GB/T 35900.1-2018 动物流感检测 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35900 . 1—2018

　　动物流感检测

　　第 1 部分：H1 亚型流感病毒核酸荧光

　　RT-PCR检测方法

　　Animalinfluenzadetection—Part1：Methodofreal-timeRT-PCR forthe

　　detectionofH1 subtypeinfluenzavirus

　　2018-02-06 发布 2018-09-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35900 . 1—2018

　　前 言

　　GB/T 35900《动物流感检测》目前分为 3 个部分：

　　— 第 1 部分：H1 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR 检测方法;

　　— 第 2 部分：H3 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR 检测方法;

　　— 第 3 部分：H1 和 H3 亚型流感病毒核酸双重荧光 RT-PCR 检测方法。

　　本部分为 GB/T 35900 的第 1 部分。

　　本部分按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出。

　　本部分由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国农业大学。

　　本部分主要起草人：乔彩霞、谷强、高志强、刘环、蒲静、张鹤晓、刘金华、孙洪磊、张伟、张利峰。

　　GB/T 35900 . 1—2018

　　引 言

　　本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件 4 . 1 . 8 与“检测 H1 和 H3 亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒”相关的专利的使用。

　　本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

　　该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。 相关信息可以通过以下联系方式获得：

　　专利持有人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。

　　地址：北京市朝阳区甜水园街 6 号 。

　　请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

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　　动物流感检测

　　第 1 部分：H1 亚型流感病毒核酸荧光

　　RT-PCR检测方法

　　1 范围

　　GB/T 35900 的本部分规定了检测 H1 亚型流感病毒核酸的荧光 RT-PCR操作方法。

　　本部分适用于猪和禽及其产品中 H1 亚型流感病毒核酸的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19438 . 1—2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR 检测方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　荧光 RT-PCR 实时荧光反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcript polymerase chain re-

　　action)

　　Ct(或 Cp)值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数(cycle threshold, or crossing point)

　　cRNA 互补 RNA(complement RNA)

　　DEPC 焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)

　　FAM 羧基荧光素(carboxy fluorescein)

　　LNA 锁核酸(locked nucleic acid)

　　PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline)

　　RNA 核糖核酸(ribonucleic acid)

　　TAMRA 羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine)

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 试剂

　　4 . 1 . 1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无 RNA 酶的容器进行分装。

　　4. 1 .2 TRIzol: 2 ℃ ~25 ℃保存。

　　4. 1 .3 氯仿：2 ℃ ~8 ℃预冷。

　　4 . 1 . 4 异丙醇：-20 ℃预冷。

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　　4 . 1 . 5 DEPC水：见附录 A 中 A. 1 。

　　4 . 1 .6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC水配制，-20 ℃预冷。

　　4 . 1 . 7 PBS(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)：配方见 A. 2 。

　　4 . 1 . 8 引物、探针序列及反应液配方：见附录 B。

　　4. 1 .9 阳性对照为灭活的 H1 亚型动物流感病毒或体外转录的 H1 亚型流感病毒 HA 基因 cRNA 溶液;阴性对照为已知流感病毒阴性的动物组织悬液。

　　4 . 2 仪器设备及耗材

　　4 . 2 . 1 荧光 PCR 检测仪及配套反应管(板)。

　　4.2.2 高速台式冷冻离心机(最高离心速度不低于 12 000 r/min)。

　　4 . 2 . 3 台式离心机。

　　4 . 2 . 4 振荡器 。

　　4 . 2 . 5 组织匀浆器。

　　4.2.6 冰箱(2 ℃ ~8 ℃和-20 ℃两种)。

　　4.2.7 微量移液器(5 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL)及配套吸头(无核酸酶)。

　　4 .2 .8 1 .5 mL 离心管(无核酸酶)和 5 mL采样管。

　　5 实验室的标准化设置与生物安全管理

　　本方法的实验室设置与管理见 GB/T 19438 . 1—2004 附录 C;实验室生物安全管理见 GB 19489 。

　　6 样品的采集与前处理

　　6 . 1 总则

　　采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。

　　6 . 2 采样及处理工具

　　6.2. 1 采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5 mL采样管、一次性采样袋。

　　6.2.2 除棉拭子和采样袋外，上述取样工具应经 121 ℃ ± 2 ℃ , 15 min 高压灭菌并烘干或经 160 ℃干烤 2 h。

　　6 . 3 样品采集

　　6 . 3 . 1 拭子样品

　　活动物采集拭子样品。 根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子(禽类)或鼻拭子(猪)。采集方法如下：

　　— 取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮 2 次~3 次并旋转，取分泌液;

　　— 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便;

　　— 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮 2 次~3 次并旋转，取分泌物。

　　将采样后的拭子放入盛有 2 .0 mL PBS(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)的采样管中，编号。

　　6 . 3 . 2 组织样品

　　病死动物采集肺脏或气管等组织。 用无菌剪、镊采集待检组织，装入一次性采样袋或其他灭菌容

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　　器，编号。

　　6 . 4 样品贮运

　　样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，24 h 内送实验室。

　　6 . 5 样品处理

　　6 . 5 . 1 拭子样品

　　样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3 000 r/min 离心 5 min,吸取上清液 1.0 mL转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。

　　6 . 5 . 2 组织样品

　　用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 2.0 g 于研钵或组织匀浆器中充分研磨，再加 10.0 mL PBS(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)混匀，3 000 r/min 离心 5 min 后，取 1 .0 mL 上清液转入无菌 1 .5 mL

　　灭菌离心管中，编号备用。

　　6 . 6 样品存放

　　采集或处理好的样品在 2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存，应放置- 70 ℃冰箱，

　　但应避免反复冻融(冻融不超过 3 次)。

　　7 操作方法

　　7 . 1 样品核酸提取

　　7. 1 . 1 在样本制备区进行，采取 TRIzol 裂解法提取;也可采用其他等效的 RNA 提取方法。

　　7. 1 .2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n表示，取 n个灭菌 1.5 mL离心管，逐管编号。

　　7. 1 .3 每管加入 600 μL TRIzol。

　　7. 1 .4 每管对应编号分别加入 200 μL待检样品、阳性对照或阴性对照，混匀。

　　7. 1 .5 每管加入 200 μL氯仿，充分颠倒混匀。于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min。

　　7. 1 .6 新取 n个灭菌的 1.5 mL离心管，逐管编号，每管加入 500 μL 异丙醇(-20 ℃预冷)。

　　7. 1 .7 吸取本标准 7.1. 5 各管中的上清液 500 μL,转移至 7. 1. 6 相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。

　　7. 1 .8 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min,轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沥干。

　　7. 1 .9 每管加入 600 μL 75%乙醇( -20 ℃预冷)，颠倒洗涤。

　　7. 1 . 10 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min,轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沥干。

　　7. 1 . 1 1 4 000 r/min 离心 10 s,将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干。注意一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面。

　　7 . 1 . 12 室温干燥 3 min。不宜过于干燥，以免 RNA不溶。

　　7. 1 . 13 每管加入 11 μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA, 2 000 r/min 离心 5 s,获得 RNA 溶液，冰浴保存备用(4 ℃保存不超过 8 h,若需长期保存应放置-70 ℃冰箱)。

　　7 . 2 扩增试剂的准备与配制

　　7 . 2 . 1 在反应混合物配制区进行。

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　　7.2.2 每个检测反应体系需使用 15 μL荧光 RT-PCR 反应液。根据 7.1.2 中设定的 n值，按表 B.2 配制反应液，充分混匀后分装，每个反应管 15 μL。转移反应管至样本制备区。

　　7 . 3 加样

　　7 . 3 . 1 在样本制备区进行。

　　7.3.2 在上述 7.2.2 的反应管中分别加入 7.1.13 中制备的 RNA溶液 10 μL,使每管总体积达到 25 μL,记录反应管对应的样品编号。 盖紧管盖后，瞬时离心。

　　7 . 4 荧光 RT-PCR反应

　　7 . 4 . 1 在检测区进行。

　　7 . 4 . 2 将 7 . 3 . 2 加样后的反应管放入荧光 PCR 检测仪内，记录反应管摆放顺序。 选定 FAM 作为报告基团，TAMRA作为淬灭基团，反应参数设置如下：

　　— 第一阶段，反转录 42 ℃ / 30 min;

　　— 第二阶段，预变性 94 ℃ / 3 min;

　　— 第三阶段，94 ℃ / 15 s, 50 ℃ / 10 s, 60 ℃ / 35 s, 40 个循环，在第三阶段每次循环的 60 ℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct(或 CP)值判定结果。

　　8 结果判定

　　8 . 1 结果分析条件设定

　　阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。

　　8 . 2 实验成立的条件

　　8.2. 1 阴性对照无 Ct(或 CP)值并且无扩增曲线。

　　8.2.2 阳性对照的 Ct(或 CP)值应 ≤30,并出现典型扩增曲线(参见附录 C)。

　　8 . 2 . 3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次试验视为无效。

　　8 . 3 结果描述及判定

　　8 . 3 . 1 阴性

　　无 Ct(或 CP)值并且无扩增曲线，表示样品中无 H1 亚型流感病毒核酸。

　　8 . 3 . 2 阳性

　　Ct(或 CP)值 ≤30,且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在 H1 亚型流感病毒核酸。

　　8 . 3 . 3 有效原则

　　Ct(或 CP)值>30,且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，

　　否则判为阴性。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　溶液配制

　　A.1 DEPC水配方

　　将 DEPC加入去离子水(符合 GB/T 6682 要求)中至终浓度为 0.1%(体积分数)，充分混合均匀后作用 12 h,分装，121 ℃ ±2 ℃ 高压灭菌 30 min,冷却后冷藏备用。

　　A.2 磷酸盐缓冲液(PBS)配方(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)

　　A.2 . 1 A 液

　　0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2 PO4 · H2 O 27.6 g,溶于蒸馏水中，最后定容至 1 000 mL。

　　A.2 . 2 B 液

　　0.2 mol/L 磷 酸 氢二 钠 水 溶 液：Na2 HPO4 · 7H2 O 53. 6 g(或 Na2 HPO4 · 12H2 O 71. 6 g 或Na2 HPO4 ·2H2 O 35.6 g),加蒸馏水溶解，最后定容至 1 000 mL。

　　A.2.3 0.0 1 mol/L、PH 7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)的配制

　　取 A 液 14 mL、B 液 36 mL,加 NaCl 8.5 g,牛血清白蛋白 5 g,用蒸馏水定容至 1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分别按 10 000 U/mL加入青霉素和链霉素。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　引物探针序列及荧光 RT-PCR反应液配方

　　B.1 引物探针序列

　　H1 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR 检测方法所用的引物探针序列见表 B. 1 。

　　表 B.1 引物探针序列

　　B.2 荧光 RT-PCR反应液配方

　　H1 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR 反应液配方见表 B. 2 。

　　表 B.2 荧光 RT-PCR反应液配方

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　　B.3 注意事项

　　在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。

　　反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　典型扩增曲线示意图

　　H1 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR 检测方法阳性和阴性典型扩增曲线参见图 C. 1 。

　　图 C.1 H1 亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR典型扩增曲线示意图