GB/T 34331-2017 黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法

　　ICS 7 1 . 040 . 40 G 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 34331—2017

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜

　　检测方法

　　Testmethodofcucumbergreenmottlemosaicvirus

　　bytransmissionelectronmicroscopy

　　2017-10-14 发布 2018-09-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 34331—20 17

　　GB/T 34331—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC 38)提出并归口 。

　　本标准起草单位：浙江大学、浙江省植物保护检疫局、浙江省农业科学院。

　　本标准主要起草人：洪健、黎军英、吴建祥、周雪平、王荣洲、谢礼、宋西娇。

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　　引 言

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaic℃irus，CGMMV)是侵染西瓜、黄瓜、甜瓜、葫

　　芦等葫芦科作物的重要检疫性病毒病原，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。 该病毒侵染西瓜引起的褪绿斑驳病，给西瓜产业造成严重威胁。 典型的 CGMMV 为直径 18 nm, 长度300 nm 的刚直杆状粒子，在病毒分类学上归属于植物杆状病毒科(virga℃iridae)、烟草花叶病毒属( Tobamo℃irus)(附录 A) 。应用透射电子显微镜可观察其形态结构以及在细胞内的分布特征，是辅助于血清学检测和分子生物学检测的重要形态学诊断依据。 为了正确指导黄瓜绿斑驳花叶病毒形态学检测诊断工作，有必要制定该病毒的透射电子显微镜检测方法国家标准。

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　　黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜

　　检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了应用透射电子显微镜对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行形态学检测的技术要求和规范。

　　本标准适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检疫与鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 28071—2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

　　SN/T 2122—2015 进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　SN/T 2964—2011 植物病毒检测规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　病毒 virus

　　一种由核酸和蛋白质外壳组成，具有侵染活性并能够自我复制的细胞内寄生病原生物。

　　3.2

　　病毒粒子 virion

　　复制、装配完善的成熟病毒颗粒。

　　3.3

　　负染色 negativestain

　　利用高密度的重金属盐染色液(如磷钨酸、醋酸铀等)染色后，将微小的试样颗粒包围起来，在暗背景下显示试样的形态及微细结构。

　　3.4

　　超薄切片 ultrathinsection

　　应用超薄切片机将树脂包埋的生物试样切成厚度为 50 nm~100 nm 的薄片，经电子染色后用于透射电镜观察。

　　3.5

　　免疫电子显微术 immunoelectronmicroscopy

　　利用抗原抗体特异性结合的原理，以抗体捕获抗原或胶体金标记的抗体为探针在透射电镜或扫描电镜超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。

　　4 仪器设备、试剂和材料、环境条件

　　4 . 1 仪器设备

　　4 . 1 . 1 透射电子显微镜。

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　　4 . 1 . 2 超薄切片机。

　　4 . 1 . 3 玻璃制刀机。

　　4 . 1 . 4 超薄切片钻石刀。

　　4 . 1 . 5 高速离心机。

　　4 . 1 . 6 正置光学显微镜。

　　4 . 1 . 7 研钵 。

　　4 . 1 . 8 微型研磨器。

　　4 . 1 . 9 涡旋振荡仪。

　　4 . 2 试剂和材料

　　4 . 2 . 1 戊二醛(分析纯)。

　　4 . 2 . 2 四氧化餓(结晶体)。

　　4 . 2 . 3 丙酮(分析纯)。

　　4 . 2 . 4 乙醇(分析纯)。

　　4 . 2 . 5 环氧树脂包埋剂。

　　4 . 2 . 6 醋酸铀(分析纯)。

　　4 . 2 . 7 柠檬酸铅(分析纯)。

　　4 . 2 . 8 磷钨酸(分析纯)。

　　4 . 2 . 9 亚甲基蓝。

　　4 . 2 . 10 CGMMV 多抗血清。

　　4.2. 1 1 PCR检测离心管(0.5 mL、1.5 mL)。

　　4.2. 12 Parafilm 膜。

　　4 . 2 . 13 包埋管 。

　　4 . 2 . 14 硅胶包埋板。

　　4.2. 15 覆 Formvar膜的电镜铜网。

　　4 . 3 环境条件

　　超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间，工作环境应符合以下要求。

　　超薄切片机：相对湿度小于 60%,温度(20±5) ℃, 电源电压稳定(220±22)V,满足防震要求。

　　透射电镜：相对湿度小于 60%,温度(20±5) ℃, 电源电压稳定(220±22) V,具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。

　　5 试样

　　5 . 1 试样来源

　　5 . 1 . 1 西瓜、黄瓜、甜瓜和葫芦等葫芦科植物的种子。

　　5 . 1 . 2 田间受 CGMMV侵染的葫芦科植物的叶、茎、花、根等新鲜材料。

　　5 . 1 . 3 人工接种 CGMMV 的鉴别寄主和繁殖寄主植物。

　　5 . 2 取样要求

　　5 . 2 . 1 进出境植物检疫的取样按照 SN/T 2122—2015 的规定执行。

　　5 . 2 . 2 田间作物取样及试样处理按照 SN/T 2964—2011 的规定执行。

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　　5 . 3 试样预处理

　　5 . 3 . 1 组织粗汁液试样：将呈现明显斑驳花叶症状的植物组织 1 g 与 1 mL 0 . 05 mol/ L 磷酸缓冲液(pH 值 7 . 0)混合，在研钵或微型研磨器中研磨，过滤或离心后获得粗汁液。 种子剥皮去仁后，将种皮于液氮中研磨制备组织粗汁液，也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液。 磷酸缓冲液的配制参见附录 B。

　　5 . 3 . 2 提纯病毒试样：将分离提纯的 CGMMV用双蒸馏水或 0 . 01 mol/ L 的磷酸缓冲液(pH 值 7 . 0) 稀释至适合电镜清晰观察的浓度。

　　5 . 3 . 3 超薄切片试样：采集呈现明显斑驳花叶症状的感病植物叶片，取病叶的退绿黄化边缘部位供超薄切片前处理之用。

　　5 . 4 电镜试样制备

　　5 . 4 . 1 负染色技术

　　5 . 4 . 1 . 1 悬滴法：以镊子夹持铜网，用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在覆膜的铜网上，然后用滤纸片从铜网边缘吸掉多余液体，待液体干燥前，采用 2%(w/v)磷钨酸负染色液(pH 值 6 . 8) 进行负染色，染色时间 1 min~2 min,干燥后待检。 负染色液的配制参见附录 B。

　　5 . 4 . 1 . 2 漂浮法：在培养皿内铺上 Parafilm膜，用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在 Parafilm 膜上;将铜网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上静置 1 min~2 min,然后夹起铜网，用滤纸片从铜网边缘吸除多余液体，再将铜网膜面朝下放置于在 2%(w/v)磷钨酸负染色液滴(pH 值 6 . 8)上进行负染色，染色时间1 min~2 min, 干燥后待检。

　　5 . 4 . 2 免疫电子显微术(免疫吸附法)

　　5.4.2. 1 在培养皿内铺上 Parafilm膜，用移液器吸一滴 1 ∶ 10~1 ∶ 100 倍稀释的 CGMMV 多抗血清滴在 Parafilm膜上;将铜网膜面朝下放置于多抗血清液滴上，在培养皿中保湿 15 min。

　　5 . 4 . 2 . 2 用 20 滴 0 . 05 mol/ L 的磷酸缓冲液(pH 值 7 . 0)连续滴洗铜网，洗除多余抗血清。

　　5 . 4 . 2 . 3 用滤纸片吸掉余液后，将铜网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上，在培养皿中保湿反应 30 min (如种子的病毒含量低，反应时间可延长至数小时或过夜)。

　　5 . 4 . 2 . 4 反应结束后用 20 滴 0 . 05 mol/ L 的磷酸缓冲液、30 滴双蒸馏水先后连续滴洗试样铜网。

　　5 . 4 . 2 . 5 用滤纸片吸除余液后，以 2%(w/v)磷钨酸(pH 值 6 . 8)负染色，干燥后待检。

　　5 . 4 . 3 超薄切片试样制备

　　5.4.3. 1 前固定：将疑感染 CGMMV 的植物组织切成 1 mm×1 mm×3 mm 的小块，置于 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 值 7 . 2)配制的 2%~3%(v/v)戊二醛固定液进行前固定，在 4 ℃下固定 2 h。 戊二醛固定液的配制参见附录 B。

　　5.4.3.2 漂洗：用 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 值 7.2)充分漂洗三次，每次 10 min~15 min。

　　5 . 4 . 3 . 3 后固定：经过漂洗后的试样置于 0 . 1 mol/L磷酸缓冲液(pH 值7 . 2)配制的 1%(w/v)四氧化餓固定液后固定，在 4 ℃下固定 1 h~2 h;再用相同缓冲液充分漂洗三次，每次 10 min~15 min。 四氧化餓固定液的配制参见附录 B。

　　5.4.3.4 脱水：采用 50%、70%、80%、90%、95%、100%(v/v)的乙醇进行梯度脱水，各浓度脱水时间为10 min~15 min。然后用纯丙酮脱水 2 次，每次 30 min。

　　5 . 4 . 3 . 5 浸透与包埋：试样脱水后在纯丙酮包埋剂(1 ∶ 1)浸透 1 h,再 (1 ∶ 3) 浸透 3 h,然后在纯包埋剂中浸透 12 h 以上。 用包埋管或硅胶包埋板进行试样包埋。 推荐采用Spurr’s低黏度包埋剂或Epon 812 包

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　　埋剂。 两种包埋剂的配制参见附录 B。

　　5 . 4 . 3 . 6 聚合：包埋后的试样在包埋聚合器或恒温烘箱内进行加温聚合。

　　5 . 4 . 3 . 7 修块：聚合后的包埋块修成易于超薄切片的形状。

　　5.4.3.8 定位：包埋块在超薄切片机上用玻璃刀进行半薄切片，切片厚度为 0.5 μm~1 μm,经 1%(w/v)亚甲基蓝染色后在正置光学显微镜下进行病变细胞定位。

　　5 . 4 . 3 . 9 超薄切片：修块和定位后的包埋块在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片，切片厚度50 nm~100 nm,用电镜专用铜网捞取超薄切片。

　　5 . 4 . 3 . 10 染色：采用 2%(w/v)醋酸铀乙醇溶液和柠檬酸铅在室温下对超薄切片进行双重染色，醋酸铀染色时间 15 min~ 30 min, 柠檬酸铅染色时间 5 min~ 10 min, 干燥后待检。 染色液的配制参见附录 B。

　　6 透射电子显微镜检测步骤

　　6 . 1 按照透射电镜操作程序开机，抽真空至正常工作状态，调整仪器至最佳工作状态。

　　6.2 推荐加速电压范围：60 kV~80 kV。

　　6.3 推荐放大倍率范围：4 000 倍 ~20 000 倍。

　　6 . 4 悬液病毒试样的透射电镜观察：低倍率(4 000 倍左右)下选择负染色剂着色的电子密度较大斑点或斑块，观察样品全貌。 逐步提高放大倍率，寻找具有典型杆状形态特征的病毒粒子，图像精细聚焦后用 CCD相机记录并储存(或者用电子底片进行拍照)。CGMMV粒子的典型形态参见附录 C。

　　6 . 5 超薄切片试样的透射电镜观察：电镜低倍率模式(50 倍 ~ 1 000 倍)寻找切片，切换到正常放大模式观察病变的细胞。 逐步提高放大倍率，仔细观察细胞超微结构是否异常。 CGMMV 杆状病毒粒子分散或聚集分布在细胞质内，病毒聚集体中的病毒粒子呈整齐平行排列，细胞核及细胞器一般无特殊变化 。CGMMV感染的细胞图像精确聚焦后用 CCD 相 机 记 录 并 储 存(或 者 用 电 子 底 片 进 行 拍 照)。 CGMMV粒子在感病细胞超薄切片中的典型形态参见附录 C。

　　7 血清学和分子生物学验证

　　必要时，按照 GB/T 28071—2011 的规定进行 CGMMV 的血清学检测和分子生物学检测，以验证电镜检测结果的可靠性。

　　8 检测结果发布

　　检测结果报告应包括以下信息：

　　a) 检测报告的唯一编号;

　　b) 试样名称;

　　c) 送样人姓名、单位和地址;

　　d) 试样的接收日期;

　　e) 检测仪器及其工作条件;

　　f) 检测结果和必要的说明;

　　g) 检测人签字;

　　h) 检测报告负责人的签字;

　　i) 检测报告的页码;

　　j) 发布检测报告的实验室名称和地址;

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　　k) 检测报告的 日期。

　　9 除害处理

　　CGMMV检测过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后应进行消毒和除害处理。 种子试样应保存在 4 ℃冰箱内，叶片和果实试样应保存在 -20 ℃以下冰箱或冻干保存三个月备查，保存期满后进行灭活处理，以防病毒扩散。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料

　　学名：cucumbergreenmottlemosaicvirus

　　缩写：CGMMV

　　中文名：黄瓜绿斑驳花叶病毒

　　A.1 寄主范围

　　CGMMV在自然界主要侵染西瓜(citrulluslanatus)、甜瓜(cucumismelo)、黄瓜(cucumissati- ℃us)、南瓜(cucurbitamoschata)、葫芦(Lagenariasiceraria)、丝瓜(Luffa cylindrica)、苦瓜(Mo- mordicacharantia)等葫芦科植物。

　　A.2 病害症状

　　黄瓜：病株新叶出现黄色小斑点，之后出现花叶并带有浓绿色凸起，植株矮化，果实在病轻时只发生淡黄色圆形小斑点，病重时出现浓绿色瘤状突起变成畸形，果实严重受损。

　　西瓜：病株幼叶出现不规则的褪绿色或淡黄色，呈斑驳花叶状，病叶绿色部分隆起叶面凸凹不平，叶缘向上翻卷，叶片略变窄细。 叶片老化后症状减轻。 成熟期病果表面出现浓绿色略圆的斑纹，果肉变成暗红色和纤维化，呈丝瓜瓤状，俗称“血果肉”，味苦不能食用。

　　甜瓜：病株茎端新叶出现黄斑或花叶，随叶片老化症状减轻。

　　瓠瓜：病株叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。

　　A.3 传播

　　CGMMV通过接触传播，也可以通过种子传播，嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之 一 。植株一旦发病，如果未进行灭杀处理，土壤也可以带毒，带毒土壤可以成为病害发生的侵染源。 蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播该病毒。

　　A.4 地理分布

　　CGMMV 于 1935 年在英国首次被发现和报道。 目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦、德国、俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰 、日本、巴基斯坦、中国大陆及台湾地区均有分布。

　　A.5 病毒粒子形态

　　典型的病毒粒子为刚直杆状，直径为 18 nm,长度为 300 nm。

　　A.6 基因组结构

　　病毒基因组为正义单链 RNA,全长约 6.4 kb,分别编码 129 kDa/186 kDa, 29 kDa 和 17.4 kDa 4 个

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　　蛋白。 5′端和 3′端分别含有一段非编码区。

　　A.7 分类地位(摘译自：国际病毒分类委员会 ICTV第九次病毒分类报告，2012)

　　科 (Family)：植物杆状病毒科virga℃iridae

　　属 (Genus) ：烟草花叶病毒属 Tobamo℃irus

　　种 (Species)：曼陀罗木轻症斑驳病毒 Brugmansiamildmottle℃irus(BMMV)

　　黄瓜果实斑驳花叶病毒 cucumberfruitmottlemosaic℃irus(CFMMV)黄瓜绿斑驳花叶病毒cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)

　　鸡蛋花花叶病毒 Frangipanimosaic℃irus(FrMV)

　　皮尔斯堡木槿潜隐病毒 HibiscuslatentFortpierce℃irus(HLFPV)新加坡木槿潜隐病毒 Hibiscuslatentsingapore℃irus(HLSV)

　　日本黄瓜绿斑驳花叶病毒 kyurigreenmottlemosaic℃irus(KGMMV)老布达辣椒病毒 obudapepper℃irus(ObPV)

　　齿瓣兰环斑病毒 odontoglossum ringspot℃irus(ORSV)

　　甜椒轻症斑驳病毒 paprikamildmottle℃irus(PaMMV)

　　辣椒轻症斑驳病毒 peppermildmottle℃irus(PMMoV)

　　地黄花叶病毒 Rehmanniamosaic℃irus(ReMV)

　　长叶车前草花叶病毒 Ribgrassmosaic℃irus(RMV)

　　萨蒙氏仙人掌病毒 sammons’sopuntia℃irus(SOV)

　　扭果苣苔花碎色病毒 streptocarpusflo∞erbreak℃irus(SFBV)

　　菽麻花叶病毒 sunn-hempmosaic℃irus(SHMV)

　　烟草潜隐病毒 Tobaccolatent℃irus(TLV)

　　烟草轻症绿花叶病毒 Tobaccomildgreenmosaic℃irus(TMGMV)烟草花叶病毒 Tobaccomosaic℃irus(TMV)

　　番茄花叶病毒 Tomatomosaic℃irus(ToMV)

　　芜菁脉明病毒 Turnip℃ein-clearing℃irus(TVCV)

　　块根落葵轻症斑驳病毒ullucusmildmottle℃irus(UMMV)

　　山岢菜斑驳病毒wasabimottle℃irus(WMoV)

　　油菜花叶病毒youcaimosaic℃irus(YoMV)

　　小西葫芦绿斑驳花叶病毒 zucchinigreenmottlemosaic℃irus(ZGMMV)

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　　附 录 B

　　(资料性附录)常用试剂的配方

　　B.1 磷酸缓冲液配方

　　B.1 . 1 0 . 2 mol/L磷酸缓冲液贮存液

　　A液 0 . 2 mol/L磷酸二氢钠水溶液：

　　NaH2 PO4 · H2 O 27.60 g

　　或 NaH2 PO4 ·2H2 O 31.21 g

　　加双蒸馏水至 1 000 mL,混匀。

　　B液 0 . 2 mol/L磷酸氢二钠水溶液：

　　Na2 HPO4 ·2H2 O 35.61 g

　　或 Na2 HPO4 ·12H2 O 71.64 g

　　加双蒸馏水至 1 000 mL,混匀。

　　B.1 . 2 0 . 1 mol/L磷酸缓冲液

　　按表 B. 1 所列数量取 A液和 B液混合，配制 0 . 2 mol/L磷酸缓冲液贮存液后，加 1 倍双蒸馏水即为0 . 1 mol/L磷酸缓冲液。 按不同比例稀释可配制成不同浓度的磷酸缓冲液。

　　表 B.1 不同 PH值磷酸缓冲液贮存液配制表

　　B.2 固定液配方

　　B.2 . 1 戊二醛固定液

　　戊二醛固定液配制见表 B. 2 。

　　表 B.2 0 . 1 mol/L磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液配制表

　　B.2 . 2 四氧化餓固定液

　　B.2 . 2 . 1 2%四氧化餓贮存液

　　将装有四氧化餓的安瓿(共 0 . 5 g)清洗干净，用玻璃划割器在上面刻痕，再用双蒸馏水冲洗几次，放

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　　入洁净棕色广口玻璃瓶内，加上 25 mL双蒸馏水，用洁净玻璃棒捣破安瓿。 然后用石蜡将广口玻璃瓶严密封口，贴上标签，置于干燥器中，4 ℃下避光保存。

　　B.2 . 2 . 2 0 . 1 mol/L磷酸缓冲液配制的四氧化餓固定液

　　取等量的 0 . 2 mol/L磷酸缓冲液(pH 值 7 . 2)与 2%四氧化餓贮存液混合，现配现用。

　　B.3 包埋剂配方

　　B.3 . 1 环氧树脂 spurr’s低黏度包埋剂

　　环氧树脂 Spurr’s低黏度包埋剂配制见表 B. 3 。

　　表 B.3 环氧树脂 spurr’s低黏度包埋剂配制表

　　注 1 ：按上述比例将前三种成分混合均匀，再加 DMAE催化剂搅拌。 配好的包埋剂在低温和防潮状态下可保存数月 。该包埋剂嗜氧，聚合时包埋管需要加盖，在 70 ℃温度下聚合 8 h 即可完全聚合。 此包埋剂不易受潮。

　　注 2 : ERL-4206 是 Vinyl cyclohexene dioxide 的简称。它的黏度低，聚合块硬度大。目前 ERL-4206 停产后由 ERL-

　　4221 作为替代品，它的黏度稍大于 ERL-4206 。使用 ERL-4221 时，需要适当增加 DER-736 的比例以得到硬度适中的包埋块。

　　DER-736 是 Diglycidyl ether of polypropylene glycol 的简称。它属于脂肪族，有低黏度性质，可调节包埋块的

　　硬度。

　　NSA是 Nonenyl succinic anhydride 的简称。 它是一种特殊的硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。

　　DMAE是 2-Dimethylaminoethanol 的简称。 它是催化剂，增加催化剂的比例，可以缩短聚合时间。

　　B.3.2 环氧树脂 Epon8 12 包埋剂

　　环氧树脂 Epon812 包埋剂配制见表 B. 4 。

　　表 B.4 环氧树脂 Epon8 12 包埋剂配制表

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　　注 1 ：按上述比例配好各成分，充分搅拌 30 min,驱除气泡。 包埋样品分别在 37 ℃ 、45 ℃ 、60 ℃下聚合 12 h、12 h 、

　　24 h或直接在 60 ℃温度下聚合 48 h。 此包埋剂易受潮，应在干燥器中保存聚合后的样品包埋块。

　　注 2 : Epon812 是环氧树脂单体。

　　DDSA是十二烷基琥珀酸酐(Dodecenylsuccinic anhydride) 的简称。 它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子。

　　MNA是甲基内次甲基二甲酸酐(Methyl nadic anhydride) 的简称，又称六甲酸酐。 它有两个链环，能获得较硬的包埋块。

　　DMP-30 是 2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚[2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol] 的简称。它能加速固

　　化过程。

　　B.4 染色液配方

　　B.4. 1 2%磷钨酸负染色液

　　称取 1 . 0 g磷钨酸，用 50 mL双蒸馏水配制成 2%(w/v)的水溶液，用 1 mol/ L NaOH 调 pH 值至

　　6 . 7~6 . 8,过滤后 4 ℃下保存备用。

　　B.4 . 2 醋酸铀负染色液

　　低盐的病毒提纯试样也可用 2%(w/v)醋酸铀水溶液进行负染色，具有更高的图像分辨率。 称取1 . 0 g 醋酸铀，用 50 mL双蒸馏水配制成醋酸铀负染色液，呈淡黄色，pH 值 4 . 2,室温下避光保存备用。

　　B.4 . 3 超薄切片染色液

　　B.4 . 3 . 1 醋酸铀染色液：称取 1 . 0 g 醋酸铀，用 50 mL 50%(v/v)的乙醇配制成 2%(w/v)醋酸铀乙醇溶液，呈淡黄色，室温下避光保存。

　　B.4 . 3 . 2 柠檬酸铅染色液：称取硝酸铅 1 . 33 g、柠檬酸三钠 1 . 76 g,放入 50 mL容量瓶中，加入预先煮沸过的双蒸馏水 30 mL,混合后摇荡 30 min,混悬液呈乳白色，加 1 mol/ L NaOH 溶液 8 mL后混悬液逐渐变澄清，pH 值为 12,再加双蒸馏水定容至 50 mL,封闭瓶口 。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒电镜照片

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒电镜照片见图 C. 1 和图 C. 2 。

　　a)西瓜病叶粗汁液中的杆状病毒粒子图 b)杆状病毒粒子高倍形貌像

　　图 C.1 感染西瓜的 CGMMV粒子(2%磷钨酸负染色)

　　a)细胞质中呈带状分布的病毒聚集体(箭头) b)细胞质中聚集和分散的杆状病毒粒子

　　图 C.2 西瓜病叶超薄切片显示分布于细胞质中的 CGMMV粒子