GB/T 35912-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35912—2018

　　猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光 RT-PCR检测方法

　　Real-timeRT-PCR methodfordetectionofporcinereproductive

　　andrespiratorysyndromevirus

　　2018-02-06 发布 2018-09-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35912—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、湖南圣湘生物科技有限公司、中国检验检疫科学研究院。

　　本标准主要起草人：张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、李树清、花群义、杨忠苹、李国新、王巧全、王艳、林颖峥、蔡开妹、喻正军、林祥梅、吴绍强。

　　GB/T 35912—2018

　　猪繁殖与呼吸综合征病毒

　　荧光 RT-PCR检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光 RT-PCR检测的操作方法。

　　本标准适用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒美洲型毒株核酸检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 25172 猪常温精液生产与保存技术规范

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　Real-time RT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应(real-time reverse transcript polymerase chain re-

　　action)

　　ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold)

　　RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　Taq酶：Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)

　　TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTA buffer)

　　DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)

　　PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)

　　PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution)

　　4 仪器

　　4 . 1 荧光 PCR检测仪。

　　4 . 2 高速台式冷冻离心机：可控温至 4 ℃、离心速度可达 12 000 r/ min 以上。

　　4 . 3 组织研磨器或者研钵。

　　4.4 普通冰箱：2 ℃ ~8 ℃。

　　4 . 5 超低温冰箱：可控温至- 70 ℃以下。

　　4.6 微量移液器：0.2 μL~2 μL、1 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL, 并配备与移液器匹配的吸头。

　　4 . 7 高压灭菌锅。

　　GB/T 35912—2018

　　5 耗材

　　5. 1 1.5 mL 无 RNA酶离心管。

　　5.2 0.2 mL PCR薄壁管或八联管。

　　6 试剂

　　6 . 1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。

　　6.2 Trizol,商品化 RNA抽提试剂，4 ℃ ~8 ℃保存。

　　6 . 3 氯仿：常温保存。

　　6 . 4 异丙醇：使用前预冷至 -20 ℃ 。

　　6 . 5 无水乙醇：-20 ℃预冷。

　　6 . 6 75%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20 ℃预冷。

　　6 . 7 DEPC水：配制见 A. 1,也可购买商品化 DEPC水。

　　6 . 8 PBS：配制见 A. 2 。

　　6.9 Taq酶及 10 倍 Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为 5 U/μL, Taq酶反应缓冲液中 Mg2+ 浓度为15 mmol/L。

　　6. 10 逆转录酶及 10 倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为 50 U/μL,-20 ℃保存，避免反复冻融。

　　6. 1 1 RNA酶抑制剂(40 U/μL) : -20 ℃保存，避免反复冻融。

　　6. 12 dNTPs：含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP各 10 mmol/L, -20 ℃保存，避免反复冻融。

　　6 . 13 引物和 TaqMan探针，其序列见附录 B。

　　6 . 14 猪繁殖与呼吸道综合征病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照为非感染性体外转录RNA;阴性对照为健康猪的组织材料。

　　6. 15 内参照质粒：带有人 β-珠蛋白基因的质粒。

　　7 样品采集和处理

　　7 . 1 采样工具

　　7 . 1 . 1 手术刀、剪刀、镊子，经 160 ℃干热灭菌 2 h。

　　7 . 1 . 2 注射器 。

　　7 . 1 . 3 一次性无菌采样拭子。

　　7 . 1 . 4 组织研磨器或者研钵，经 160 ℃干热灭菌 2 h。

　　7 . 1 . 5 真空采血管。

　　7 . 2 样品采集

　　7 . 2 . 1 血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5 mL, 置于无菌离心管内，室温或者37 ℃倾斜放置自然凝集 20 min~30 min, 2 000 r/min~3 000 r/min离心 10 min, 吸取上清液到新的离心管内备用。

　　7 . 2 . 2 公猪精液：按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。

　　7 . 2 . 3 口腔拭子：大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，用采样拭子蘸取口腔分泌物，放入无菌采样管中。

　　7 . 2 . 4 肺灌洗液：完整摘取肺脏/肺叶，送实验室进行灌洗。

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　　7 . 2 . 5 组织样品采集：取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏等组织，置于无菌离心管内备用。

　　7 . 2 . 6 细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后，将细胞培养物置于 1 . 5 mL无 RNA酶的灭菌离心管内，编号备用。

　　7 . 3 样品保存和运输

　　7 . 3 . 1 上述采集的样品可立即用于检测。 不能立即检测的样品，在 2 ℃ ~8 ℃下保存应不超过 24 h, -20 ℃ ± 5 ℃下应不超过 3 个月，- 70 ℃以下可长期保存。 样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。

　　7 . 4 样品处理

　　7 . 4 . 1 血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。

　　7.4. 2 口 腔 拭 子 样 品：加 入 500 μL 无 菌 PBS, 充 分 涡 旋 震 荡 1 min, 反 复 挤 压 拭 子，弃 去 拭 子 后3 000 r/min离心 5 min,取上清用于后续的核酸提取。

　　7 . 4 . 3 肺灌洗液：根据肺脏/肺叶的大小，通过肺管加入 5 mL~ 10 mL无菌 PBS,反复揉捏，吸取灌洗液，3 000 r/min离心 5 min,取上清用于核酸提取。

　　7 . 4 . 4 组织样品：取 1 g组织，剪碎，加入 2 mL 生理盐水进行研磨，制备组织匀浆，8 000 r/ min 离心5 min,取上清用于后续的核酸提取。

　　7 . 4 . 5 细胞培养物：4 000 r/ min, 4 ℃离心 10 min,取上清用于后续的核酸提取。

　　8 荧光 RT-PCR操作程序

　　8 . 1 RNA抽提

　　8 . 1 . 1 在核酸提取区操作。 RNA抽提使用 Trizol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒。

　　8 . 1 . 2 取 n 个灭菌的 1 . 5 mL无 RNA酶离心管，其中 n 为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。

　　8. 1 .3 每管先加入 600 μL Trizol 裂解液，再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL, 颠倒10 次混匀，最后加入 200 μL 氯仿，涡旋震荡 5 s, 4 ℃条件下 12 000 r/min 离心 15 min。

　　8. 1 .4 将上层透明液体(约 400 μL)转移到一个新的无 RNA酶的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，每个离心管对应编号。

　　8. 1 .5 12 000 r/min离心 15 min,弃去上清，沿管壁缓缓加入 0.8 mL~1 mL 75%乙醇，颠倒 3~6 次混匀，12 000 r/ min 离心 10 min。 反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。

　　8. 1 .6 加入 20 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解 RNA。 提取的 RNA 应尽快进行反转录扩增或放置于

　　- 70 ℃冰箱保存。

　　8 . 1 . 7 提取过程中要注意交叉污染，移液过程每份样品都需要更换吸头;不同样品离心管倒扣在吸水纸上的不同位置。

　　8 . 2 荧光 PCR检测

　　8 . 2 . 1 反应体系的配制

　　在试剂配制区进行。 设实时荧光 PCR 反应管数为 n，n 为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个反应的体系见附录 C,为了避免移液器取样损失，建议按 n+ 1 个反应进行配制。 配制反应液在冰盒中进行。

　　GB/T 35912—2018

　　8 . 2 . 2 反应液的分装

　　将 8 . 2 . 1 中配制的荧光 PCR反应液充分混匀，按照每管 44 . 8 μL分装于 0 . 2 mL透明 PCR管内，将PCR管置于 96 孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。

　　8 . 2 . 3 加样

　　在核酸提取区进行。 在每个 PCR反应管内加入 0 . 2 μL 的内参照质粒，并分别加入 8 . 1 制备的核酸5 μL RNA溶液，盖上盖子，500 r/min~1 000 r/min离心 30 s。转移至检测区。

　　8 . 2 . 4 上机检测

　　8 . 2 . 4 . 1 荧光通道设置

　　在检测区进行。 将 8 . 2 . 3 中离心后的 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，设置探针：5′选择 FAM、

　　HEX 和 ROX三个荧光通道，3′均选择无(None)荧光。

　　8 . 2 . 4 . 2 循环条件设置与检测

　　第一阶段，反转录 42 ℃ , 30 min;

　　第二阶段，预变性 95 ℃ , 1 min;

　　第三阶段，变性 95 ℃ / 15 s,退火、延伸、荧光采集 60 ℃ / 30 s, 40 个循环;

　　第四阶段，冷却 25 ℃ , 10 s。

　　检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和 ct值判定结果。

　　9 结果判定

　　9 . 1 阈值设定

　　阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。

　　9 . 2 质量控制

　　9 . 2 . 1 PRRSV 阴性对照：FAM通道无报告 ct值或无典型的 S 型扩增曲线，HEX通道无报告 ct值或无典型的 S 型扩增曲线，ROX通道 ct值 ≤36 且扩增曲线为典型的 S 型 。

　　9.2.2 PRRSV 阳性对照：FAM 通道 ct值 ≤30, HEX通道 ct值 ≤30, ROX通道 ct值 ≤36,且 3 个通道的扩增曲线均为典型的 S 型 。

　　9 . 2 . 3 9 . 2 . 1 和 9 . 2 . 2 要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　　9 . 3 结果描述及判定

　　9 . 3 . 1 被检样本检测结果中 FAM 通道 ct值 ≤38, HEX 通道 ct值 ≤38,且扩增曲线均为典型的 S 曲线，报告为 PRRSV美洲型变异株核酸阳性;38

　　9 . 3 . 2 被检样本检测结果中 FAM 通道 ct值 ≤40,且扩增曲线为典型的 S 型扩增曲线，HEX 通道无ct值或者无典型的 S 型扩增曲线，报告为 PRRSV美洲型经典株核酸阳性。

　　9 . 3 . 3 被检样本检测结果中 FAM 通道和 HEX 通道均无 ct值或无典型的 S 型扩增曲线，同时 ROX通道 ct值 ≤36 且扩增曲线为典型的 S 曲线，则该样本超过本方法检测灵敏度范围，报告为 PRRSV美洲型毒株核酸阴性。

　　9 . 3 . 4 被检样本检测结果中 FAM 通道和 HEX 通道均无 ct值或无典型的 S 型扩增曲线，同时 ROX通道 ct值 >36,则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　溶 液 配 制

　　A.1 DEPC水配制

　　每升去离子水中加入 1 mL DEPC,用力摇匀，使 DEPC充分混匀在水中，37 ℃放置 12 h 以上，再经121 ℃、15 min高压灭菌备用。

　　A.2 磷酸盐缓冲液(0.0 1 mol/LPBS，PH 7.4)

　　用 800 mL蒸馏水溶解 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2 HPO4 和 0.24 g KH2 PO4 。用 HCl调节溶液的 pH 至 7 . 4,加水至 1 L。 分装后经 121 ℃ 、15 min高压灭菌后备用。

　　GB/T 35912—2018

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　引物和探针

　　引物、探针的名称和序列见表 B. 1 。

　　表 B.1 引物、探针的名称与序列

　　注：引物和探针可由生物公司合成，用 TE溶液溶解并稀释至 100 μmol/L储存浓度，- 20 ℃保存备用;根据需要配制成 10 μmol/L工作液，- 20 ℃保存供检测使用。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　荧光 RT-PCR反应体系

　　荧光 RT-PCR反应体系见表 C. 1 。

　　表 C.1 荧光 RT-PCR反应体系