或枯斑珊西烟会产生枯斑。

　　若接种的样品在叶片上产生大量的枯斑，并且阴、阳性对照正常，则这些枯斑是可信的。

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　　若仅出现个别枯斑，则需将枯斑加少量的抽提缓冲液重复接种，以确认病毒的侵染性。 通常情况下由病毒侵染形成的枯斑再次接种时，会产生大量的枯斑。

　　必要时可用 ELISA确认接种的结果。

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　　参 考 文 献

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