GB/T 35520-2017 化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验

　　ICS 13 . 300 ; 1 1 . 100 A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35520—2017

　　化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验

　　Chemicals—Embryotoxicity—Embryonicstem celltest

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35520—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国化工经济技术发展中心、常州进出 口工业及消费品安全检测中心、宁波出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：李海山、陈会明、韩辉、崔媛、王晓兵、刘君峰、陈小青、程艳、艾文超、谢文平。

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　　引 言

　　小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ES)在不同的培养条件下会分化为不同的胚胎组织。 因此，一些研究小组使用小鼠 ES细胞进行体外胚胎毒性试验。 Laschinski 等[1] 比较了 ES 细胞和小鼠纤维母细胞的细胞毒性，以评估致畸物的潜在胚胎毒性。 Heuer等[2-3] 比较了 ES 细胞的细胞毒性和分化抑制。 Newall 和 Beedles[4] 测定了培养 7 d后，致畸物对 ES 细胞的细胞毒性和集落形成能力的影响，这适用于常规测试，因为集落形成这一终点可自动化完成。 在所有这些试验中，只有一些胚胎毒性物能够被正确分类。 这可能是由于在 ES试验中选择 2 个终点不足以评估胚胎毒性。

　　为克服上述 ES细胞试验的限制，Spielmann等[5] 确定了 3 个不同的试验终点(半数分化抑制浓度、 D3 细胞半数生长抑制浓度和 3T3 细胞半数生长抑制浓度)。根据这些终点可导出 3 个变量。 所得的 3 个变量作为受试物分为 3 个体内胚胎毒性等级的依据。 这种方法有利于给出胚胎组织与成体组织之间对化合物细胞毒性损伤的敏感性差异。 事实上，利用判别分析已将 16 种受试化学品正确归入已知的 3 种体内胚胎毒性等级[5-6] 。这是第一个不处死妊娠动物而获得体外培养所需胚胎组织的体外胚胎毒性测试。

　　在本标准中为验证研究制定的标准操作程序克服了实验室中 ES状态维持的问题，ES 细胞通常倾向于自发分化。

　　此外，根据制定的性能标准，欧盟替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alter- native Methods,ECVAM)验证研究表明体外数据和体内数据之间具有较好的相关性( 准确性 78%)。据报道，强胚胎毒性化学品的预测性(100%)极好、精确度(81%) 良好。 据报道，无胚胎毒性物质和胚胎毒性弱的物质的预测性(分别为 72%和 70%)和无胚胎毒性物质的精确度(70%)较高( ≥65%)[7] 。

　　然而，一个特例出现于强胚胎毒性化学品氯化甲基汞的错误分类，在 8 个试验中的 4 个试验里，被预测为无胚胎毒性的化学品，而不是强胚胎毒性的化学品。 这种误分类出现的原因可能是用于建立预测模型的训练集未包括具有类似细胞毒性模式的化学品[6] 。

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　　化学品 胚胎毒性 胚胎干细胞试验

　　1 范围

　　本标准规定了化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验的术语和定义、试验原理、试验方法、质量控制和结果评价。

　　本标准适用于应用胚胎干细胞试验测试化学品的胚胎毒性。

　　2 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　2.1

　　半数分化抑制浓度 medianinhibitionofdifferentiation

　　ID50

　　化学品抑制 50% ES 细胞分化为心肌细胞的浓度。

　　2.2

　　D3 细胞半数生长抑制浓度 medianinhibitionofgrowthofD3

　　IC50 D3

　　化学品抑制 50% ES 细胞系 D3 生长和活性的浓度。

　　2.3

　　3T3 细胞半数生长抑制浓度 medianinhibitionofgrowthof3T3

　　IC50 3T3

　　化学品抑制 50% 3T3 细胞生长和活性的浓度。

　　3 试验原理

　　胚胎毒性测试或用妊娠动物进行体内试验，或用培养的胚胎以及取自妊娠动物的胚胎组织、细胞进行体外试验。 不管体内还是体外测试，都得处死妊娠动物[8] 。利用胚胎干细胞体外培养无限增殖与分化的潜能，提出了一种利用小鼠永生化细胞系的体外胚胎毒性测试，即胚胎干细胞试验[9] 。

　　本试验是基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎组织和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与胚胎分化抑制密切相关。 使用两个永生化小鼠细胞系，ES 细胞(D3) 和纤维母细胞(3T3 细胞)分别表示胚胎组织和成体组织。 只有在添加小鼠白血病抑制因子(mLIF) 的培养条件下， ES 细胞保持在未分化阶段才可进行该试验。 去除未分化状态，ES 细胞会形成拟胚体(EB),并在适当条件下分化为主要胚胎组织。

　　细胞毒性数据表明，ES细胞比成体细胞对毒性药剂更敏感[1] 。ES 细胞分化抑制和 ES 细胞与 3T3细胞生长抑制是 EST 中用于预测化学品潜在胚胎毒性的 3 个选用的终点。

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　　4 试验方法

　　4 . 1 材料

　　4 . 1 . 1 细胞系

　　BALB/c 3T3 细胞，细胞克隆 A31 号，建议使用德国，Eschewege , ICN-Flow(编号：03-465-83)或美国典型培养物保藏中心(ATCC;编号：CCL-163) 。小鼠 ES 细胞 D3,建议使用 Rolf Kemler 教授(德国

　　弗莱堡马克斯 · 普朗克研究所)或美国典型培养物保藏中心(ATCC;编号：CRL-1934) 。若使用其他来源细胞，需验证其有效性。

　　4 . 1 . 2 主要设备

　　细胞培养箱(37 ℃ ± 1 ℃ , 5%±1% CO2)、层流洁净工作台、水浴槽(37 ℃ ± 1 ℃)、相差显微镜、

　　酶标仪、细胞计数器等。

　　4 . 1 . 3 化学品、培养基、血清

　　DMEM培养基、L-谷氨酰胺、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶/EDTA 溶液、青霉素/链霉素、二甲亚砜

　　(DMSO)、非必需氨基酸(NAA)、β-巯基乙醇(β-ME)、小鼠白血病抑制因子( m LIF)、噻唑蓝(MTT) 、

　　异丙醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、不含钙镁的磷酸盐缓冲液(PBS)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、青霉素 G、台盼蓝、乙醇等。

　　4 . 2 试剂的准备

　　4 . 2 . 1 小鼠白血病抑制因子

　　产品原液(mLIF)进行 ES细胞常规传代时直接加入培养板或培养瓶。 LIF溶液浓度为10 6 U/ mL, -20 ℃下分装储存。 解冻后，将分装 LIF溶液储存在 4 ℃ ( 1 年稳定)。如果使用浓度为 10 7 U/ mL 的LIF,则在 PBS(含 1% BSA)或细胞培养基中制备 1 ∶ 10 稀释液，并按照厂家说明书如上进行储存。

　　4 . 2 . 2 胎牛血清

　　FCS解冻后在 56 ℃下 30 min热灭活。

　　4.2.3 β-巯基乙醇

　　在 PBS 中制备 10 mmol/ L β-ME工作液，最长可使用 1 周(4 ℃储存)。

　　4 . 2 . 4 完全培养基

　　制备不含 LIF 的完全培养基。 完全培养基最长使用 1 周(4 ℃储存)。

　　完全培养基配方见表 1 。

　　表 1 完全培养基配方

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　　表 1(续)

　　4 . 2 . 5 MTT溶液

　　以 PBS制备 5 mg MTT/mL 储备溶液，过滤(0.2 μm),分装储存于 -20 ℃。

　　4 . 2 . 6 MTT裂解液

　　3 . 49 mL 20% SDS储备溶液(终浓度为 0 . 7%),加 96 . 51 mL 异丙醇。 临用现配(若出现沉淀物，加

　　热至 37 ℃ ) 。

　　4 . 3 试验步骤

　　4 . 3 . 1 ES细胞分化试验(ID50 测定)

　　4 . 3 . 1 . 1 受试化学品所用溶剂及最大试验浓度选择参见附录 A,浓度级数的设计参见附录 B。 溶剂终浓度应保持一致，无细胞毒性，不应对细胞分化产生任何其他影响。 所有化学品的最高受试溶度为1 000 μg/mL。不应使用完全培养基(含添加物)配制储备液，避免血清蛋白、受试化学品或其他成分反复冻融时产生沉淀。

　　4 . 3 . 1 . 2 进行各试验前对化学品称重和溶解，包括作为阳性对照的 5-FU。 第 3 天和第 5 天使用时(更换培养基)，可使用试验开始前制备的储备液(若在- 20 ℃分装储存)。 阳性对照和阴性对照化学品盘尼西林 G 可从 100 mg/mL PBS冷冻储备溶液中配制，阳性对照 5-FU 为固定浓度。

　　4 . 3 . 1 . 3 由于强酸和强碱可能会影响培养基的缓冲容量，培养基稀释后需通过光学检测给出化学品最高测试浓度的 pH 值 。如果培养基变为紫色或金黄色(pH>8 或 pH<6 . 5),应使用 0 . 1 mol/ L NaOH或 0 . 1 mol/ L HCl 中和受试化学品的储备溶液。

　　4 . 3 . 1 . 4 细胞分化试验按照附录 C 程序进行。 第 0 天，在测试培养基和含 ES 细胞的溶液(3 . 75 ×

　　104 细胞/mL) 中制备一定浓度序列的受试化学品。 在培养基中制备受试化学品后，最后添加胰蛋白酶消化 ES 细胞，以避免细胞在培养箱外放置时间过长。 在 60 mm 培养皿中制备 ES 细胞悬液，防止 ES细胞粘附。 在完成下列步骤时应不时轻微拍打细胞，使其悬浮，室温条件下放置时间尽可能短(将一小份细胞悬液进行台盼蓝染色试验，检测细胞活性。 活性 ≥90%可用于试验)。注意不应超出允许的溶剂最高浓度，保持受试化学品各浓度溶液中的溶剂浓度一致。 利用移液器将 20 μL含有适当受试化学品的细胞悬液(约 750 个细胞)分配到 100 mm 培养皿盖内面。 每盖吸移 50 滴 ~80 滴 。 每种浓度的受试化学品使用一个培养皿作为空白对照(测试培养基)和溶剂对照。 将盖子小心放回常规位置，并放在装满5 mL PBS 的培养皿顶部。 在 37 ℃含有 5% CO 2 的潮湿空气中培养 3 d。

　　4 . 3 . 1 . 5 第 3 天，制备第 0 天时同样测试液。 每种浓度的受试化学品使用一个培养皿作为空白对照(测 试培养基)和溶剂对照。 用移液管将 5 mL含有适当浓度的受试化学品或溶剂的培养基吸移到“悬滴”培养皿盖中。 拿着盖子，使其呈约 45°角，使 EB 冲洗到底部。 使用 5 mL无菌移液管(避免对 EB 造成 损害)，将整个悬液轻轻转移到 60 mm 培养皿中。 注意，“悬滴”的化学品浓度与培养皿相同。 在 37 ℃

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　　含有 5% CO 2 的潮湿空气中培养 EB悬液 2 d。

　　4 . 3 . 1 . 6 第 5 天，制备第 0 天时相同的测试液。 每种浓度的受试化学品使用一个 24 孔板作为空白对照(分析培养基)和溶剂对照。 将 1 mL 试液吸移至 24 孔组织培养板的各孔中。 每个孔添加一个 EB (40 μL)。注意，源于某种特定试液的 EB要转移到具有相同浓度的试液中。 在 37 ℃含有 5% CO 2 的潮湿空气中培养 5 d。

　　4 . 3 . 1 . 7 试验第 10 天，在光学显微镜下确定其是否分化为搏动的心肌细胞。 检查孔板的各个孔并记录含有自发收缩细胞的孔数量。 使用电子数据表(参见附录 D)进行数据记录。

　　4 . 3 . 2 细胞毒性试验(IC50D3 和 IC503T3 测定)

　　4 . 3 . 2 . 1 受试化学品浓度选择同 4 . 3 . 1 . 1 。最好应用倍比稀释准备一系列浓度(图 1) 。

　　图 1 受试化学品浓度倍比稀释示意图

　　4 . 3 . 2 . 2 确定浓度范围预试验使用受试化学品的最高可溶浓度和溶剂的无细胞毒性浓度作为最高测试浓度。 制备 8 种稀释液的稀释级数，每种稀释液的稀释倍数为 1 ∶ 10 。

　　4 . 3 . 2 . 3 主试验利用更小的稀释倍数制成 7 个浓度序列(参见附录 B),涵盖浓度范围预试验确定的剂量反应范围。 制备 1 种浓度的阳性对照化学品。 最小实际稀释倍数为 1 . 5 倍 。

　　4 . 3 . 2 . 4 由于挥发性化学品在测试条件下易挥发，因此孔板应用不透挥发性化学品的 CO 2 渗透性塑料薄膜密封，从而减少挥发。

　　4 . 3 . 2 . 5 细胞维护和培养按照附录 E 规定的操作程序进行。 细胞毒性试验按照附录 F 规定的程序进行 。第 0 天，在常规培养基中制备 1 × 10 4 细胞/mL 的细胞悬液。 使用多通道移液管将 50 μL培养基吸移至 96 孔组织培养微孔板的外围孔中(空白孔)。在剩余的孔内，装入 50 μL 1 × 10 4 细胞/mL 的细胞悬液(500 个细胞/孔)。将一小份细胞悬液进行台盼蓝着色试验，进行细胞活性检测。 活性 90%可用于试验。 在 37 ℃含有 5% CO 2 的潮湿空气中培养细胞 2 h。 培养 2 h后，添加 150 μL含有适当浓度的受试化学品(注意，150 μL应包含 1 . 333 倍终浓度的化学品)的测试培养基。 用移液管将 150 μL无化学品的测试培养基吸移至外围孔(空白孔)中。 在 5% CO 2 和 37 ℃条件下培养 3 d。

　　4 . 3 . 2 . 6 第 3 天，使用连接到泵的巴斯德移液管或多通道移液管移出试液(外围孔除外)。 注意不要破坏孔底部的细胞层。 添加 200 μL新鲜制备的试液(最终浓度/孔与第 0 天一样)。在 5% CO2/ 37 ℃下培养 2 d。

　　4 . 3 . 2 . 7 第 5 天，使用连接到泵的巴斯德移液管或多通道移液管移出试液(外围孔除外)。 再添加

　　200 μL新鲜试液(最终浓度/孔与第 0 天一样)。在 5% CO2/ 37 ℃下培养 5 d。

　　4 . 3 . 2 . 8 试验第 10 天时，测定细胞生长抑制情况。 在 550 nm~570 nm下利用微孔板检测仪测定所得

　　有色溶液的吸光度值，采用 630 nm作为参考波长。

　　4 . 4 独立运行

　　重复试验至少 1 次(2 次有效试验);试验开始前准备培养基与测试液;第 2 次实验中使用的试剂应

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　　独立准备。

　　5 质量控制

　　5 . 1 细胞质量控制

　　5 . 1 . 1 ES细胞分化试验

　　分化期(10 d)结束后，检查溶剂对照板。 如果 24 个 EB 中至少有 21 个分化为 自发收缩心肌细胞，则试验合格。

　　5 . 1 . 2 细胞毒性试验

　　细胞的正常生长行为是生长抑制为基础的所有细胞毒性试验的先决条件。 因此，进行 MTT 试验后第 10 天，检查溶剂对照孔(96 孔板第 2 列和第 11 列，见附录 G) 的绝对吸光度值(550 nm~570 nm条件下的 OD值)。根据历史资料，测试值应在表 2 置信范围内。

　　表 2 测定吸光度的置信区间

　　5 . 2 检测质量控制(阳性对照)

　　复苏一批冷冻细胞后、测试相关化学品前，使用 5-FU作为阳性对照化学品检查试验的质量。 通过 ES 细胞确定 ID50 值 。5-FU 最大测试浓度为 1 μg/mL,从浓度为 2 mg/mL 的 PBS 储存液开始稀释。

　　测定 ES 和 3T3 细胞的 5-FU 的 IC50 值。5-FU 对于 ES D3 细胞的 IC50 值范围应在 0. 048 μg/mL~

　　0.086 μg/mL, 5-FU对于 3T3 细胞的 IC50 值范围应在 0.12 μg/mL~0.5 μg/mL。

　　5 . 3 胎牛血清质量检测

　　首先在不使用化学品的分化试验中测试相关的 FCS批次，进行至少 2 次独立测试，结果应为 24 个孔中至少有 21 个搏动的心肌。 应使用已知质量较好的一批细胞进行测试。 然后，应根据阳性对照浓度测试 5-FU 至少 2 次 。

　　6 结果评价

　　6 . 1 一般性评价

　　评估结果以 2 个细胞系中测定的三个试验终点值ID50、IC50 D3 和 IC50 3T3 为基础。 可采用几种方法计算 ID50、IC50 D3 和 IC50 3T3 ：最简单的方法是使用概率作图法，x 为 log,y 为概率单位，其中 x 轴表示测试浓度，y 轴表示效应百分率。 模拟浓度反应曲线的生物统计方法能更加准确地计算 ID50 和 IC50 ,并且能够计算这些值的置信区间。

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　　6 . 2 终点计算

　　6 . 2 . 1 ES细胞分化试验

　　第 10 天时，确定 24 孔溶剂对照板中含有搏动心肌细胞的孔数量。 设定该数为 100%。 确定用 一定浓度的受试化学品进行处理的各孔板中含有收缩区域的孔数量。 计算溶剂对照板的分化抑制，以 %表示。 使用电子数据表(参见附录 D)进行数据记录。 计算 ID50 值 。

　　6 . 2 . 2 ES细胞和 3T3 细胞的细胞毒性试验

　　确定空白孔的平均 OD (550 nm~570 nm) ,从 96 孔板的所有 OD值中减去这个值(这样可正确计算关于染料对孔板塑料黏附性的所有值)。确定未经处理的溶剂对照的平均 OD (550 nm~570 nm) 。将该值设定为 100%细胞活性。 确定第 4 列到第 10 列(附录 G)各列的平均 OD (550 nm~570 nm),各列表示一种浓度的受试化学品。 将该值表示为细胞活性(空白对照组的%)。

　　6 . 3 数据记录

　　将酶标仪产生的吸光度数据文件直接传输/复制到 EXCEL 电子数据表中(参见附录 D) 。该电子数据表以标准格式保存数据，便于对不同实验室生成的数据进行生物统计评估。 可 自动计算平均 OD值、标准偏差和活性。 可根据电子数据表或利用各实验室使用的酶联免疫检测仪软件计算 IC50 值 。应填写模板所有字段。

　　6 . 4 分类

　　为预测受试 化 学 品 的 潜 在 胚 胎 毒 性，预 验 证 研 究 期 间 利 用 德 国 动 物 实 验 替 代 方 法 验 证 中心(ZEBET)获得的数据改进了最初提出的预测模型(PM) 。

　　6 . 4 . 1 终点

　　试验终点包括：

　　—IC50 3T3 ;

　　—IC50 D3 ;

　　—ID50 。

　　6 . 4 . 2 变量

　　计算变量包括：

　　—Ig(IC503T3) ;

　　—Ig(IC50D3) ;

　　— (IC503T3-ID50)/IC50 3T3 。

　　6 . 4 . 3 线性判别功能 Ⅰ 、Ⅱ 和 Ⅲ

　　采用式(1)、式(2)、式(3)分别计算函数 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ :

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　　6 . 4 . 4 分类标准

　　根据表 3 分类标准进行受试化学品的胚胎毒性分类。 16 种化学品历史对照数据参见附录 H。

　　表 3 化学品胚胎毒性分类标准

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　受试化学品溶解度预测试

　　受试化学品溶解度的预测试见图 A. 1 。

　　说明：

　　DMEM — 无添加培养基;

　　培养基 — 完全培养基;

　　细胞毒性和分化试验中要使用的溶剂最高终浓度应为：PBS 或 DMEM, 1% ;乙醇，0 . 5% ; PBS 中 50%乙醇，1% ; DMSO , 0 . 25% 。

　　图 A.1 受试化学品溶解度预测试方案

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　十进制几何浓度序列

　　一般情况下，剂量反应关系为非线性，但可通过 狓 轴对数变换在一定程度上使其线性化。 通过回归分析或图解估计计算 IC50 值需这样处理。

　　如果采用等差法确定剂量级数，狓 轴变换会导致测定点分布不均。 因此，建议采用几何浓度级数(固定稀释因子)。最简单的几何级数是对倍几何级数，如因子 2 。

　　Hackenberg 和 Bartling首先在毒理学和药理学研究中使用十进制几何浓度序列稀释法，其优点是便于比较剂量宽和剂量窄的独立试验，而且可一起计算。

　　如图 B. 1 所示，3 . 16 的稀释因子将 10~100 的一个 log单位分为等距离的 2 级，2 . 15 的稀释因子分为 3 级，1 . 47 稀释因子分为 6 级，1 . 21 稀释因子分为 12 级 。

　　图 B.1 十进制几何序列设计示例

　　因此，为实现更简便的数据生物统计评估，建议使用十进制几何浓度级数而非对倍几何级数。

　　十进制几何浓度级数很容易得出。 以因子 1 . 47 为例，加入 0 . 47 体积的稀释液稀释 1 体积的最高浓度的溶液，混合均匀，取 1 体积此溶液加入 0 . 47 体积的稀释液，如此类推。

　　由于浓度数量有限，使用在标度的两端(如 3 . 16 或 2 . 15)包含较大稀释步骤和预计IC50 附近(如1 . 47或 1 . 21)包含较小稀释步骤的浓度级数可能有用。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　ES细胞分化试验步骤

　　C.1 第 1 步

　　制备含浓度梯度受试化学品和 ES 细胞(3 . 75 × 10 4 个/mL) 的测试培养基，悬滴法培养细胞 3 d(每个浓度的受试化学品使用一个培养皿;以测试培养基为空白对照)，诱导 ES细胞集落形成。 见图 C. 1 。

　　图 C.1 悬滴培养

　　C.2 第 2 步

　　制备与第 1 步相同的测试培养基，细胞悬浮培养 2 d(每个浓度的受试化学品使用一个培养皿;以测试培养基为空白对照)，分化形成 EBs。 见图 C. 2 。

　　图 C.2 悬浮培养

　　C.3 第 3 步

　　制备与第 1 步相同的测试培养基，24 孔板贴壁培养 5 d(每个浓度的受试化学品使用一个孔;以测试培养基为空白对照)，EB分化为心肌细胞。 见图 C. 3 。

　　图 C.3 心肌细胞分化

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　数据记录用 EXCEL电子数据表

　　D.1 3T3 细胞 MTT试验记录

　　示例见图 D. 1 。

　　图 D.1 3T3 细胞毒性数据记录示例

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　　D.2 D3 细胞 MTT试验记录

　　示例见图 D. 2 。

　　图 D.2 D3 细胞毒性数据记录示例

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　　D.3 D3 细胞分化试验记录

　　示例见图 D. 3 。

　　图 D.3 D3 细胞分化数据记录示例

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　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　细胞维护和培养程序

　　E.1 ES细胞和 Balb/c3T3 细胞常规培养

　　E.1 . 1 培养条件

　　ES 细胞和 Balb/ c 3T3 细胞通常在培养皿或培养瓶内，37 ℃ / 5% CO 2 的潮湿空气中长成单细胞层 。每天在相差显微镜下检查细胞。 应注意形态或其贴壁特性的变化。

　　使用前，应在水浴器或培养器中将溶液预热至 37 ℃ 。

　　当细胞达到 80%融合时，用胰蛋白酶化从培养皿或培养瓶中消化下来，步骤如下：

　　— 轻轻吸弃培养基，并用不含钙和镁的 PBS清洗培养物 2 次 。

　　— 轻轻拍打，清洗细胞，去除可能会抑制胰蛋白酶活性的任何培养基添加剂。

　　— 弃去冲洗液。

　　E.1 . 2 ES细胞的胰蛋白酶消化

　　操作如下：

　　— 在单细胞层中添加 1 mL~2 mL预热的胰蛋白酶/EDTA溶液，保持几秒钟。

　　— 在胰蛋白酶/EDTA溶液中添加 6 mL培养基。

　　— 使培养瓶底部的剩余细胞重新悬浮。

　　— 在 800×g条件下用离心机分离细胞悬液 10 min。

　　E.1 .3 Balb/c3T3 细胞的胰蛋白酶消化

　　操作如下：

　　— 在单细胞层中添加 1 mL~2 mL预热的胰蛋白酶/EDTA溶液，保持几秒钟。

　　— 去除多余的胰蛋白酶/EDTA溶液，在 37 ℃下培养细胞。

　　— 2 min 到 3 min后，轻敲培养瓶或培养皿，使细胞分离为单个细胞悬液。

　　E.2 细胞计数

　　操作如下：

　　— 用离心机分离并弃上层清液或分离细胞后，添加 0 . 1 mL~0 . 2 mL 常规培养基/cm2 。如果想要开始分化试验，在这一步所得到的 D3 细胞密度不得低于 1 × 10 6 细胞/mL。

　　— 通过轻轻拍打使单细胞层分散。 重要的是获得单个细胞悬液，以进行正确计数。

　　— 使用血球计或细胞计数器计算得到的细胞悬液样品。

　　E.3 传代培养

　　确定细胞数量后，培养物可传代培养或者在试验中使用。 通常每 2 d~ 3 d 在细胞密度约为 5 × 104 细胞/mL(1 × 104 细胞/cm2 ) 的条件下传代 ES 细胞和 Balb/c 3T3 细胞。对 ES细胞使用 25 cm2 方

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　　瓶或培养皿(60 mm) ,对 3T3 细胞使用 75 cm2 方瓶或培养皿(100 mm ) 。

　　E.4 冻存

　　ES 细胞和 Balb/ c 3T3 细胞可装入无菌冻存管，储存在液氮中。 DMSO 用作低温防护剂。 操作如下：

　　— 在 200g 下用离心机分离胰蛋白酶化细胞 10 min。

　　— 丢弃上层清液，使细胞在浓度为 1 × 10 6 细胞/mL~5 × 10 6 细胞/mL 的冷冻培养基中重新悬浮，每个冻存管装入 1 mL 细胞悬液。

　　— 以 1 ℃ / min 的冷冻速率冷冻细胞直到达到- 70 ℃ ~-80 ℃ 。可通过不同的技术实现。

　　— 将冻存管放入液氮进行储存。

　　E.5 复苏

　　按下述顺序操作：

　　— 将安瓶放在 37 ℃的水浴中，使细胞解冻。 时间尽可能短。

　　— 使细胞在常规培养基中重新悬浮，用离心机分离，去除 DMSO。 轻轻倒出上层清液，使细胞团块在常规培养基中重新悬浮。 使用经过明胶处理的培养皿可大大改善解冻后 ES 细胞对孔板的附着性。 对于常规培养(首次传代后)，使用未经过明胶处理的培养皿。

　　— 在 37 ℃含 5 % CO 2 的潮湿空气中培养。

　　— 在细胞毒性测试中使用细胞前进行 2 次 ~3 次传代。

　　— 复苏后，细胞应维持 25 次传代以下(即 2 个月，每周 3 次传代)。

　　GB/T 35520—20 17

　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　细胞毒性试验(ES和 3T3 细胞)步骤

　　试验步骤见图 F. 1 。

　　图 F.1 细胞毒性试验步骤

　　GB/T 35520—20 17

　　附 录 G

　　(规范性附录)

　　细胞毒性试验孔板设置方案

　　在每个孔板中，对一种受试化学品使用如下所示设置方案(图 G. 1) :

　　说明：

　　CO — 溶剂对照;

　　b —空白孔(测试培养基);

　　P — 阳性对照。

　　注：第 4 列 ～第 10 列为受试化学品从低浓度到高浓度。

　　图 G.1 细胞毒性试验孔板设置方案

　　GB/T 35520—20 17

　　附 录 H

　　(资料性附录)

　　历史数据

　　在 ZEBET/BgVV测试的以下 16 种化学品是研发预测模型的数据依据。 所有化学品均被正确分类。表 H . 1 给出了汇总信息，有助于在其他实验室参考。

　　表 H.1 16 种化学品历史数据

　　GB/T 35520—20 17

　　参 考 文 献

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　　[2] Heuer J , Graeber IM, Pohl I, Spielmann H (1994) . Culture system for the differentiation of murine embryonic stem cells-a new approach to in vitro testing for embryotoxicity and for develop - mental immunotoxicology. European Medicines Research; Perspectives in Pharmacotoxicology and Pharmacovigilance; Serialtitle : Biomedical and Health Research 7 , 134-145

　　[3] Heuer J , Graeber IM, Pohl I, Spielmann H (1994) . An in vitro embryotoxicity assay using the differentiation of embryonic mouse stem cells into haematopoietic cells. Toxicology in Vitro 8 , 558-587

　　[4] Newall , D.R. and Beedles , K.E. (1994) . The stem-cell test—A novel in vitro assay for ter- atogenic potential. Toxicology in Vitro 8 , 697-701

　　[5] Spielmann H. , Pohl I. , Dring B , Liebsch M and Moldenhauer F. (1997) . The embryonic stem cell test, an in vitro embryotoxicity test using two permanent mouse cell lines : 3T3 fibroblasts and embryonic stem cells. In Vitro Toxicology; a Journal of Molecular and Cellular Toxicology 10(1) , 119-127

　　[6] Genschow E, Spielmann H , Scholz G, Seiler A, Brown N , Piersma A, Brady M, Clemann N , Huuskonen H , Paillard F , Bremer S , Becker K (2002) . The ECVAM International Validation Study on In Vitro Embryotoxicity Tests : results of the definitive phase and evaluation of Prediction Models. Alternatives to Laboratory Animals (ATLA) 30 , 151-176

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