GB/T 36781-2018 瓜类种传病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36781—2018

　　瓜类种传病毒检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofcucurbitseedtransmittedviruses

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36781—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国宁夏出入境检验检疫局、中国农业科学院郑州果树研究所、中国检验检疫科学研究院。

　　本标准主要起草人：陈红运、陈青、陈林、廖富荣、方志鹏、黄峰、古勤生、张永江、林石明。

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　　瓜类种传病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了瓜类作物上 5 种常见种传病毒 —黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottle mosaic℃irus，CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumbermosaic℃irus，CMV)、甜瓜坏死斑病毒(Melonnec- roticspot℃irus，MNSV)、南 瓜 花 叶 病 毒(squash mosaic℃irus，SqMV) 和 小 西 葫 芦 黄 花 叶 病 毒(zucchiniyello∞ mosaic℃irus，ZYMV) 的检测方法，规定了马铃薯 Y病毒科(poty℃iridae)、烟草花叶病毒属(Tobamo℃irus)和南方菜豆花叶病毒属(sobemo℃irus)的分子鉴定方法。

　　本标准适用于西瓜(citrullus℃ulgaris)、甜瓜(cucumismelo)、黄瓜(cucumissati℃us)、南瓜(cu- curbitamoschata)、瓠瓜(Lagenariasiceraria)、西葫芦(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)、苦瓜(Momordicacharantia)和丝瓜(Luffacylindrica)等瓜类作物种子的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　3 原理

　　血清学特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。 瓜类种传病毒的相关背景资料参见附录 A。

　　4 仪器、试剂及耗材

　　4 . 1 仪器与用具

　　酶标仪、洗板机、PCR 仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机、电子天平、电泳仪、电泳槽、微量移液器、研钵等。

　　4 . 2 试剂与耗材

　　酶联免疫吸附测定(ELISA) 试剂见附录 B, RT-PCR 检测试剂见附录 C。 各种规格的吸头、离心管、酶标版、PCR管等。

　　5 检疫与鉴定

　　5 . 1 抽样

　　按照 SN/T 2122 的规定执行。

　　5 . 2 制样

　　将种子播于灭菌土中，待长出 3 片 ~4 片真叶后，将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株

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　　分组(10 株为 1 组)编号。 采集真叶，将采集的叶片分成 2 份，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。

　　注：也可直接检测种子。

　　5 . 3 检测

　　5 . 3 . 1 病毒种类

　　瓜类种子检测的病毒种类见表 1 。

　　表 1 瓜类种子检测的病毒种类

　　5.3.2 ELISA检测

　　ELISA检测见附录 B。 ELISA测定结果为阳性的样品需进行 RT-PCR验证。

　　注：也可不经过 ELISA初筛检测，直接进行 RT-PCR检测。

　　5.3.3 RT-PCR检测

　　分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后，进行 PCR扩增。 健康的植物样品作阴性对照，感染特定病毒的植物样品作阳性对照，用水作空白对照。

　　具体操作见附录 C。

　　5 . 3 . 4 病毒科/属的鉴定

　　如显症植株针对特定病毒(CMV, CGMMV, MNSV, SqMV, ZYMV) 的检测结果为阴性，应对其进

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　　行病毒科/属的分子鉴定。 马铃薯 Y病毒科、烟草花叶病毒属和南方菜豆花叶病毒属的分子鉴定方法见附录 D。

　　6 结果判定

　　6 . 1 特定病毒的结果判定

　　酶联测定和 RT-PCR检测结果均为阳性，判定检出特定的病毒。

　　采用 RT-PCR直接检测样品时，扩增出预期大小的条带时，判定检出特定的病毒。

　　注：必要时，可进一步测序验证。

　　6 . 2 病毒科/属的结果判定

　　样品扩增出预期大小的条带，且测定的序列为相应病毒科/属的序列时，判定检出相应病毒科/属成员 。否则判定未检出。

　　注：必要时，可采用下一代测序技术(NGS)对病毒科/属鉴定结果为阴性的显症植株做进一步分析。

　　7 结果记录

　　记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。 酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳图片，必要时需附上测序结果。

　　8 样品保存

　　经检验确定携带病毒的样品应在合适条件下保存，种子保存在 4 ℃ ,病株在- 20 ℃或者- 80 ℃冰箱中保存，做好标记和登记。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　瓜类种传病毒特性

　　A.1 病毒种类

　　瓜类作物上的种传病毒见表 A. 1 。

　　表 A.1 瓜类作物上的种传病毒

　　A.2 基因组特征

　　A.2 . 1 马铃薯 Y病毒科

　　马铃薯 Y病毒科包括 8 个病毒属，除了大麦黄花叶病毒属为二分体粒子外，其他 7 个病毒属均为

　　单分体粒子。 马铃薯 Y病毒属(poty℃irus)是马铃薯 Y病毒科中最大的病毒属，有 146 种病毒。 poty- ℃irus病毒粒子 为 弯 曲 线 状，长 度 为 650 nm~ 900 nm, 直 径 11 nm~ 15 nm。 基 因 组 为 1 条 正 义ssRNA, 长度 8.5 kb~12 kb。

　　A.2 . 2 烟草花叶病毒属

　　病毒粒子长直杆状，长度 300 nm~310 nm,直径 18 nm。基因组为 1 条正义 ssRNA,长约 6.4 kb。

　　A.2 . 3 豇豆花叶病毒属

　　病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约 28 nm。 二分体基因组，由 RNA1 和 RNA2 组成。 RNA 的

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　　5’端连接 VPg,3’端为 Poly(A),两端各有 1 段非编码区。RNA1 长 5.9 kb~7.2 kb, RNA2 长 3.5 kb~

　　4 . 5 kb 。

　　A.2 . 4 麝香石竹斑驳病毒属

　　病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约 32 nm~35 nm。 单分体基因组，RNA 的 3’端无 Poly(A) , 5’端可能有一个甲基化的核苷酸帽子结构。

　　A.2 . 5 黄瓜花叶病毒属

　　病毒粒子为等轴对称的二十面体，直径约 29 nm。 三分体基因组，每个病毒粒子包裹有单分子的RNA 1 或 RNA2,或者包裹 RNA3 和 RNA4 。每个 RNA 片段的 5’端为甲基化帽子结构，所有 RNA 片

　　段的 3’端有一个约 200 nt 的同源区，3’端无 Poly(A),但为 tRNA状结构。

　　A.2 . 6 南方菜豆花叶病毒属

　　病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约 30 nm。 基因组为 1 条正义 ssRNA。

　　A.3 症状

　　A.3 . 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒

　　黄瓜：叶片斑驳并凸起，畸形，植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损。

　　西瓜：受侵染叶片轻型叶斑驳，严重时出现疱斑，植株矮化，成熟期果实表面出现浓绿色圆斑，果肉变色和腐烂。

　　甜瓜：茎端新叶出现黄斑，随叶片老化症状减轻。

　　瓠子：叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。

　　A.3 . 2 黄瓜花叶病毒

　　苗期染病子叶变黄枯萎，幼叶呈深绿与淡绿相间的花叶状，同时发病叶片出现不同程度的皱缩、畸形 。成株染病新叶呈黄绿相间的花叶状，病叶小且皱缩，叶片变厚，严重时叶片反卷;茎部节间缩短，茎畸形，严重时病株叶片枯萎;瓜条呈现深绿及浅绿相间的花色，表面凹凸不平，瓜条畸形。

　　A.3 . 3 甜瓜坏死斑病毒

　　被感染的子叶上出现坏死斑，3~5 天后扩展至 2 mm~3 mm。 随着植株的生长，叶片上出现系统性坏死斑点，发病严重时斑点部位坏死。

　　A.3 . 4 南瓜花叶病毒

　　严重的系统花叶，叶片和果实畸形;系统明脉、黄色镶脉和黄色斑点。

　　A.3 . 5 小西葫芦黄花叶病毒

　　褪绿局部斑，系统明脉，黄化，花叶，叶片畸形，矮化。

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　　B.1 试剂及配制

　　B.1 . 1 包被抗体

　　特异性的病毒抗体。

　　B.1 . 2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的病毒抗体。

　　B.1 . 3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(ρNPP) 。

　　B.1 .4 PBST缓冲液(PH 7.4)

　　NaCl

　　Na2 HPO4

　　KH 2 PO4

　　KCl

　　Tween-20

　　用水定容至 1 L。

　　B.1 .5 样品抽提缓冲液(PH 7.4)

　　Na2 SO 3

　　PVP (MW24 000~40 000)

　　NaN3

　　PBST定容至 1 L。4 ℃储存。

　　B.1 .6 包被缓冲液(PH 9.6)

　　Na2 CO 3

　　NaHCO 3

　　NaN3

　　用水定容至 1 L, 4 ℃储存。

　　B.1 . 7 酶标抗体稀释缓冲液(PH 7.4)

　　附 录 B

　　(规范性附录) DAS-ELISA检测

　　8 . 0 g

　　1 . 15 g

　　0 . 2 g

　　0 . 2 g

　　0 . 5 mL

　　1 . 3 g

　　20 . 0 g

　　0 . 2 g

　　1 . 59 g

　　2 . 93 g

　　0 . 2 g

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　　B.1 .8 底物(ρNPP)缓冲液(PH 9.8)

　　MgCl2 0.1 g

　　NaN3 0 . 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL水中，用 HCl 调 pH 值至 9 . 8,用水定容至 1 L。 4 ℃储存。

　　B.2 程序

　　B.2 . 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按要求稀释，在酶标板中每孔加 100 μL, 37 ℃孵育 2 h。 清空孔中溶液，PBST洗涤 3 次 。

　　B.2 . 2 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7 500 g 离心 10 min,上清即为制备好的检测样品。 阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空 白对照为样品抽提缓冲液。

　　B.2 . 3 加样

　　根据检测需要设计酶标板，包括 2 个阴性对照孔、2 个阳性对照孔、2 个空白对照孔和多个待测样品孔 。每孔加 100 μL,每个样品设 2 个重复，4 ℃冰箱孵育过夜。 清空孔中溶液，PBST洗涤 3 次 。

　　B.2 . 4 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按要求稀释酶标抗体，每孔加 100 μL, 37 ℃孵育 4 h。 清空孔中溶液，PBST洗涤 3 次 。

　　B.2 . 5 加底物

　　将底物 ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用)，每孔加 100 μL。 室温避光放置 30 min~60 min。

　　B.2 . 6 吸光值测定

　　阳性对照孔明显变色时，用酶标仪在 405 nm 波长读取吸光值。

　　B.3 结果判定

　　B.3 . 1 对照孔的 OD405 值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405 值<0 . 15 ;

　　阳性对照 OD405 值/阴性对照 OD405 值 >2 ;

　　同一样品的 OD405 值应基本一致。

　　B.3 . 2 在满足了 B. 3 . 1 质量要求后，结果原则上可判定如下：

　　样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值 >2,判定为阳性;

　　样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值接近阈值，判定为可疑样品，需重做一次或用 RT-PCR验证;

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　　样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值<2,判定为阴性。

　　B.3 . 3 若满足不了 B. 3 . 1 质量要求，则不能进行结果判定。

　　B.3 . 4 使用检测试剂盒时，应根据试剂盒的说明进行结果判定。

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　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C.1 试剂

　　加水定容至 1 L。 用时加水稀释至 1 × TAE。

　　C.2 实验步骤

　　C.2 . 1 总 RNA提取

　　称取 0 . 1 g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 1 . 5 mL 离心管中，加入 1 mL 的 TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀后室温保持 5 min; 4 ℃ , 12 000 g离心 10 min,取上清;加入 0.2 mL三氯甲烷并剧烈振荡混匀;4 ℃ , 12 000 g 离心 10 min,取上清;加 0 . 6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持 5 min; 4 ℃ , 12 000 g离心 10 min,弃上清;用 75%的乙醇洗涤沉淀，4 ℃ , 7 500 g离心 2 min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于 30 μL 水(DEPC处理)中，-20 ℃保存备用。

　　注：也可采用等效的试剂盒提取总 RNA。

　　C.2 . 2 RT-PCR扩增

　　C.2 . 2 . 1 CDNA合成

　　RT-PCR检测引物见表 C.1。cDNA合成体系 20 μL：在 0.2 mL反应管中加入总 RNA 6 μL, 1 μL下游引物(20 μmol/L),水 4 μL, 10 mmol/L dNTPs 1 μL, 65 ℃ 水浴 5 min, 取出后立即放在冰上，加入 5 × First Strand Buffer 4 μL, 40 U/μL RNase Block Ribonuclease Inhibitor 1 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL, 42 ℃水浴 2 min, 然后再加入 200 U/μL Reverse Transcriptase 1 μL, 混匀后 42 ℃水浴 50 min, 70 ℃水浴 15 min, 合成 cDNA。First Strand Buffer 和 Reverse Transcriptase 的用量需要依据反转录

　　酶的品牌进行调整。

　　注：也可采用一步法 RT-PCR试剂盒扩增。

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　　表 C.1 RT-PCR检测用引物

　　C.2.2.2 PCR扩增

　　PCR反应体系见表 C. 2 。PCR反应参数见表 C. 3 。

　　表 C.2 PCR反应体系

　　表 C.3 PCR反应参数

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　　表 C.3(续)

　　C.2 . 3 电泳

　　C.2 . 3 . 1 制备凝胶

　　配制 1 . 5%(质量 ∶ 体积)的琼脂糖凝胶。 溴化乙锭可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为 0 . 5 μg/mL) ,也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色。

　　C.2 . 3 . 2 电泳

　　用 1 μL 6×加样缓冲液与 5 μL样品混合，然后将其和适合的 DNA 分子量标准物分别加入到样品孔中。 电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。

　　C.3 结果判定

　　在阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照出现预期大小条带的情况下：

　　— 样品出现与阳性对照大小一致的条带，判定 RT-PCR检测结果为阳性。

　　注：必要时，可进一步测序验证。

　　— 样品未出现与阳性对照大小一致的条带，判定 RT-PCR检测结果为阴性。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　病毒科/属鉴定方法

　　D.1 试剂

　　见 C. 1 。

　　D.2 实验步骤

　　D.2 . 1 总 RNA提取

　　见 C. 2 . 1 。

　　D.2.2 RT-PCR扩增

　　D.2.2. 1 CDNA合成

　　病毒科/属鉴定所用引物见表 D. 1 。cDNA合成见 C. 2 . 2 . 1 。

　　表 D.1 病毒科/属鉴定用引物

　　D.2.2.2 PCR扩增

　　用于鉴定马铃薯 Y病毒科、烟草花叶病毒属、南方菜豆花叶病毒属的 PCR 反应体系与反应参数分别见表 D. 2、表 D. 3、表 D. 4 。

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　　表 D.2 马铃薯 Y病毒科 PCR体系

　　表 D.3 烟草花叶病毒属 PCR体系

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　　表 D.4 南方菜豆花叶病毒属 PCR体系

　　D.2 . 3 电泳

　　见 C. 2 . 3 。

　　D.2 . 4 测序

　　待检样品出现与阳性对照一致的扩增片段时，应对 PCR产物进行序列测定和分析。

　　D.3 结果判定

　　阴性对照和空白对照无特异性扩增，相应科/属病毒的阳性对照出现预期大小的条带：

　　— 样品出现与阳性对照大小一致的条带，且测定的序列为相应病毒科/属的序列，判定检出相应科/属的病毒。

　　— 样品出现与阳性对照大小一致的条带，但测定的序列非相应病毒科/属的序列，判定未检出相应科/属的病毒。

　　— 样品未出现与阳性对照大小一致的条带，判定未检出相应科/属的病毒。

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　　参 考 文 献

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