GB/T 33681.1-2017 高通量基因测序样本预处理方法 第1部分：动物组织样本预处理

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33681 . 1—2017

　　高通量基因测序样本预处理方法第 1 部分：动物组织样本预处理

　　Methodstopreparesamplesforhigh-throughputgenesequencing—

　　part1：preparingsamplesofanimaltissues

　　2017-05-12 发布 2017-12-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 3368 1 . 1—20 17

　　GB/T 3368 1 . 1—20 17

　　前 言

　　GB/T 33681《高通量基因测序样本预处理方法》分为 3 个部分：

　　— 第 1 部分 动物组织样本预处理;

　　— 第 2 部分 植物组织样本预处理;

　　— 第 3 部分 微生物组织样本预处理。

　　本部分为 GB/T 33681 的第 1 部分。

　　本部分按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本部分由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本部分起草单位：深圳华因康基因科技有限公司、深圳市华因康高通量生物技术研究院、广州康昕瑞基因健康科技有限公司、武汉康昕瑞基因健康科技有限公司、中国测试技术研究院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、国家人类基因组南方研究中心、中山大学肿瘤防治中心。

　　本部分主要起草人：盛司潼、谭辉彪、李花、曾涛、杨杰斌、周李华、张俊、王升跃、陈功。

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　　高通量基因测序样本预处理方法第 1 部分：动物组织样本预处理

　　1 范围

　　GB/T 33681 的本部分规定了高通量基因测序技术中对待检的动物组织样本进行预处理的技术要求。

　　本部分适用于高通量基因测序过程中对待检的动物组织样本的预处理。

　　本部分适用于血液、表皮拭子样本、新鲜动物组织样本(肌肉、脏器、毛发、骨骼)、甲醛固定动物组织样本、石蜡包埋动物组织样本。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 26798 单光束紫外可见光光度计

　　GB/T 26813 双光束紫外可见分光光度计

　　GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求

　　GB/T 30989 高通量基因测序技术规程

　　JJG 646 移液器

　　YY 0569 Ⅱ级生物安全柜

　　YY/T 0657 医用离心机

　　医疗机构临床基因扩增管理办法 卫生部 2010 年

　　ASTME 1342 用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动

　　物和植物组织的标准实施规程 (Standard practice for preservation by freezing, freeze-drying, and low temperature maintenance of bacteria, fungi , protista, viruses , genetic elements , and animal and plant

　　tissues)

　　3 术语和定义

　　GB/T 30989 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　动物组织样本 animaltissuesample

　　提供 DNA或 RNA 的用于构建测序文库的动物组织材料。

　　3.2

　　接头 adapter

　　一段人工合成的长度较短的能与平末端或黏性末端匹配(连接)的 DNA 片段。

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　　3.3

　　待测文库 librarytobetested

　　由两端连有已知的特定接头，中间为未知序列的核酸片段组成的核酸分子的集合。

　　3.4

　　待检样本 sampletobetested

　　待测文库经单分子扩增后，固定在载体上的产物，可直接用于上机测序。

　　3.5

　　动物组织样本预处理 animaltissuesamplepretreatment

　　通过一系列实验步骤将动物组织样本处理成可直接用于基因测序的待检样本的过程，该过程是从核酸的提取到待检样本的获得。

　　3.6

　　前处理流程 forwardflow

　　材料和(或)样本的操作原则，用于确保实验室样本、原材料和包括 DNA 扩增产物在内的经过处理的待检样本在整个实验过程中保持自然分离状态。

　　3.7

　　单分子扩增 monomolecularamplification

　　以单分子核酸为模板进行核酸扩增，形成单一类型分子簇的过程。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DEPC：焦磷酸二乙酯(Diethy Pyrocarbonate)

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　DNase：脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)

　　dNTPs：四种脱氧核苷酸(Deoxy-ribonucleotide Triphosphate)

　　EPCR：乳液聚合酶链式反应(Emulsion Polymerase Chain Reaction)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　RNA：核糖核酸(Ribonucleic Acid)

　　RNase：核糖核酸酶(RNase Ribonuclease)

　　TE：含乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-EDTA Buffer Solution)

　　5 总则

　　5 . 1 一般性要求

　　动物组织样本预处理的目的是制备可直接用于高通量基因测序的待检样本，从而分析动物组织样本的基因序列。 动物组织样本预处理方法流程分为核酸的提取和待检样本的制备，其中待检样本的制备包括片段化处理、接头连接以及单分子扩增。

　　5 . 2 核酸的提取

　　核酸提取是用物理、化学或生物酶的方法，释放动物组织样本中的核酸并对它进行纯化，充分去除动物组织样本中的蛋白质、脂类等 PCR抑制剂以及提取核酸时加入的试剂，保证核酸的质量和浓度的稳定，以保证 PCR反应的可重复性，所提取的核酸应是能满足下游分析要求的优质模板。 常用的核酸提取方法参见附录 A。

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　　5 . 3 待检样本的制备

　　用物理、化学或生物酶的方法将提取出来的核酸(DNA、cDNA 或 RNA) 剪切成一系列长度不同的片段，回收目标长度的片段;在核酸片段的两端连上接头，制备成由两端连有已知的特定接头，中间为未知序列的核酸片段组成的核酸分子的集合，即待测文库。 以待测文库中的核酸分子为模板进行扩增，最终获得待检样本。 待检样本的质量评估参见附录 B。

　　6 实验室要求

　　实验室的环境与设施应符合 GB/T 27025 的规定。

　　为了有效防止核酸污染，实验室宜根据预处理步骤设置不同的工作区域，所有实验操作宜在规定的区域进行，动物组织样本的预处理应按照预处理步骤的先后顺序进行，严格遵循“前处理流程”。具体要求应遵循附录 C 中的规定。

　　7 主要仪器与设备

　　7 . 1 超低温冰箱

　　温度调节范围在- 10 ℃ ~- 90 ℃之间。

　　7 . 2 PCR仪

　　温度设置范围在 0 ℃ ~99 ℃之间;温控模块的实际温度与预设温度的差值的绝对值小于 0 . 5 ℃ ;升降温速度大于等于 3 ℃ / s。

　　7 . 3 生物安全柜

　　应符合 YY 0569 的要求。

　　7 . 4 离心机

　　应符合 YY/T 0657 的要求。

　　7 . 5 移液器

　　应符合 JJG646 的要求。

　　7 . 6 核酸测定仪

　　能满足核酸测定要求的仪器。

　　宜采用紫外分光光度计，紫外分光光度计应符合 GB/T 26798 或 GB/T 26813 的要求。

　　8 试验步骤

　　8 . 1 核酸制备

　　8 . 1 . 1 样本的前处理

　　根据样本类型的不同，样本的前处理可按下列方式进行处理：

　　— 血液、表皮拭子样本可直接按 8 . 1 . 2 的要求进行核酸提取;

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　　— 新鲜动物组织样本应通过物理和/或化学的方法，将新鲜的动物组织处理成粉末或匀浆，悬浮在生理盐水或磷酸缓冲液中，振荡混匀以备用;

　　— 甲醛固定动物组织样本应先脱醛，然后再通过物理和/或化学的方法，将待检样本处理成粉末或匀浆，悬浮在生理盐水或磷酸缓冲液中，振荡混匀以备用;

　　— 石蜡包埋动物组织样本应先脱蜡，然后再通过物理和/或化学的方法，将石蜡包埋动物组织处理成粉末或匀浆，悬浮在生理盐水或磷酸缓冲液中，振荡混匀以备用。

　　注：含自溶酶的动物组织样本，例如海参，需经过超高压处理灭活自溶酶以后再按新鲜动物组织样本进行处理。

　　8 . 1 . 2 核酸的提取

　　将动物组织样本中的核酸提取出来，充分去除动物组织样本中的蛋白质、脂类、多糖等杂质。 经纯化后的核酸应能满足后续的分析要求。 常用的核酸提取方法有酚-氯仿提取法、浓盐法、水抽提法、阴离子去污剂法等。 常用核酸的提取方法具体操作参见附录 A。

　　8 . 2 待检样本的制备

　　8 . 2 . 1 片段化处理

　　通过酶切、超声波或其他手段将提取出来的核酸分子切割成一系列长度不同的片段，回收目标长度的片段。 常用酶切法的具体操作参见附录 D。

　　8 . 2 . 2 接头连接

　　在核酸片段的两端连上接头，制备成由两端连有已知的特定接头，中间为未知序列的核酸片段组成的待测文库。 利用只与两端接头序列匹配的引物进行扩增验证，应能得到预期大小的片段。

　　8 . 2 . 3 单分子扩增

　　以待测文库中的核酸分子为模板进行扩增，最终获得待检样本。 单分子扩增的方法宜采用乳液PCR或桥式 PCR。 常用的乳液 PCR 的具体操作参见附录 E。

　　9 质量评估

　　核酸提取及待测文库制备的质量评估的常用方法参见附录 B。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)核酸的提取方法

　　A.1 试剂

　　总 RNA抽提试剂(TRIzol)、氯仿、无水乙醇、含 10%乙醇的 0. 1 mol/L 柠檬酸钠、75%乙醇、TE、

　　异丙醇、DEPC处理水。

　　A.2 设备

　　研磨杵、漩涡振荡器、高速离心机、冷冻离心机、移液器。

　　A.3 提取方法

　　A.3 . 1 DNA 的提取

　　A.3 . 1 . 1 将动物组织样本与 TRIzol混合，用研磨杵研磨。

　　取 50 mg~100 mg组织加入 1 mL TRIzol,样本体积不能超过 TRIzol 的 10%。匀浆后于 15 ℃ ~ 30 ℃条件下放置 5 min,保证核蛋白复合体完全分离。

　　注：如果匀浆出现大量沉淀，可先离心取上清液，再进行后续操作。

　　A.3 . 1 . 2 往匀浆中加入 0 . 2 mL氯仿，盖好样本盖，常温剧烈摇动 15 s后放置 5 min。

　　A.3. 1 .3 4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min,弃除上清液，往沉淀物中加入 0.3 mL无水乙醇，混匀后置于室温 2 min~3 min。

　　A.3. 1 .4 4 ℃ 2 000 r/min离心 5 min,弃除上清液，用含 10%乙醇的 0.1 mol/L柠檬酸钠洗涤 DNA沉淀，加入 1 mL柠檬酸钠，室温放置 30 min, 4 ℃ 12 000 r/min离心 5 min,弃上清，重复一次。

　　A.3. 1 .5 再用 1.5 mL~2 mL 的 75%乙醇洗涤 DNA沉淀，室温放置 10 min~20 min,不时颠倒混合。

　　A.3. 1 .6 4 ℃ , 2 000 r/min离心 5 min, 弃上清。

　　A.3. 1 .7 将 DNA沉淀室温放置 5 min~15 min, 晾干。用 30 μL~100 μL TE(55 ℃ ~65 ℃预热)溶解 DNA。

　　若提取的 DNA 中有胶状不溶物，可用大于 12 000 r/ min 的转速离心 10 min 除去。

　　A.3 . 2 RNA 的提取

　　A.3 . 2 . 1 取新鲜动物组织 0 . 1 g~0 . 2 g置于组织匀浆器中，加入 1 mL预冷的 Trizol 液，在冰浴中迅速匀浆 15 s~30 s,充分研碎组织。

　　A.3 . 2 . 2 然后将细胞悬浮液吸入另一 1 . 5 mL 的离心管中，于室温下静置 5 min。

　　A.3.2.3 往离心管中加入 200 μL氯仿，剧烈振摇 15 s,使混合物充分混匀后，室温静置 3 min。

　　A.3.2.4 4 ℃ , 10 000 r/min离心 15 min。将上层无色水相转移到另一离心管中，加入 500 μL异丙醇，室温静置 10 min。

　　A.3.2.5 4 ℃ , 10 000 r/min离心 10 min。弃除上清液，用 1 mL 75%乙醇洗涤 RNA沉淀物。

　　A.3.2.6 4 ℃ , 7 500 r/min离心 5 min。弃除上清液，将 RNA沉淀物置于室温下干燥 15 min。

　　A.3.2.7 向沉淀物中加入 200 μL DEPC处理水，溶解沉淀物，于 -20 ℃保存备用。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)质 量 评 价

　　B.1 核酸提取的质量

　　B.1 . 1 DNA提取的质量

　　采用紫外分光光度法。

　　所测得的 OD260 nm/OD280 nm值应在 1.7~2.0 范围内。若 OD260 nm /OD280 nm值低于 1.7 ,

　　说明提取的 DNA 中有蛋白质等杂质，应做进一步的分离纯化;若 OD260 nm /OD280 nm 值高于 2 . 0 ,则表明提取的 DNA可能有 RNA 污染。

　　B.1 . 2 RNA提取的质量

　　B.1 . 2 . 1 紫外分光光度法

　　所测得的 OD260 nm /OD280 nm值应在 1.7~2.0 范围内。若 OD260 nm /OD280 nm值低于 1.7 ,说明提取的 RNA 中有蛋白质等杂质，应做进一步的分离纯化;若 OD260 nm /OD280 nm 值高于 2 . 0 ,表明提取的 DNA 中有盐、胍、糖等杂质，可用 LiCL选择沉淀 RNA 以除去杂质。

　　B.1 . 2 . 2 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测法

　　RNA样本的电泳结果可见清晰的 28S、18S 及 5S 小分子 RNA 条带，表明提取的 RNA 样本完整性好。

　　B.2 待测文库的质量

　　根据待测文库中核酸片段的两端接头的已知序列设计特异性扩增引物对待测文库的片段进行扩增，所得产物大小应在预设范围内。

　　B.3 单分子扩增产物的质量

　　单分子扩增产物应能满足所选用高通量基因测序仪厂家的质量要求。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)实验室要求

　　C.1 一般要求

　　C.1 . 1 设施和环境要求

　　用于高通量基因测序样本预处理的实验室，动物组织样本应按照预处理步骤的先后顺序进行，严格遵循“前处理流程”，有条件的宜在所分隔的各工作区域设置缓冲间，缓冲间的压力为负压(或上设抽风装置)，与其相连的工作间为正压，工作间与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置。 受实验场所限制而无条件设置缓冲间的实验室，在对检测区域进行功能划分后，应根据 A. 2 中的规定设置实验室的压力。 非实验人员不应进入各实验工作区。

　　不同功能的高通量基因测序样本预处理工作区应是分隔独立的工作室，并有明显的标志，各区间不能直通。 各区之间如果是紧密相连，需安装物品传递舱。

　　每个工作区域的顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为 254 nm,每 20 m2 安装一支 40 W 的紫外灯，灯与地面的距离为 2 . 0 m±0 . 1 m。

　　C.1 .2 工作顺序

　　所有实验操作宜在规定的区域进行，动物组织样本的流动应遵照预处理流程的顺序，严格按单一方向进行。

　　C.2 实验室工作区域的设置及要求

　　C.2. 1 核酸检验区 C.2. 1 . 1 试剂贮存区C.2. 1 . 1 . 1 主要功能

　　原装试剂和配制试剂的贮存，所有试剂的分装与贮存。

　　C.2. 1 . 1 .2 工作区域的压力要求

　　未设缓冲间的试剂贮存区，工作区域为正压。

　　C.2. 1 . 1 .3 注意事项

　　当试剂经质检合格后，应将其分装贮存备用，贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数决定。 用于扩增的试剂应冰冻贮存，避免反复冻融使用，冻融后置于 4 ℃保存，且 4 ℃存放时间不应超过一周。

　　C.2. 1 .2 试剂配制区

　　C.2. 1 .2. 1 主要功能

　　用于所有试剂的配制与准备。

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　　C.2. 1 .2.2 工作区域压力要求

　　未设缓冲间的试剂配制准备区域，工作区域可为正压或负压，可安装排风系统，视具体配制的试剂而定。

　　C.2. 1 .2.3 注意事项

　　此区域是用于试剂配制的区域，应视所配制的试剂决定工作区域的分配，配制试剂所用的器具应在使用前进行清洗，必要时加以消毒;不同试剂的配制防止受到交叉污染。

　　C.2. 1 .3 待检样本的制备区

　　C.2. 1 .3. 1 主要功能

　　实验室样品的处理以及符合测序要求的待检样本的制备。

　　C.2. 1 .3.2 工作区域的压力要求

　　未设缓冲间的样品制备区，工作区域为负压或减压，可安装排风系统。

　　C.2. 1 .3.3 注意事项

　　此区应远离其他实验操作区;粉碎样品时的器皿应单独使用，所用的器具在使用前应经过彻底清洗并高压消毒，防止交叉污染，称取的测试样品应加盖后再移至样品核酸制备区。

　　C.2. 1 .4 扩增区

　　C.2. 1 .4. 1 主要功能

　　PCR扩增反应体系的配制和模板的加入，核酸扩增。

　　C.2. 1 .4.2 工作区域的压力要求

　　未设缓冲间的扩增区，工作区域为负压或减压，可安装排风系统。

　　C.2. 1 .4.3 注意事项

　　严格限制无关人员出入并减少在本区内走动;加样应在超净工作台(生物安全柜)内进行，超净工作台的气流方向宜选择垂流式。

　　C.2. 1 .5 质检区

　　C.2. 1 .5. 1 主要功能

　　试剂配制结果以及扩增产物的定性与定量测定。

　　C.2. 1 .5.2 工作区域的压力要求

　　未设缓冲间的扩增产物区，工作区域为负压或减压，应安装排风系统。

　　C.2. 1 .5.3 注意事项

　　此区是最主要的扩增产物污染来源，应远离其他实验操作区;推荐使用荧光显微镜对试剂配制结果

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　　进行定性检测，推荐使用实时荧光定量 PCR方法对扩增产物进行定量检测。

　　注：若实验仅采用全自动扩增检测仪(如实时荧光定量 PCR仪)，可将扩增区与质检区合并为一个区。

　　C.2 . 2 其他区域

　　可设置洗涤消毒室(洗涤、消毒、制备纯水和/或双蒸水、制冰等)、高速/超高速离心机室、低温/超低温冰箱室等。

　　C.3 实验室质量控制和质量保证

　　C.3 . 1 人员

　　实验室的人员应符合 GB/T 27025 的要求。 实验操作人员应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。

　　C.3 . 2 仪器设备

　　各实验区域应有专用的仪器设备，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免与其他区域的物品混用。

　　仪器设备的校准应符合 GB/T 27025 的要求。

　　C.3 . 3 试剂

　　C.3 . 3 . 1 试剂要求

　　除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含 DNA 和 DNase 的分析纯或生化试剂。 试剂的选购、验收、贮存应符合 GB/T 27025 的要求。

　　实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 去离子水的电阻率应达到 18 . 2 mΩ· cm。

　　商品试剂盒应注明到货日期，对所收到的试剂盒应按规定的贮存条件存放。

　　对动物细胞组织的贮存与保管应符合 ASTME 1342 的规定。

　　C.3 . 3 . 2 试剂配制

　　实验室配制的试剂应在容器上标明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期及配制者姓名。

　　所用试剂溶液宜大体积配制，并于 0 . 11 MPa, 121 ℃ ,高压灭菌 15 min 至 20 min,然后小体积分装后保存;不宜高压灭菌的试剂应过滤(0 . 22 μm) 除菌;PCR 预混液、引物、探针应避免反复冻融;若冻融后未用完的试剂应保存于 4 ℃ ,且保存时间不应超过一周。

　　C.3 . 3 . 3 试剂质量控制

　　实验室应确定关键试剂，并在使用前进行质量检测。 关键试剂包括：核酸提取试剂、RNase、蛋白酶K、阴性对照标准物质、阳性对照标准物质、Taq酶、各种限制性内切酶、T4 连接酶、引物、探针。

　　C.3 . 4 防止污染

　　C.3 . 4 . 1 严格实验室分区

　　按 A. 2 中的规定，对实验室进行功能分区，各区的工作服、实验用具和实验记录本应区分标记，不能混用。

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　　C.3 . 4 . 2 废弃物处理方式

　　参照 GB/T 19489 实验室生物安全通用要求，以及《医疗机构临床基因扩增管理办法》附件《实验室工作导则》中相关要求进行处理。

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　　附 录 D

　　(资料性附录)片段化处理

　　D.1 总则

　　采用 DNA 限制性内切酶 NlaⅢ、Sau3AI等酶切 DNA分子。 根据所需核酸分子的大小设置酶浓度梯度实验，根据实验需要选择合适的酶浓度进行大量酶切，该实验建议在冰上操作。

　　D.2 试剂

　　限制内切酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、12%聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒、苯酚、氯仿 、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、醋酸铵、TE。

　　D.3 设备

　　电泳仪、水浴锅、高速离心机、移液器。

　　D.4 实验方法

　　D.4. 1 取 1 μg~ 10 μg 核酸提取产物，加入限制内切酶缓冲液，在冰上混匀，于 37 ℃条件下酶切20 min 。

　　注 ：限制内切酶缓冲液的量按 1 U/μg核酸提取物计算。

　　D.4 . 2 加入 EDTA终止反应，在 12%PAGE、180 V 的条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳约 30 min, 回收目标区间 DNA 片段。

　　D.4 . 3 在紫外光照下切取目标区间的 DNA 片段。

　　D.4 . 4 回收 DNA 片段产物

　　D.4 . 4 . 1 将切取的凝胶转移至事先用 7 号针头在管底戳了 1 个 ~ 6 个小孔的 0 . 5 mL 离心管中，将0.5 mL 离心管置于 2.0 mL 离心管中，12 500 r/min离心破碎凝胶。

　　D.4.4.2 加入至少 50 μL PAGE凝胶回收液，回收液需没过 PAGE凝胶。37 ℃放置 2 h 或 4 ℃过夜。注：若总体积超过 300 μL,宜分成两管，涡旋振荡混匀。

　　D.4 . 4 . 3 将凝胶及 PAGE凝胶回收液转移至纯化柱中，12 500 r/min离心 2 min,将离心后的水相转移至新的 1 . 5 mL 的离心管中;用灭菌枪头将离心柱内的胶块轻轻捣松(注意不要碰到柱子的薄膜)， 12 500 r/min再离心 3 min,直至胶块干燥为止。

　　D.4 . 4 . 4 合并离心液，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) 混合液，利用涡旋震荡仪振荡大约10 s,使溶液充分混匀。

　　D.4.4.5 12 500 r/min室温离心 2 min, 吸取上层水相至新 1.5 mL 离心管中。

　　D.4.4.6 往离心管中加入 350 μL~ 400 μL 氯仿/异戊醇(24 ∶ 1) 混合液，使用涡旋震荡仪振荡大约10 s,使溶液充分混匀。

　　D.4.4.7 12 000 r/min室温离心 2 min, 吸取上层水相至新 1.5 mL 离心管中。

　　D.4.4.8 加入 1 μL GL、100 μL醋酸铵(10 mol/L) 和 750 μL 经 -20 ℃预冷的浓度为 100%的乙醇，混

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　　合均匀，于 -80 ℃放置 1 h 或 -20 ℃条件下过夜。

　　D.4.4.9 4 ℃ 14 000 r/min离心 15 min, 出现微量淡淡白色 DNA沉淀，移除上清液。

　　注：避免碰到白色沉淀。

　　D.4.4. 10 用 1mL 75%乙醇( -20 ℃预冷)洗涤沉淀，4 ℃ 14 000 r/min离心 5 min,移除上清液。重复

　　该步骤一次。

　　D.4 . 4 . 1 1 打开离心管盖，在超净台中用轻风吹干沉淀(约 20 min) 。

　　D.4.4. 12 加入 20 μL~40 μL TE溶解沉淀(大约 5 min),将产物置于 -20 ℃条件下保存。

　　注：上述聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收可采用市面上现售的同等功效试剂盒进行，具体方法步骤参见相应的说明书。

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　　附 录 E

　　(资料性附录)单分子扩增

　　E.1 试剂

　　PCR扩增试剂盒、水饱和乙醚。

　　E.2 设备

　　乳浊液制备仪、漩涡振荡器、真空干燥箱、PCR仪、电泳仪、移液器。

　　E.3 实验步骤

　　E.3 . 1 制备水相

　　在 25 ℃条件下混合 DNA、引物、热稳定酶、缓冲液、Mg2+ 、dNTPs 和水。

　　E.3 . 2 配制乳液

　　在 25 ℃条件下将油相和水相按体积比为 2 . 5 ∶ 1 的比例混合，利用乳浊制备仪将油相和水相的混合物制备成乳液，最终乳液中应有 10 8 ~10 9 个微球反应体系。

　　E.3 . 3 PCR扩增

　　将配置好的乳液分装到 PCR管中，进行 PCR扩增。

　　E.3 . 4 提取扩增产物

　　E.3 . 4 . 1 PCR扩增结束后，往反应体系中加入等体积的水饱和乙醚，涡旋震荡;重复该步骤 2 次 ~3 次 。

　　E.3 . 4 . 2 将反应液在 25 ℃条件下，13 000 r/min高速离心 5 min,弃除上层油相，保留水相;重复该步骤2 次 ~3 次 。

　　E.3 . 4 . 3 合并水相，置于 25 ℃真空干燥箱干燥 5 min,使剩余乙醚完全挥发。

　　E.3 . 5 检测扩增产物

　　采用 2%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行凝胶电泳，检测扩增产物是否与预期大小一致。

　　GB/T 3368 1 . 1—20 17

　　参 考 文 献

　　[1] GB/T 19489—2008 实验室生物安全通用要求

　　[2] GB/T 19495 . 1—2004 转基因产品检测 通用要求和定义

　　[3] GB/T 19495 . 2—2004 转基因产品检测实验室技术要求

　　[4] GB/T 25168—2010 畜禽 cDNA文库构建与保存技术规程

　　[5] GB/T 25170—2010 畜禽基因组 BAC文库构建与保存技术规程

　　[6] SN/T 2497 . 21—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第 21 部分：琼脂糖凝胶电泳试验

　　[7] J.萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔.分子克隆实验指南.3 版.黄培堂，等，译.北京：科学出版社 .

　　[8] Nakano M, Komatsu J , Matsuura S, et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion [J ] . J Biotechnol , 2003 , 102 ( 2 ) : 117-124 .

　　[9] S Ohuchi, H Nakano, and T Yamane. In vitro method for the generation of protein libraries using PCR amplification of a single DNA molecule and coupled transcription/translation[J]. Nucleic Acids Res , 1998 , 26 ( 19 ) : 4339-4346 .

　　[10] Schütze T, Rubelt F, Repkow J , et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification[J].Anal Biochem, 2011 , 410(1) : 155-157.