GB/T 33127-2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33127—2016

　　甘蔗线条病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofSugarcanestreakvirus

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33127—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中 华 人 民 共 和 国 广 东 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 海 南 出 入 境 检 验 检疫局 。

　　本标准主要起草人 :冯黎霞 、武目涛 、刘福秀 、赵立荣 、王卫芳 、杨雷亮 。

　　甘蔗线条病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　3 甘蔗线条病毒基本信息

　　中文名 :甘蔗线条病毒 。

　　学名 :Sugarcanestreakvirus。

　　缩写 :SSV。

　　分类地位 :双生病毒科(Geminiviridae) ,玉米线条病毒属(Mastrevirus) 。

　　甘蔗线条病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　SSV 的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 。利用常规 PCR、实时荧光 PCR、双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)和免疫电镜方法对样品进行检测 。

　　5 仪器设备、设施、用具和试剂

　　5. 1 仪器

　　电子天平(感量 0. 001 g) 、高速离心机 、小型瞬时离心机 、超低温冰箱( -80 ℃) 、制冰机 、涡旋振荡器 、磁力搅拌器 、高压灭菌锅、pH 计 、透射电子显微镜 、超净工作台 、PCR 仪 、实时荧光定量 PCR 仪 、微波炉 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像分析仪 、酶联检测仪 。

　　5.2 设施

　　隔离温室(10 ℃ ~ 30 ℃) 。

　　5.3 用具

　　酶联板 、可调移液器(2. 5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL)和可调移液器头 、离心管 、研钵 、微型

　　GB/T 33127—2016

　　磨杵等 。

　　5.4 试剂

　　除有特别说明外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。DAS-ELISA测定试剂见附录 B;PCR检测试剂见附录 C;实时荧光 PCR检测试剂见附录 D。

　　6 症状观察与抽样

　　6. 1 症状观察

　　现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状 ,SSV为害症状描述参见附录 A。

　　6.2 抽样

　　发现有病毒为害症状的植物材料直接送检 ;未发现症状的 ,则按 SN/T 2122 中规定进行抽样 ,并送实验室检测鉴定 。

　　7 实验室检测

　　7. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　对待检组织进行研磨 ,并按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)的比例加入抽提缓冲液 ,制备的汁液分别盛装于离心管中 ,离心后吸取上 清 液 作 为 待 测 样 品,并 设 阳 性 对 照 、阴 性 对 照 和 空 白 对 照 。具 体 操 作 步 骤 见 附录 B。

　　7.2 常规 PCR检测

　　植株叶片液氮研细 ,取 0. 1 g用于提取植物总 DNA,双蒸水作为空白对照 。分别提取样品和对照的DNA后进行常规 PCR检测 ,具体操作步骤见附录 C。

　　7.3 实时荧光 PCR检测

　　实时荧光 PCR检测的阴性和阳性对照设置同 7. 1,双蒸水作为空白对照 。分别提取样品和对照的DNA后进行实时荧光 PCR检测 ,具体操作见附录 D。

　　7.4 免疫电镜检测

　　按照 SN/T 1840 中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态 。在免疫电镜下如观察到大小为 30 nm×20 nm 的杆状双联体粒体 , 即可判定结果阳性 。

　　8 结果判定

　　样品检测时 ,检测结果判定按下述原则进行 :

　　— 样品经 PCR检测为阴性 ;或者样品经 PCR 检测为阳性 ,但 是 序 列 测 定 结 果 与 目 的 序 列 不 一致 ,则判定样品不携带甘蔗线条病毒 。

　　— 样品经 PCR检测为阳性 ,且序列测定结果为目的序列 ; 同时免疫电镜 、DAS-ELISA、荧光 PCR这三种检测方法其中一种为阳性检测结果 , 即可判定样品携带甘蔗线条病毒 。

　　9 样品与记录结果保存

　　经检验确定携带甘蔗线条病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核 。 实验样品保存在 -20 ℃冰箱中 ,有条件的保存在 -80℃冰箱中更好 。做好登记和标记工作 。

　　记录包括样品来源 、种类 、取样人员 、实验的时间 、地点 、方法和结果 、检验检疫员的签字等 。双抗付夹心酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值 ,PCR检测应有电泳结果照片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　甘蔗线条病毒背景资料

　　A. 1 寄主范围

　　甘蔗(Saccharum oficinarum) 、蒺藜草(Cenchrusechinatus) 、两耳草(Paspalum conjugatum) 、柔毛狗尾草(Setariabarbata) 、弯叶画眉草(Eragrostiscurvula) 。

　　A.2 分布

　　印度 、巴基斯坦 、尼 日利亚 、贝宁 、多哥 、塞内加尔 、科特迪瓦 、肯尼亚 、马拉维 、毛里求斯 、莫桑比克 、南非 、苏丹 、乌干达等许多国家和地区 。

　　A.3 病害症状

　　SSV影响寄主植物的整个生长期 ,可以导致对该病毒敏感品种 11%以上的损失 。受感染植株叶片有无数小的斑点或条纹 ,病斑透明状 ,细窄 ,与叶脉平行 。侵染后期 ,条斑不规则分布 ,植株下部叶片症状严重 ,植株生长受阻 。病毒主要分布在叶肉细胞 、茎尖分生细胞及韧皮细胞中 。

　　A.4 传播途径

　　SSV可通过种茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播 。 可以通过多种叶蝉(Cicadulina spp.) 以持久性方式传播 ,在昆虫介体体内不能增殖 ,不能经过机械 、嫁接 、种子 、花粉和植株间相互接触进行传播 。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体为双联体结构 ,大小 30 nm×20 nm。

　　A.6 基因组

　　基因组为单链环状 DNA, 长 2 760 nt左右 ,病毒正义链有两个阅读开放框(ORF) ,分别编码运动蛋白和外壳蛋白 ;互补链编码 2个 ORF,经 mRNA剪接合成复制酶蛋白 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B. 1 主要试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的甘蔗线条病毒抗体 。

　　B. 1.2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的甘蔗线条病毒抗体 。

　　B. 1.3 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW 24000~40000) 20 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　吐温-20 20 mL

　　溶于 900 mL 的 1×PBST 中 ,用 HCl调节 pH 至 7. 4,定容至 1 000 mL。

　　B. 1.4 10×PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　溶于 900 mL 的蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 7. 4,并定容至 1 000 mL。

　　B. 1.5 包被抗体缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　溶于 900 mL蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 9. 6,并定容至 1 000 mL。

　　B. 1.6 酶标抗体缓冲液(pH 7. 4)

　　1×PBST缓冲液 800 mL

　　牛血清白蛋白(BSA) 2 g

　　PVP(MW 24000~40000) 20 g

　　用无菌蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B. 1.7 底物(pNPP)缓冲液(pH 9. 8)

　　二乙醇胺(C4 H11NO2 ) 97 mL

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于 600 mL 的无菌蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 9. 8,然后用蒸馏水定容至 1 000 mL。

　　B. 1. 8 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH)120g溶于 1 000 mL 的无菌蒸馏水中 ,浓度 3 mol/L。

　　B.2 实验步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释 ,加入酶联板孔中 ,100 μL/孔 ,加盖 ,37 ℃孵育 2 h,清空孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ,每次 3 min。

　　B.2.2 样品制备

　　待测样品幼嫩叶片按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液 ,用研钵研磨成浆 ,2000g 离心 10min,上清液即为制备好的检测样品 。对阴性对照 、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 。

　　B.2.3 加样

　　加入制备好的检测样品 、阴性对照 、阳性对照 , 100 μL/孔 ,加盖 ,37 ℃孵育 2 h 或 4 ℃冰箱孵育过夜 ,PBST洗涤 4次 ,每次 3 min。

　　B.2.4 加酶标抗体

　　根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度 , 加入到酶联板中 , 100 μL/孔 , 加盖 ,37 ℃孵育 2 h,PBST洗涤 4次 ,每次 3 min。

　　B.2.5 加底物

　　将底物 pNPP加入底物缓冲液中 ,终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,每孔加入 100μL,室温避光孵育30 min。必要时每孔加入 50 μL 3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应 。

　　B.2.6 读数

　　30 min后用酶标仪在 405 nm 处读 OD值 。

　　B.3 结果判定

　　B.3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值均<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 ; 阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >5~ 10;同一样品的重复性基本一致 。否则不能进行结果判断 。

　　B.3.2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果可判断如下 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重新进行试验 ,或用其他方法加以验证 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 。

　　注 : 或者按照商品化 DAS-ELISA试剂盒操作程序进行操作 。

　　附 录 C (规范性附录)常规 PCR检测

　　C. 1 主要试剂

　　C. 1. 1 提取缓冲液

　　2% CTAB,20 mmol/LEDTA,100 mmol/LTris-HCl(pH8. 0) ,1. 4 mol/L NaCl,用前加 0. 2%巯基乙醇 。

　　C. 1.2 电泳缓冲液 TAE(50× )

　　C. 1.3 溴化乙锭(EB)溶液(10μg/μL)

　　溴化乙锭 20 mg

　　灭菌去离子水 20 mL

　　C.2 实验步骤

　　C.2. 1 植物总 DNA提取

　　取植株材料约 0. 1 g,置于研钵中加液氮研磨成粉状 ,迅速加入 600 μL 的 2% CTAB抽提缓冲液(65 ℃水浴预热) ,稍作研磨混匀 ;研磨液转入 1. 5 mL离心管中 , 65 ℃水浴 30 min~ 45 min,期间不时摇匀 ,使其充分混匀 ;取出后 ,加入 300 μLTris饱和酚与 300 μL三氯甲烷/异戊醇(24 ∶ 1) ,混匀 ,剧烈振荡 30 s;室温下 ,12 000g 离心 10 min;取上清液置于新的离心管中 ,加入 1/10体积 3 mol/L NaAc (pH 5. 2)和 2倍体积预冷的无水乙醇 ,混匀 ,置于 -20℃冰箱 20min以上;4℃ ,12000g 离心 10min,弃上清液 ;用 70%乙 醇 和 无 水 乙 醇 分 别 洗 DNA 沉 淀 一 次 , 室 温 下 风 干 ; 沉 淀 溶 于 200 μL TE 中(含RNaseA 10 μg/mL,pH 8. 0) ,37 ℃孵育 1 h, -20 ℃保存备用 。

　　注 : 或者按照商品 DNA提取试剂盒进行操作 。

　　C.2.2 PCR反应

　　C.2.2. 1 PCR 引物

　　SSV-F:5'-TCTCAAGCCAGGTATTTATTGC-3',SSV-R:5'-ATGAAGACGGAGGGTATCACAT-3'。目的扩增产物长度为 465bp。

　　C.2.2.2 PCR反应体系

　　PCR反应体系见表 C. 1。每个样品设 2个平行处理 。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以含甘蔗线条病毒的 DNA 或含有甘蔗线条病毒目标片段的质

　　粒作为阳性对照 , 以健康植物材料作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　PCR反应条件 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 35 s,54 ℃ 35 s,72 ℃ 35 s,30个循环;72 ℃ 10 min延伸 。

　　表 C. 1 PCR反应体系

　　C.3 琼脂糖凝胶电泳检测

　　C.3. 1 制备凝胶

　　用 1×TAE配制 1. 2%琼脂糖凝胶 ,加热溶化后冷却至 55 ℃左右 。

　　C.3.2 加溴化乙锭

　　将 5 μL溴化乙锭(EB)加入到配制好的 100mL凝胶中 。将凝胶倒入凝胶槽中 ,插上样品梳子 。冷却凝固后拔掉梳子 ,在电泳槽内加入 1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约 1 mm。

　　C.3.3 加样

　　将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔 , 同时设计 PCR 的阴性对照和阳性对照 ,并加入分子量标准物(Marker) 。

　　C.3.4 电泳

　　接通电源 , 以 3 V/cm~ 5 V/cm 电场强度进行电泳 ,0. 5 h后观察结果 。

　　C.3.5 结果观察

　　电泳结束后 ,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察 ,记录结果 。

　　C.4 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现预期大小的条带 ,样品未出现预期大小的条带 ,则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性 。

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现预期大小的条带 ,样品出现预期大小条带 ,可通过测序的方式进一步确认 。如果 PCR产物序列与甘蔗线条病毒的序列一致 ,则可判定样品为甘蔗线条病毒阳性 ,若序列不一致 ,则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 PCR检测

　　D. 1 试剂

　　核酸提取试剂同 C. 1。

　　TaqMan PCR Mixture。

　　D.2 引物探针

　　引物序 列 : SSV-Fq: 5'- CCTCTCTCCCAGTATGTA-3', SSV-Rq: 5'- TGTCCATTAGAACCT- GAA -3'。

　　探针序列 :SSV-P: 5'-FAM-CGTATGCTCTGACCTTGTTGGC-TAMRA-3'。

　　D.3 核酸提取

　　方法同 C. 2. 1。

　　D.4 实时荧光 PCR反应

　　实时荧光 PCR反应体系见表 D. 1,每个样品及对照设 2个平行处理 。检测时以含 SSV 的材料作为阳性对照 ; 以健康植物材料作为阴性对照 ; 以水代替 DNA模板作为空白对照 。

　　表 D. 1 实时荧光 PCR反应体系

　　反应条件 :95 ℃10 min; 95 ℃ 5 s,60 ℃30 s,40个循环 。

　　点击运行 ,进行 PCR反应 ,保存文件 ,打开分析软件 ,仪器自动分析试验结果 , 给出 ΔRn(荧光信号增加值)与循环数之间关系的图像 。

　　D.5 结果判定

　　在空白对照及阴性 对 照 无 Ct值 且 无 扩 增 曲 线 、阳 性 对 照 Ct值 ≤30并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条件下 :

　　— 待测样品的 Ct值 ≥40时 ,判定 SSV 阴性 。

　　— 待测样品的 Ct值 ≤35时 ,判定 SSV 阳性 。

　　— 待测样品的 35

　　参 考 文 献

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