GB/T 33114-2016 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33114—2016

　　李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPrunusnecroticringspotvirus

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33114—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 、福建省农业科学院 。

　　本标准主要起草人 :张永江 、黄迎波 、孔君 、谢丽雪 、李桂芬 、马洁 、辛言言 、魏梅生 。

　　李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus)的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于可能携带李属坏死环斑病毒的植物及其产品的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　3 李属坏死环斑病毒基本信息

　　学名 :Prunusnecroticringspotvirus

　　缩写 :PNRSV

　　分类地位 :雀麦花叶病毒科(Bromoviridae) ,等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus) 。

　　李属坏死环斑病毒其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　李属坏死环斑病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 。根据 PNRSV 与抗体之间的特异性反应 ,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) ;依据 PNRSV 的基因组特征建立 RT-PCR、实 时 荧 光 RT-PCR 检 测 方 法 ; 通 过 这 些 方 法 的 有 效 组 合 , 判 断 样 品 是 否 带 有PNRSV。

　　5 仪器、用具及试剂

　　5. 1 仪器

　　电子天平(感量 0. 001 g) 、高速冷冻离心机 、小型瞬时离心机 、普通冰箱 、超低温冰箱(-80 ℃) 、制冰机 、旋涡振荡器 、磁力搅拌器 、高压灭菌锅、pH计 、超净工作台 、PCR仪 、微波炉 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像分析仪 、酶标仪 。

　　5.2 用具

　　酶联板 、可调移液器(2. 5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)和可调移液器头 、Eppendorf管 、研钵 、微型磨杵等 。

　　GB/T 33114—2016

　　5.3 试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。DAS-ELISA试剂见附录 B;RT-PCR检测试剂见附录 C;实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 D。

　　6 抽样和样品制备

　　6. 1 抽样

　　有病毒为害症状的植物材料单独抽样 ,PNRSV 的为害症状描述参见附录 A;无症状的种子 、苗木及其产品抽样方法按照 SN/T 2122 中规定执行 。

　　6.2 样品制备

　　样品制备参照 SN/T 2964和 SN/T 3457规定执行 。

　　苗木及其组培苗等产品:有明显症状的 ,直接取有症状叶片 1 g单独制样 ,用于后续检测 ;无明显症状的 ,可 5 株叶片混合采样用于后续检测 。

　　7 检测鉴定

　　7. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　把制备的样品上清液加入已包被 PNRSV 抗体的酶联板中 ,进行 DAS-ELISA 检测 。 每个样品平行加到两个孔中 。健康的植物组织作为阴性对照 ,感染 PNRSV 的植物组织作为阳性对照 ,样品提取缓冲液作为空白对照 ;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致 。具体操作见附录 B。

　　7.2 RT-PCR检测

　　RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同 7. 1,灭菌双蒸水作为空白对照 。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成 cDNA后进行 PCR检测 ,具体操作见附录 C。

　　7.3 实时荧光 RT-PCR检测

　　实时荧光 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同 7. 1,灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后进行实时荧光 PCR检测 ,具体操作见附录 D。如采用商品化一步法试剂盒 ,则按照试剂盒说明进行 。

　　8 结果判定

　　样品检测时 ,检测流程及结果判定按下述原则进行 :

　　— 首先采用 DAS-ELISA进行初步筛检 。

　　— 若检测 结 果 为 阳 性 , 采 用 RT-PCR 方 法 进 行 验 证 , 若 验 证 结 果 为 阳 性 , 则 判 定 样 品 携 带PNRSV。若验证结果为阴性 ,则采用实时荧光 RT-PCR 进行进一步验证 。若进一 步 验 证 的结果为阴性 , 则 判 定 样 品 不 携 带 PNRSV;若 进 一 步 验 证 的 结 果 为 阳 性 , 则 判 定 样 品 携 带PNRSV。

　　— 若检测结果为 阴 性 , 采 用 RT-PCR 方 法 进 行 验 证 , 若 验 证 结 果 为 阴 性 , 则 判 定 样 品 不 携 带

　　PNRSV; 若 RT-PCR验证结果为阳性 ,则需要将 PCR产物进行测序 ,序列结果相符则判定样品携带 PNRSV。

　　9 样品保存与结果记录

　　9. 1 样品保存

　　经检测确定携带 PNRSV 的 样 品 应 保 存 在 适 合 的 条 件 下 以 备 复 核 。 如 种 苗 、叶 片 等 样 品 保 存 在-80 ℃冰箱中 ;做好登记和标记工作 ,保存期限至少 1 年 。

　　9.2 结果记录

　　记录包括样品来源 、种类 、检测时间 、地点 、方法和结果 、检测人员签字 。DAS-ELISA 检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片和测序结果 ;实时荧光 RT-PCR检测应有荧光曲线图 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　李属坏死环斑病毒相关资料

　　A. 1 寄主范围

　　该病毒寄主范围广泛 , 自然和实验接种侵染 21科双子叶植物 ,该病毒可侵染大多数李属植物 ,如 :李(Prunusdomestrica) 、杏(P. armeniaca) 、桃(P. persica) 、樱 桃 李(P. cerasifera) 、欧 洲 酸 樱 桃 (P. cerasua) 、欧洲甜樱桃(P. avium) 、马哈利酸樱桃(P.mahaleb) 、稠李(P. padus) 、油桃(P. persica var. nectarina) 、野黑樱(P. serotina) 、黑 刺 李 (P. spinosa) 等 ; 该 病 毒 可 侵 染 玫 瑰 (Rosa rugosa) 、啤 酒 花(Humuluslupulus)等 。在人工接种的情况下还可侵染 180余种植物 。

　　A.2 为害症状

　　病害症状因分离物 、栽培种和环境条件不同而不同 。病毒的一些分离物不引起症状 ,仅仅在接种指示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染 ;一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑和孔洞 ,但在以后的年份里 ,在叶子和果实上很少出现症状 ;另一些分离物在侵染当年产生坏死反应 , 随后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死 、叶子耳突 、畸形 、延迟水果成熟,水果上有斑点症状 。如在甜樱桃上出现了无症状到严重皱缩花叶症状 ,包括叶子上的褪绿点 、叶扭曲 ,水果延迟成熟 。在玫瑰上无症状侵染很普遍 ,症状有花叶 、开花延迟 、秋天落叶早 、产生更多不成形的花 ,被侵染的植株通常无活力 。在啤酒花上产生褪绿线和环斑 。

　　A.3 分布地区

　　广泛分布在温带地区 ,如欧洲各国和美国都有发生 。

　　A.4 传播方式

　　机械接种传播 、花粉传播 、种子传播 ,也可通过无性繁殖苗木 、组培苗等的运输人为途径进行长距离传播 。

　　A.5 粒体形态

　　李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体 ,直径 23 nm~ 27 nm ,有些粒体为准等轴球状到短棒状(轴比为 1. 01~ 1. 5) ;有些株系的病毒粒体呈明显的棒状(轴比大于 2. 2) ;有些棒状粒体达 70 nm。棒状粒体的有无及比例因株系而异 。

　　A.6 基因组

　　正单链 RNA,3分体基因组 ,RNA-1长 3. 662kb,RNA-2长 2. 507kb,RNA-3长 1. 887kb。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的李属坏死环斑病毒抗体 。

　　B. 1.2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体 。

　　B. 1.3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP) 。

　　B. 1.4 1×PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　吐温-20(Tween-20) 0. 5 mL

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中 ,并定容至 1 000 mL,4 ℃储存 。

　　B. 1.5 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP, MW24000~40000) 20. 0 g

　　溶于 900 mL 的 1×PBST 中 ,并用 1×PBST定容至 1 000 mL,4 ℃储存 。

　　B. 1.6 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中 ,并定容至 1 000 mL,4 ℃储存 。

　　B. 1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH 7. 4)

　　牛血清白蛋白(BSA) 2. 0 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP, MW24000~40000) 20. 0 g

　　溶于 900 mL 1×PBST 中 ,并用 1×PBST定容至 1 000 mL,4 ℃储存 。

　　B. 1. 8 底物缓冲液(pH 9. 8)

　　二乙醇胺 97 mL

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　溶于 800 mL灭菌双蒸水中 ,用浓盐酸(HCl)调 pH值至 9. 8,定容至 1 000 mL,4 ℃储存 。

　　B.2 实验步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体 ,每孔加 100 μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好 ,37 ℃孵育 2 h。清空孔中溶液 ,用 1×PBST加满各孔 ,3 min后倒掉孔中溶液 ,在吸水纸上拍干 。再重复 2 次上述洗板过程 。

　　B.2.2 样品制备与加样

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量浓度)加入抽提缓冲液 ,在研钵中研磨;2 000 r/min离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。 阴性对照 、阳性对照作相应处理或按说明书进行 。按每孔 100μL分别加入制备好的检测样品 、阴性对照和阳性对照 ;酶联板加盖或用保鲜膜包好 ,4 ℃孵育过夜 。 酶联板用 自来水彻底冲洗 ,再用 1×PBST洗涤 3 次 ,每次 3 min。

　　B.2.3 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗 体 稀 释 至 工 作 浓 度 并 加 入 到 酶 联 板 中 , 每 孔 100 μL, 酶联板加盖或用保鲜膜包好 ,37 ℃孵育 4 h。 酶联板用 自来水彻底冲洗 ,再用 1×PBST洗涤 3 次 ,每次3 min。

　　B.2.4 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,每孔 100 μL加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B.2.5 读数

　　在不同的时间内如 30 min、60 min、90 min、120 min或更长时间 ,用酶联仪在 405 nm 处读 OD值 。

　　B.3 结果判定

　　B.3. 1 质量控制要求

　　对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内 , 即缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值 <0. 05时 ,按 0. 05计算 ; 阳性对照 OD405值/阴性对照OD405值 >5;同一样品的重复性基本一致 。

　　B.3.2 结果判定

　　在满足 B. 3. 1 的质量控制要求后 ,结果原则上可判断如下 :样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值在 2左右 ,判为可疑样品,需重新做一次 ,或用其他方法加以验证 ;样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 。

　　若不满足 B. 3. 1 的质量控制要求 ,则不能进行结果判断 。

　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 核酸提取试剂

　　Trizol或合格的 RNA提取试剂盒 。

　　C. 1.2 电泳缓冲液 TAE(50× )

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸(C2 H4 O2 ) 57. 1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H2 O) 37. 2 g

　　灭菌双蒸水定容至 1 000 mL,用时稀释至 1×TAE。

　　C.2 检测步骤

　　C.2. 1 核酸提取

　　称取 0. 1 g样品加液氮研磨成粉末状 ,迅速将其移入灭菌的 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL 的 TrizoL试剂 ,剧烈振荡 3 min;4℃ 12000 r/min离心 10min;将上清液移入一新离心管中 ,加入 0. 5 mL 氯仿 ,猛烈振荡 15 s;4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min;小心吸取上层无色水相到新离心管中 ;加入等体积异丙醇 ,混匀 ;室温静置 10min;4℃ 12000 r/min离心 10min,弃上清 ;加入 1 mL75%的冷乙醇洗涤沉淀 ; 4 ℃ 10000 r/min离心 10min,弃乙醇 ;沉淀于室温下充分干燥后溶于 30μLDEPC-H2 O 中 , -20℃保存备用 。

　　注 : 此处以 0. 1 g样品为例进行核酸提取 ,实际检测时如样品量有变化 ,加入的试剂可按比例调整 ;或者按照商品化RNA提取试剂盒进行操作 。

　　C.2.2 引物序列

　　上游引物 H83: 5'-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG-3'

　　下游引物 C537:5'-ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA-3'

　　产物大小 :455 bp。

　　C.2.3 反转录

　　反应体系 :20 μL;在 0. 2 mL PCR 管中加入总 RNA 1 μL, dNTPs(10 mmol/L) 1 μL,DEPC-H2 O 10 μL,引物 C537(20 μmol/L)2μL,70 ℃保温 5 min;冰上放置 5 min;再加入 5×反转录 buffer4 μL, RNasin(40U/μL)1μL, M-MLV(200U/μL)1μL,42 ℃保温 1 h,得到 cDNA后用作 PCR 的模板 。

　　C.2.4 PCR扩增

　　反应体系 :20 μL;在 0. 2 mL PCR管中加入 10×PCR buffer(含 Mg2+ )2μL,dNTPs(10 mmol/L)

　　0. 6 μL,正向引物及反向引物(均为 20 μmol/L)各 0. 5 μL,Taq酶(2U/μL)1 μL,模板 2 μL和 DEPC- H2 O 13. 4 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :94 ℃ 40 s;60 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;35次循环;72 ℃ 10 min。

　　注 : 如采用商品化一步法 RT-PCR检测试剂盒 ,可按照说明书进行操作 ,将步骤 C. 2. 3 和 C. 2. 4合并进行 。

　　C.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

　　制备 1%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子量标记 ,进行电泳 。 电 泳 结 束 后 在 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 是 否 扩 增 出 预 期 的 特 异 性 DNA 条 带 , 并 拍 摄记录 。

　　C.3 结果判定

　　阳性对照在 455 bp左右处有条带 , 阴性对照和空白对照无特异性条带 ,待测样品出现与阳性对照一致的条带 ,判定为阳性 。

　　阳性对照在 455 bp左 右 处 有 条 带 , 阴 性 对 照 、空 白 对 照 及 待 测 样 品 无 特 异 性 条 带 , 判 定 结 果 为阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测

　　D. 1 试剂

　　核酸提取试剂同 C. 1. 1。

　　TaqMan One-step RT-PCR Mixture。

　　D.2 引物探针

　　上游引物 PNRSV-F:5'-AATGCCCTGTCTAGGAAGGGGTT-3'

　　下游引物 PNRSV-R:5'-CGCAAAAGTGTCGAAATCTAAATC-3'

　　探针 PNRSV-Probe:5'-FAM-GGTTCTTGAAGGACCAACCGAGAGG-TAMRA-3'

　　D.3 核酸提取

　　方法同 C. 2. 1。

　　D.4 实时荧光 RT-PCR反应

　　反应体系 :0. 2 mL 离 心 管 中 加 入 2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL,Ex TaqHS(5 U/μL) 0. 4 μL, PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0. 4 μL, PNRSV-F ( 10 μmol/L) 0. 4 μL, PNRSV-R (10 μmol/L) 0. 4 μL,PNRSV-Probe(10 μmol/L)0. 6 μL, ROX Reference Dye Ⅱ 0. 4 μL,模 板 RNA 2 μL,补 DEPC-H2 O 至 20 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :42 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s;95 ℃ 15 s,62 ℃ 1 min,共 45个循环 。

　　D.5 结果判定

　　在空白对照及阴性 对 照 无 Ct值 且 无 扩 增 曲 线 、阳 性 对 照 Ct值 ≤30并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条件下 :

　　待测样品的 Ct值 ≥40时 ,判定 PNRSV 阴性 。

　　待测样品的 Ct值 ≤35时 ,判定 PNRSV 阳性 。

　　待测样品的 Ct值小于 40而大于 35时 ,应重新进行测试 ;如果重新测试的 Ct值 ≥40,判定 PNRSV阴性 ;如果重新测试的 Ct值小于 40而大于 35,且分离曲线明显时 ,则判定结果为阳性 。