GB/T 33116-2016 琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33116—2016

　　琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofAcustadespecta (Gray, 1839)

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33116—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 、中国科学院动物研究所 。

　　本标准主要起草人 :周卫川 、王沛 、崔俊霞 、吴志毅 、肖琼 、陈德牛 。

　　琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了琉球球壳蜗牛 Acusta despecta (Gray,1839)的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于琉球球壳蜗牛的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 3067 软体动物常规检疫规范

　　3 术语和定义

　　SN/T 3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　膜厣 epiphragm

　　蜗牛分泌的一种与壳口同样大小和形状的乳白色不透明黏液膜 ,用以封闭壳 口 。

　　3.2

　　阴茎 penis

　　蜗牛雄性生殖器官 。

　　注 : 阴茎系统一般由阴茎 、阴茎本体 、阴茎牵引肌和鞭状体组成 。

　　3.3

　　矢囊 dartsack

　　蜗牛雌性生殖系统中一个藏有 1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构 。

　　3.4

　　恋矢 lovedart

　　矢囊中钙质或壳质的骨针 ,为蜗牛交配时刺激器官 。

　　注 : 恋矢的质地和形状常用于分类 。

　　3.5

　　受精囊 bursa copulatrix

　　蜗牛的受精器官 , 由受精囊和受精囊柄组成 。

　　注 : 其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定 。

　　4 基本信息

　　学名 :Acusta despecta (Gray,1839) , 其 亚 种 有 :A. despecta despecta (Gray,1839) ;A. despecta praetenuis (Pilsbry & Hirase,1904) ;A. despecta sieboldiana (Pfeiffer,1850) 。

　　异名 :Helix despecta Gray,1839;A. despecta Sowerby, 1839;Eulota sieboldiana Pfeiffer, 1905;

　　GB/T 33116—2016

　　Eulotakikaiensis Pilsbry,1902;A. despectaikiensis (Pilsbry & Hirase,1904) ;A. despecta kikaiensis (Pilsbry,1902) 。

　　英文名 :Ryukyu round snail;Korean round snail。

　　分类地位 :琉球球壳 蜗 牛 A. despecta (Gray,1839) , 在 分 类 上 属 于 软 体 动 物 门 Mollusca,腹 足 纲Gastropoda,柄眼目 Stylommatophora, 巴蜗牛科 Bradybaenidae,球壳蜗牛属 Acusta Albers, 1860。 琉球球壳蜗牛的近似种有灰球壳蜗牛 A. ravida (Benson, 1842) 、红粉缘球壳蜗牛 A. tourannensis (Sou- leyet,1842) 。

　　5 方法原理

　　琉球球壳蜗牛昼伏夜出 ,常隐藏在人们难以发现的地方 ,易于传播 。其传播特点是不需要特定的寄主 ,凡接触过地面的物品都可传播 。传播方式和途径是确定现场检疫方式的依据 。 贝壳形态 、软体解剖和分子特征是实验室鉴定的主要依据 。

　　6 器具和试剂

　　6. 1 器具

　　体视显微镜 、放大镜 、手电筒 、塑料自封袋 、广口标本瓶 、4 mm 孔径土壤筛 、小铁铲 、游标卡尺 、白瓷盘 、培养 皿 、镊 子 、剪 刀 、显 微 镊 子 、显 微 剪 刀 、微 针 、解 剖 蜡 盘 、标 签 、移 液 枪 、微 型 离 心 机 、PCR 仪 、 1. 5 mL离心管 、0. 2 mL PCR反应管 、恒温金属浴 。

　　6.2 试剂

　　75%乙醇 、无水乙醇 、硫酸镁 、动物基因组 DNA提取试剂盒 、PCR反应液 、ddH2 O。

　　7 现场检测

　　对来自疫区(参见附录 A)的运输工具和货物实施重点查验 。仔细检查运输工具 、废塑料 、木质包装箱 、苗木 、水果 、蔬菜 、花卉 、未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着其上 ,琉球球壳蜗牛昼伏夜出 ,尤其要注意阴暗蔽光处的检查 ,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹 。琉球球壳蜗牛爬行过后 ,会留下银灰色的丝带状黏液痕迹 ,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据 。 发现蜗牛标本 , 随时装入塑料自封袋或标本瓶 ,带回实验室做进一步的检验鉴定 。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时 ,需过筛检查是否有卵或幼螺 。

　　8 实验室鉴定

　　8. 1 测量观察和软体解剖

　　用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽 、卵粒直径 。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征 。

　　将闷杀(见 10. 1)处理后的标本 ,参照 SN/T 3067解剖软体 ,分离出生殖系统 。

　　8.2 球蜗牛属 Acusta Albers, 1860鉴定特征

　　贝壳圆球形 ,有脐孔 ,体螺层特大 ,膨胀 ,胚螺层常光滑 , 口缘呈椭圆形 , 口唇简单 ,锋利 。 阴道上的矢囊十分长 ,恋矢石灰质 ,无鞭状体 。

　　8.3 琉球球壳蜗牛 A. despecta (Gray,1839)鉴定特征

　　8.3. 1 卵

　　卵粒圆形 , 白色 ,直径 2. 0 mm 左右 。

　　8.3.2 贝壳

　　8.3.2. 1 成螺

　　贝壳中等大小 ,壳质薄 ,但坚固 ,呈圆球形 。有 5个 ~ 6个螺层 ,前几个螺层均匀增长 , 略凸出 ,螺旋部低矮 ,呈矮圆锥形 。体螺层增长迅速 ,下部特别膨大 ,呈弧形 。壳顶钝 ,缝合线深 。壳面为褐黄色或淡褐色或赤褐色 ,具有细致而稠密的生长线和较粗的皱纹 。壳口宽大圆形 , 口缘简单 ,不外折 ,锋利 , 内唇贴覆于体 螺 层 上 形 成 细 薄 的 淡 白 色 胼 胝 部 , 轴 缘 外 折 , 略 遮 盖 脐 孔 。 脐 孔 狭 小 , 呈 孔 穴 状 。 壳 高17. 5 mm~ 21. 0 mm ,壳宽 21. 0 mm~ 23. 0 mm。参见附录 B 中图 B. 1。

　　本种有三个亚种 : 琉球球壳蜗牛指名亚种 A. despecta despecta (Gray,1839) ;锡伯琉球球壳蜗牛A. despecta sieboldiana (Pfeiffer, 1850) ; 镶 边 琉 球 球 壳 蜗 牛 A. despecta praetenuis (Pilsbry & Hirase,1904) 。各亚种之间在形态上基本一致 ,略有微小差异 。参见附录 C 中表 C. 1。

　　8.3.2.2 幼螺

　　幼螺贝壳较小 ,壳质薄 ,透明 ,易碎 ,形态特征与成螺贝壳基本一致 。

　　8.3.3 螺体

　　动物软体多为淡灰色到茶色 ,螺体色泽变化较大 ,一般透过贝壳可以看到动物外套膜的形态 。触角颜色明显比腹足为深 。参见图 B. 2。

　　8.3.4 生殖系统

　　输卵管短 、粗大 。 阴道有部分插入到矢囊 ,远端稍呈球形到扁球形 。 副矢囊被压扁成弧状 , 中间有两枝黏液腺 ,分叉成葡萄状 。输精管和阴茎本体之间的界限不明显 。 阴茎牵引肌的基部稍变粗 。 阴茎鞘明显比阴茎牵 引 肌 肥 厚 , 粗 细 均 匀 。 受 精 囊 顶 部 稍 肥 厚 , 其 后 逐 渐 变 细 。 受 精 囊 呈 小 乳 头 状 。 参见图 B. 3。

　　8.3.5 COI基因序列鉴定

　　按附录 D方法提取 DNA、PCR扩增和双向测序 ,将所测序列与已知琉球球壳蜗牛的 COI基因序列(Genbank登录号为 AB852623. 1)进行比对 ,相似度一般应 ≥92% 。参见附录 D。

　　9 结果评定

　　以贝壳形态为基本鉴定依据 ,螺体和生殖系统解剖形态为辅助鉴定特征 ,并注意与近似种鉴别(参见表 C. 2) ,符合 8. 3. 2 或同时符合 8. 3. 2、8. 3. 3、8. 3. 4 形态特征的蜗牛鉴定为琉球球壳蜗牛 A. despecta (Gray,1939) 。单独查获的卵粒符合 8. 3. 1 形态特征 ,应通过孵化和饲养实验(参见 SN/T 3067) ,做进

　　一步的鉴定 。符合 8. 3. 5作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证 。

　　10 标本处理和保存

　　10. 1 标本处理

　　将蜗牛置于盛满水的瓶中 ,盖上瓶盖 ,进行闷杀 ,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中 ,逐渐伸展身体 ; 或逐渐加入少量硫酸镁 ,进行麻醉闷杀 。

　　将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡 1 d~ 2 d,然后在 75%乙醇溶液中固定 ,每隔 1 d~ 2 d 换 1 次乙醇溶液 ,共换 3 次 ~4次 ,便可长期保存于 75%乙醇溶液中 。

　　10.2 标本保存

　　经处理后的标本 ,至少妥善保存 6个月 ,并注明时间 、产地 、寄主 、采集人等信息 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　琉球球壳蜗牛寄主、地理分布及其他信息

　　A. 1 寄主植物

　　杂食性 , 以各种绿色植物为食 。幼螺以腐殖质 、植物的幼苗和嫩芽为食 ;成螺取食各种绿色植物的茎 、叶和果实 ,喜食蔬菜和花卉等园艺作物 。

　　A.2 地理分布

　　日本 、朝鲜 、缅甸 、东帝汶 、前苏联 、美国(关岛) 、中国(台湾) 。

　　A.3 生物学习性与危害性

　　琉球球壳蜗牛 Acusta despecta (Gray,1939) 是我国颁布的进境植物检疫性有害生物 。该蜗牛有明显的夏眠和冬眠习性 ,常以蜡状膜厣封闭壳口越冬越夏 。 当环境条件不利时 ,尽管不在休眠季节 ,该螺也会分泌黏液形成白色的膜厣封住壳 口 , 以抵御外界不良环境 ,该蜗牛的这一习性决定了它可在无水分和食物的情况下长时间远距离传播 。琉球球壳蜗牛是一种重要的农业 、园艺有害生物 ,常危害粮 、棉 、麻 、蔬菜 、豆类等农作物以及桑 、果树 、花卉 、烟草等经济作物 。该蜗牛不但直接危害作物 ,而且蜗牛爬行过后留下的白色黏液痕迹 ,大大降低了水果蔬菜的商品价值 , 同时该蜗牛可传播人畜共患寄生虫病 ,影响人类健康和畜牧生产 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　琉球球壳蜗牛形态及生殖系统特征

　　图 B. 1 和图 B. 2分别为锡伯琉球球壳蜗牛成螺贝壳形态及成螺形态 , 图 B. 3 为镶边琉球球壳蜗牛生殖系统特征 。

　　图 B. 1 锡伯琉球球壳蜗牛成螺贝壳形态

　　图 B.2 锡伯琉球球壳蜗牛成螺形态

　　说明 :

　　P — 阴茎 ;

　　PR — 阴茎牵引肌 ;

　　VD — 输精管 ;

　　S — 矢囊 ;

　　AS — 副矢囊 ;

　　MG — 黏液腺 ;

　　PBC — 受精囊柄 ;

　　BC — 受精囊 ;

　　HD — 二性管 ;

　　AG — 蛋白腺 。

　　图 B.3 镶边琉球球壳蜗牛生殖系统特征

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　琉球球壳蜗牛各亚种及近似种的鉴别特征比较

　　琉球球壳蜗牛各亚种及近似种的鉴别特征比较见表 C. 1 和表 C. 2。

　　表 C. 1 琉球球壳蜗牛三个亚种鉴别特征比较

　　表 C.2 琉球球壳蜗牛与近似种的鉴别特征比较

　　表 C.2 (续)

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　琉球球壳蜗牛 COI基因辅助鉴定方法

　　D. 1 DNA提取

　　取适量腹足肌肉 ,用 SDS方法或动物基因组 DNA试剂盒方法提取 DNA。

　　D.2 COI基因引物

　　LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3'

　　HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

　　D.3 反应体系

　　反应体系为 20 μL: 其 中 DNA 模 板 2μL, LCO1490(10 μmol/L) 0. 5μL, HCO2198(10 μmol/L)

　　0. 5 μL,2×Master Mix 10 μL,ddH2 O 7 μL。

　　D.4 PCR扩增条件

　　94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,45 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,30个 ~ 35个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃ 。

　　D.5 测序

　　将 PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序 。

　　D.6 比对鉴定

　　将双向测序获得的 600bp~ 700bp长度的 DNA序列片段 ,经软件拼接和人工校对后 ,与已知琉球球壳蜗牛的 COI基因序列(Genbank 登录号为 AB852623. 1) 进行比对 ,相似度 ≥92%的待鉴样品确定为琉球球壳蜗牛的疑似样品 。