GB/T 33115-2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33115—2016

　　水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofNarcissuslateseason yellowsvirus

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33115—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、福建农林大学 。

　　本标准主要起草人 :沈建国 、李敏 、蔡伟 、李桂芬 、张永江 、虞赟 、于文涛 、郭立新 、高芳銮 、吴祖建 。

　　水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了水仙迟季黄化病毒(Narcissuslateseason yellowsvirus)的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于可能携带水仙迟季黄化病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　3 水仙迟季黄化病毒基本信息

　　中文名 :水仙迟季黄化病毒 。

　　学名 :Narcissuslateseason yellowsvirus,缩写 :NLSYV。

　　分类地位 :马铃薯 Y病毒科(Potyviridae) ,马铃薯 Y病毒属(Potyvirus) 。

　　水仙迟季黄化病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据 。

　　5 仪器、用具及试剂

　　5. 1 仪器

　　高速冷冻离心机 、电子天平 、PCR仪 、荧光 PCR仪 、水平电泳系统 、-20 ℃低温冰箱和 -80℃超低温冰箱 、凝胶成像分析系 统、pH 计 、微 波 炉 、磁 力 搅 拌 器 、恒 温 水 浴 锅 、高 压 灭 菌 锅 、超 净 工 作 台 、酶 标仪等 。

　　5.2 用具

　　酶联板 、可调移液器(2. 5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)和可调移液器头 、离心管 、研钵等 。

　　5.3 试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。PTA-ELISA检测

　　GB/T 33115—2016

　　试剂见附录 B;RT-PCR检测试剂见附录 C;实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 D。

　　6 抽样和样品制备

　　6. 1 抽样

　　抽样方法按照 SN/T 2122 中规定执行 。

　　6.2 样品制备

　　分别按照有症和无症进行样品制备 ,具体方法按照 SN/T 2964和 SN/T 3457中规定执行 。

　　7 检测鉴定

　　7. 1 PTA-ELISA检测

　　以含 NLSYV材料作为阳性对照 , 以不含 NLSYV 的健康植物组织作阴性对照 , 同时以样品提取缓冲液作为空白对照 ,具体操作见附录 B。

　　7.2 RT-PCR检测

　　以含 NLSYV材料作为阳性对照 , 以不含 NLSYV 的健康植物组织作阴性对照 , 同时以 ddH2 O 代替模板作为空白对照 。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后进行 PCR检测 ,具体操作见附录 C。如采用商品化一步法试剂盒 ,则按照试剂盒说明进行 。

　　7.3 实时荧光 RT-PCR检测

　　以含 NLSYV材料作为阳性对照 , 以不含 NLSYV 的健康植物组织作阴性对照 , 同时以 ddH2 O 代替模板作为空白对照 。分别提取样品和对照的总 RNA,进行实时荧光 RT-PCR 检测 ,具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒 ,则按照试剂盒说明进行 。

　　8 结果判定

　　样品检测时 ,检测流程及结果判定按下述原则进行 :

　　—PTA-ELISA初步筛检 ,若检测结果为阴性 ,则判定样品不携带 NLSYV;若检测结果为阳性 ,则采用 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法进行验证 。

　　— 若验 证 结 果 为 阳 性 , 则 判 定 样 品 携 带 NLSYV; 若 验 证 结 果 为 阴 性 , 则 判 定 样 品 不 携 带NLSYV。

　　9 样品保存与结果记录

　　9. 1 样品保存

　　经检测确定携 带 NLSYV 的 样 品 应 保 存 在 适 合 的 条 件 下 以 备 复 核 。 种 苗 、叶 片 等 样 品 保 存 在-80 ℃冰箱中 ;做好登记和标记工作 ,保存期限至少 6个月 。

　　9.2 结果记录

　　记录包括样品来源 、样品种类 、检测时间 、检测地点 、检测方法和结果 、检测人员签字 。PTA-ELISA检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片 ;实时荧光 RT-PCR检测应有实时荧光结果图片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　水仙迟季黄化病毒相关资料

　　A. 1 寄主范围

　　寄主范围较窄 , 已报道的寄主为水仙(Narcissustazetta L. ) 。

　　A.2 病害症状

　　侵染水仙后引起叶片 、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状(参见图 A. 1) 。

　　图 A. 1 NLSYV侵染水仙后引起的症状

　　A.3 分布地区

　　主要分布于英国 、荷兰 、新西兰 、中国等国家 。

　　A.4 传播途径

　　主要由桃蚜(Myzuspersicae)传播 。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒体为线条状 ,大小约 750 nm×12 nm(参见图 A. 2) 。

　　注: 引自 http://www. dpvweb. net。

　　图 A.2 NLSYV病毒粒体

　　A.6 病毒基因组

　　正义单链 RNA病毒 ,全长约 9 651 bp。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被缓冲液(pH 9.6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　加入蒸馏水 900 mL,用 HCl调节 pH值到 9. 6,然后加蒸馏水至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)

　　氯化钠(NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4,然后加水至 1 L。

　　B. 1.3 PBST

　　每升 PBS中加入 0. 5 mL 的吐温-20。

　　B. 1.4 抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液

　　三羟基氨甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 13. 0 g

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2. 0 g

　　氯化钠(NaCl) 9. 0 g

　　吐温-20(Tween-20) 25. 0 mL

　　脱脂奶粉 50. 0 g

　　加入蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.5 底物(pNPP)缓冲液(pH 9.8)

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　二乙醇胺[HN(CH2CH · OH) 2 ] 97. 0 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,用 HCl调节 pH值至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.6 抗体

　　病毒抗体 :水仙迟季黄化病毒抗体 。

　　酶标抗体 :碱性磷酸酶标记羊抗兔 IgG。

　　B.2 操作步骤

　　B.2. 1 样品制备

　　称取 0. 5 g ~ 1. 0 g 待 测 样 品,按 1 ∶ 10(质 量 ∶ 体 积) 比 例 加 入 包 被 缓 冲 液 , 用 研 钵 研 磨 成 浆 , 8000g离心 5 min,上清液即为制备好的检测样品,保存于 -20℃冰箱 。 阴性对照 、阳性对照作相应的处理或按说明书进行 。

　　B.2.2 包被抗原

　　加入制备好的检测样 品 , 同 时 设 置 阴 性 对 照 、阳 性 对 照 和 空 白 对 照 。 每 个 处 理 至 少 设 2 个 重 复 。 100 μL/孔 ,37 ℃孵育 1 h或 4 ℃冰箱孵育过夜 ,倒去酶联板孔中溶液 ,用 PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.3 加病毒抗体

　　将病毒抗体按说明稀释至工作浓度 ,加入到酶联板的孔中 , 100 μL/孔 ,37 ℃孵育 1 h,倒去酶联板孔中溶液 ,用 PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.4 加酶标抗体

　　将酶标抗体按说明将稀释至工作浓度 ,加入到酶联板的孔中 , 100 μL/孔 ,37 ℃孵育 1 h,倒去酶联板孔中溶液 ,用 PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.5 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100μL/孔 ,加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B.2.6 吸光值的测定

　　阳性对照孔显色后 ,用酶联仪于 405 nm 处读 OD值 。

　　B.3 结果判断

　　在满足阴性对照孔的 OD405值<0. 15、阳性对照孔的 OD405值/阴性对照孔的 OD405值 >5~ 10,孔的重复性基本一致的质量要求后 ,样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 。样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重新做一次 , 或用其他方法加以验证 。样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 。

　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 TRIzol裂解液 。

　　C. 1.2 5×TBE缓冲液 :

　　Tris碱 54. 0 g

　　硼酸(H3BO3 ) 27. 5 g

　　0. 5 mol/LEDTA(pH8. 0) 20 mL

　　补充蒸馏水至 1 L。用时加蒸馏水稀释至 0. 5×TBE。

　　C. 1.3 三氯甲烷 。

　　C. 1.4 异丙醇 。

　　C. 1.5 75%乙醇 。

　　C. 1.6 无水乙醇 。

　　C. 1.7 RT缓冲液 。

　　C. 1. 8 dNTPs:10 mmol/L。

　　C. 1.9 M-MLVRT:200 U/μL。

　　C. 1. 10 RNA酶抑制剂 :40 U/μL。

　　C. 1. 11 Taq DNA 聚合酶 。

　　C. 1. 12 PCR缓冲液 。

　　C. 1. 13 MgCl2 :25 mmol/L。

　　C. 1. 14 引物序列 :

　　根据已报道的 NLSYV基因组序列设计 1对用于特异性扩增的引物 :

　　NLSYVf:5'-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3'

　　NLSYVr:5'-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3'

　　PCR产物大小 938bp。

　　C.2 RT-PCR检测

　　C.2. 1 总 RNA提取

　　取 0. 1 g样品组织置于研钵中 ,加入 1 mL PBST缓冲液研磨 ,4 ℃ ,10 000g 离心 5 min,取上清液(100μL~ 200μL)迅速转移至灭菌的 1. 5 mL离心管中 ,并加入 1 mL TRIzol试剂 ,剧烈振荡后 ,室温静置 5 min;4℃ ,12000g 离心 10min,取上清液 ;加入三氯甲烷 300μL,剧烈振荡 15 s,室温静置 5 min, 4 ℃ ,12 000g 离心 15 min,取上层水相 ;加入等体积的异丙醇 ,颠倒混匀后室温下静置 15 min,4 ℃ , 12 000g离心 10 min,弃上清液 ;加入 1 mL 75%乙醇洗涤沉淀 2 次 ,每次 4 ℃ ,7 500 g 离心 3 min,弃上清液;RNA沉淀干燥后 ,用 20 μL~40μL经 DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的 ddH2 O 溶解 , -20℃保存备用 。

　　C.2.2 cDNA合成

　　在 PCR管中加入 2 μL总 RNA, 1 μL 下游引物 NLSYVr(10 μmol/L) , ddH2 O 5 μL, 70 ℃水 浴10 min,迅 速 冰 浴 5 min, 再 加 入 下 列 试 剂 : 5 × RT 缓 冲 液 2. 5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 1 μL、M- MLVRT(200U/μL)0. 5 μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)0. 5 μL。42℃水浴 60min,70℃水浴 10min, 自然冷却至室温 , -20 ℃保存备用 。

　　C.2.3 PCR扩增

　　PCR反应体系见表 C. 1,每个反应设置 2个重复 。

　　PCR反应条件 :94 ℃预变性 3 min,然后 94 ℃变性 30 s、56 ℃ 退火 45 s、72 ℃延伸 1 min,35个循环 ,最后一个循环结束后 72 ℃继续延伸 10 min。

　　表 C. 1 PCR反应体系

　　C.2.4 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　C.2.4. 1 阴性对照 :不含病毒的健康植物组织 。

　　C.2.4.2 阳性对照 :含有 NLSYV材料 。

　　C.2.4.3 空白对照 :ddH2 O。

　　C.2.5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1. 5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 , 对 PCR 产 物 进 行 电 泳 。 电 泳 结 束 后 , 在 溴 化 乙 锭 (EB, 浓 度 为0. 5 μg/mL)溶液染色 10min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带 ,拍照并做记录 。

　　C.2.6 结果判断

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增 , 阳性对照在 938 bp大小处有扩增条带 ,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 ,则判定为阳性 。

　　如果阴性对照和空白对照无特异性扩增 , 阳性对照在 938 bp大小处有扩增条带 ,待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 ,则判定为阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测

　　D. 1 试剂

　　核酸提取 、反转录试剂同 C. 1。

　　D.2 引物及探针

　　实时荧光 RT-PCR检测引物及探针见表 D. 1。

　　表 D. 1 实时荧光 RT-PCR检测引物及探针

　　D.3 总 RNA提取

　　方法同 C. 2. 1。

　　D.4 cDNA合成

　　方法同 C. 2. 2。

　　D.5 实时荧光 PCR反应

　　实时荧光 PCR反应体系见表 D. 2,每个反应设置 2个重复 。

　　反应程序 :95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共 40个循环 。

　　表 D.2 实时荧光 PCR反应体系

　　D.6 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　D.6. 1 阴性对照 :不含病毒的健康植物组织 。

　　D.6.2 阳性对照 :含有 NLSYV材料 。

　　D.6.3 空白对照 :ddH2 O。

　　D.7 结果判定

　　在空白对照及阴性 对 照 无 Ct值 且 无 扩 增 曲 线 、阳 性 对 照 Ct值 ≤30并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条件下 :

　　— 待测样品的 Ct值 >40时 ,判定 NLSYV 阴性 ;

　　— 待测样品的 Ct值<35时 ,判定 NLSYV 阳性 ;

　　— 待测样品的 35≤Ct值 ≤40时 ,应重新进行测试 ;如果重新测试的 Ct值 ≥40时 ,判定 NLSYV阴性 ;如果重新测试的 Ct值<40,则判定 NLSYV 阳性 。