GB/T 36204-2018 肥料中赤霉酸含量的测定 高效液相色谱-质谱联用仪法

　　ICS 65 . 080 G 20

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36204—2018

　　肥料中赤霉酸含量的测定

　　高效液相色谱-质谱联用仪法

　　Determinationofgibberellicacidinfertilizer—Highperformanceliquid

　　chromatography-massspectrometrymethod

　　2018-05-14 发布 2018-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36204—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国石油和化学工业联合会提出。

　　本标准由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC 105)归口 。

　　本标准起草单位：山东省产品质量检验研究院、上海化工研究院有限公司、云南省化工产品质量监督检验站、贵州省产品质量监督检验院、河南省化工研究所有限公司、黑龙江省质量监督检测研究院、临沂市产品质量监督检验所、山东农大肥业科技有限公司。

　　本标准主要起草人：张娟、段路路、桂素萍、苏本玉、陈蕾、鞠福龙、钟宏波、窦兴霞、朱海荣、丁方军、陈萌、杜秀明、洪丽玲。

　　GB/T 36204—2018

　　肥料中赤霉酸含量的测定高效液相色谱-质谱联用仪法

　　1 范围

　　本标准规定了用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定肥料中赤霉酸的含量。

　　本标准适用于水溶肥料、复混肥料(复合肥料)、掺混肥料等肥料中赤霉酸含量的测定。

　　本方法赤霉酸的检出限为 0 . 1 mg/kg,定量限为 0 . 5 mg/kg。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 方法提要

　　样品用甲酸-甲醇溶液和甲酸溶液超声提取，以甲酸-甲醇溶液和甲酸溶液作为流动相，使用 C18 为填料的不锈钢色谱柱，用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪进行测定，外标法定量。

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 一般规定：本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂。 本标准中所使用的水，在未说明规格时，应符合 GB/T 6682 中的一级水规格。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯。

　　4 . 3 甲酸：色谱纯。

　　4 . 4 甲酸-甲醇溶液：准确移取 1 . 0 mL 甲酸(4 . 3) ,用甲醇(4 . 2)稀释至 1 L。

　　4 . 5 甲酸溶液：准确移取 1 . 0 mL 甲酸(4 . 3),用水稀释至 1 L。

　　4 . 6 初始流动相：甲酸-甲醇溶液(4 . 4)和甲酸溶液(4 . 5)以 1 ∶ 9 的比例混合均匀，现配现用。

　　4.7 赤霉酸标准品(Gibberellic acid, CAS 号为 77-06-5)：分子式：C19 H22 O6 。相对分子质量：346. 38。纯度 ≥99.0%。

　　4 . 8 赤霉酸标准储备溶液：准确称取赤霉酸标准品(4 . 7) 0 . 1 g(精确 0 . 1 mg) ,置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇(4 . 2)溶解并稀释至刻度，溶液浓度为 1 mg/mL,避光 0 ℃ ~2 ℃冷藏避光保存，有效期 3 个月。

　　4.9 赤霉酸标准工作溶液：将赤霉酸标准储备溶液(4 . 8) 用甲醇(4 . 2) 稀释成 1 μg/mL 的工作溶液，现配现用。

　　5 仪器与设备

　　5 . 1 高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI) 。

　　5 . 2 涡旋混合器。

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　　5 . 3 超声波清洗器。

　　5 . 4 高速离心机：转速高于 8 000 r/ min。

　　5 . 5 电子天平：感量 0 . 1 mg。

　　5.6 有机相微孔滤膜：0 . 22 μm。

　　5.7 离心管：50 mL。

　　5 . 8 实验室常用玻璃仪器。

　　6 测定步骤

　　6 . 1 平行试验

　　做两份试料的平行测定。

　　6 . 2 样品预处理

　　称取 1 g~2 g(精确至 0 . 1 mg)样品置于 50 mL离心管中，加入 20 mL初始流动相(4 . 6),用涡旋混合器均质 1 min后，室温下超声 30 min,放置于转速为 8 000 r/ min 的离心机内离心 5 min,转移全部上层清液至 25 mL容量瓶并用初始流动相(4 . 6)定容，摇匀后，取适量样品溶液经 0 . 22 μm 有机相微孔滤膜过滤，待测。

　　6 . 3 高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪参考条件

　　6 . 3 . 1 液相色谱参考条件：

　　a) 色谱柱：C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) 或相当者;

　　b ) 柱温：30 ℃ ;

　　c) 样品室温度：15 ℃ ;

　　d) 流动相：流动相 A— 甲酸-甲醇溶液(4 . 4)和流动相 B— 甲酸溶液(4 . 5),高效液相色谱梯度洗脱条件见表 1 ;

　　e) 流速：0.3 mL/min;

　　f) 进样量：5.0 μL。

　　表 1 高效液相色谱梯度洗脱条件

　　6 . 3 . 2 质谱参考条件：

　　a) 离子源：电喷雾离子源(ESI) ;

　　b ) 扫描模式：负离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测模式(MRM) ;

　　d) 离子源温度：550 ℃或相当;

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　　e) 雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气(纯度 ≥99 . 999%);使用前应调节各气体流量以

　　使质谱灵敏度达到检测要求，其他参考条件参见附录 A。

　　6 . 4 测定

　　6 . 4 . 1 标准工作溶液的配制

　　准确移取 0 mL、0. 1 mL、0. 2 mL、0. 5 mL、1.0 mL、2.0 mL 赤霉酸标准工作溶液(4. 9) 分别置于 10 mL 容量瓶中，用初始流动相(4 . 6) 定容，配制的标准工作溶液的浓度依次为 0 ng/mL、10 ng/mL、 20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。测定前配制。

　　6 . 4 . 2 定性测定

　　按 6 . 3 的仪器条件对标准工作溶液和试液进行分析，根据样品色谱峰的保留时间与标准品的保留时间相对照，样品与标准品保留时间的相对偏差不大于 5%;样品特征离子与标准品各特征离子相对照，样品特征离子的相对丰度与标准品的相对丰度偏差不超过表 2 的规定，则可判定样品中含有赤霉酸。

　　表 2 定性测定时相对离子丰度最大允许偏差

　　6 . 4 . 3 定量测定

　　采用外标法定量测定。 在仪器最佳工作条件下，测定标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，对应的标准工作溶液的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。 赤霉酸标准物质的提取离子质谱图参见附录 B 中的图 B. 1 。

　　取样品待测液，按照 6 . 3 仪器条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物响应值均应在仪器测定的线性范围之内。

　　6 . 5 空白试验

　　除不加试料外，均按上述操作步骤进行。

　　7 结果计算

　　赤霉酸的含量 xi，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算：

　　xi …………………………( 1 )

　　式中：

　　ci — 由标准曲线得到样品中赤霉酸的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　c0 — 由标准曲线得到空白试验中赤霉酸的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　vi—样品溶液(或稀释后)的总体积，单位为毫升(mL) ;

　　D — 样品稀释倍数;

　　m —样品质量，单位为克(g) 。

　　计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。

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　　8 方法回收率和精密度

　　8 . 1 回收率

　　本方法在线性范围内的添加浓度水平的回收率在 80%~120%之间。

　　8 . 2 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值(百分率)，应不大于表 3 中相应数值。

　　表 3 实验室内重复性要求

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　UPLC-MS/MS系统电喷雾离子源参考条件

　　UPLC-MS/MS 系统电喷雾离子源参考条件如下：

　　a) 电喷雾电压(IS) : 4 500 V;

　　b) 雾化气压力：55 psi,(1 psi= 6 894.757 Pa) ;

　　c) 气帘气压力：40 psi ;

　　d) 辅助加热气压力：55 psi;

　　e) 碰撞气压力(CAD) : 8 psi;

　　f) 离子对、解吸电压、碰撞气能量见表 A. 1 。

　　表 A.1 赤霉酸离子对、解吸电压、碰撞气能量

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　赤霉酸标准物质的提取离子质谱图

　　图 B.1 赤霉酸标准物质的提取离子质谱图