GB/T 40850-2021 饲料中肠杆菌科的检验方法

　　ICS 65 . 120 CCS B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40850—2021

　　饲料中肠杆菌科的检验方法

　　MethodforthedetectionofEnterobacteriaceaeinfeed

　　2021-10-1 1 发布 2022-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40850—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)提出并归口 。

　　本文件起草单位：江苏海企长城股份有限公司、中华人民共和国淮安海关、中华人民共和国南京海关、淮阴师范学院。

　　本文件主要起草人：王远见、何健、宦海霞、冯民、刘尧、蒋原、任盈盈、高旭、朱海燕、柯家法、张扬、张科、颜智勇、张敬友。

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　　饲料中肠杆菌科的检验方法

　　1 范围

　　本文件描述了饲料中肠杆菌科检验的平板计数法和 MPN 计数法。

　　本文件适用于对饲料(含宠物饲料)的检验。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　肠杆菌科 Enterobacteriaceae

　　在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

　　3.2

　　最可能数 mostprobablenumber

　　基于泊松分布间接计数方法得到的数值。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BPW：缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water)

　　CFU：菌落形成单位(Colony Forming Units)

　　EE：肠道菌增菌(Enterobacteria Enrichment)

　　MPN：最可能数(Most Probable Number)

　　NA：营养琼脂(Nutrient Agar)

　　VRBGA：结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(Violet Red Bile Glucose Agar)

　　5 培养基或试剂

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。

　　5 . 1 水：GB/T 6682,三级 。

　　5 . 2 BPW：按照附录 A 中 A. 1 执行。

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　　5 . 3 EE 肉汤：按照 A. 2 执行。

　　5 . 4 VRBGA：按照 A. 3 执行。

　　5 . 5 NA平板：按照 A. 4 执行。

　　5 . 6 葡萄糖琼脂：按照 A. 5 执行。

　　5 . 7 革兰氏染色液：按照 A. 6 执行。

　　5 . 8 氧化酶试剂：按照 A. 7 执行。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃ 。

　　6 . 2 水浴箱：46 ℃ ± 1 ℃ 。

　　6 . 3 均质机。

　　6 . 4 拍打式均质器。

　　6 . 5 振荡器。

　　6.6 电子天平：感量 0.1 g。

　　6.7 显微镜：10 倍~100 倍。

　　6 . 8 无菌培养皿：直径 90 mm。

　　6 . 9 无菌吸管：1 mL( 0 . 01 mL刻度)、10 mL( 0 . 1 mL刻度)或微量移液器及吸头。

　　6 . 10 试管：18 mm×180 mm、15 mm×150 mm。

　　6. 1 1 无菌锥形瓶或等效容器：150 mL、500 mL。

　　6 . 12 均质袋、均质杯。

　　6. 13 pH 计或精密 pH 试纸。

　　7 取样

　　取样制样遵循随机性、代表性的原则，采用无菌操作程序，样品数量不少于 500 g(mL) ,需要混合均

　　匀 。应在接近原有贮存温度条件下贮存试样，并尽快完成检验。

　　8 平板计数法

　　8 . 1 检验流程关键控制环节

　　平板计数法检验流程关键控制环节按照图 1 进行。

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　　图 1 平板计数法检验流程关键控制环节

　　8 . 2 试验步骤

　　8 . 2 . 1 试样处理

　　8.2. 1 . 1 易粉碎固体试样：称取 25 g 试样，放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，8 000 r/min~ 10 000 r/min 均质 1 min~2 min;或放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，置于拍打式均质器中拍打 1 min~2 min, 制成 10 倍稀释的试样匀液。

　　8.2. 1 .2 不易粉碎固体试样：称取 25 g 以上的试样，装于均质袋中，按照 1 ∶ 9 比例加入适量 BPW,置于拍打式均质器中拍打 1 min~2 min,制成 10 倍稀释的试样匀液。

　　8.2. 1 .3 液体试样：用无菌吸管吸取 25 mL试样放入盛有 225 mL BPW 无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中，置于振荡器中振荡，充分混匀，制成 10 倍稀释的试样匀液。

　　8.2. 1 .4 用 1 mL无菌吸管或微量移液器吸取 10 倍稀释的试样匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入盛有 9 mL BPW 的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面)，振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 100 倍稀释的试样匀液。

　　8 . 2 . 1 . 5 根据对试样污染状况的估计，按照上述操作，依次制成 10 倍递增系列稀释试样匀液。 每递增

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　　稀释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备试样匀液至试样接种完毕，全过程不得超过

　　15 min 。

　　8 . 2 . 2 接种和培养

　　8.2.2. 1 根据试样的污染情况及不同种类饲料中肠杆菌科的限量要求，选择 2~3 个适宜的连续稀释度的试样匀液 1 mL加入到无菌培养皿中，每个稀释度接种 2 个无菌培养皿。同时，分别吸取 1 mL BPW加入 2 个无菌培养皿中做空白对照。

　　8.2.2.2 将约 10 mL~15 mL冷却至 46 ℃的 VRBGA(可放置于 46 ℃ ± 1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注于培养皿中。 小心旋转培养皿，使试样匀液与培养基充分混匀。

　　8.2.2.3 待琼脂凝固后，再向其中倾注约 5 mL 的 VRBGA 培养基覆盖平板表层，以防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。

　　8.2.2.4 待培养皿中的培养基凝固后，翻转培养皿，置于 36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~24 h。

　　8 . 2 . 3 菌落计数和确认

　　8 . 2 . 3 . 1 肠杆菌科典型菌落为粉红色至红色或紫色菌落，菌落计数以 CFU 表示。 选取典型菌落数在15 CFU~150 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。

　　8 . 2 . 3 . 2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则计算半个平板后乘以 2 ,代表一个平板菌落数。

　　8 . 2 . 3 . 3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

　　8 . 2 . 3 . 4 从每个平板上至少挑取 5 个(小于 5 个则全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取 1 个菌落进行确认。

　　8.2.3.5 分别将所挑选的每一个菌落，划线于 NA平板，36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~24 h,挑取平板上的菌落进行典型菌落的确认：

　　a) 革兰氏染色试验：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min,水洗;滴加革兰氏碘液，作用 1 min,水洗;滴加 95%乙醇脱色 15 s~30 s,直至染色液被洗掉，但不要过分脱色、水洗;加沙黄复染液，复染 1 min,水洗、干燥、镜检;革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大小为(0.3 μm~1.0 μm) × (1.0 μm~6.0 μm) ;

　　b) 氧化酶试验：用铂接种环或者铱接种环(不应用镍铬接种环)或玻璃棒挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上，试纸的颜色在 10 s 内变为蓝紫色，判为阳性反应;

　　c) 葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于 36 ℃ ± 1 ℃ 培养 24 h±2 h,若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。

　　8 . 2 . 4 试验数据处理

　　8 . 2 . 4 . 1 一般情况

　　若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，则按照下列步骤计算。

　　8.2.4. 1 . 1 确证的肠杆菌科菌落数 a，按式(1)计算。

　　a C …………………………( 1 )

　　式中：

　　b — 某一平板中 A 个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，b≤A;

　　A— 某一平板中用于确认试验的菌落数;

　　C— 某一平板中典型菌落总数。

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　　8 . 2 . 4 . 1 . 2 试样中肠杆菌科菌落数 犖，按式(2)计算。

　　犖 …………………………( 2 )

　　式中：

　　Σ犪 — 确证的肠杆菌科菌落数之和;

　　狀1 — 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);

　　狀2 — 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);

　　犱 — 稀释因子(第一稀释度)。

　　8 . 2 . 4 . 2 低菌落数情况

　　若最低稀释度(包括液体试样原液)平板的典型菌落数均小于 15 CFU,具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。

　　若最低稀释度(包括液体试样原液)平板均无菌落生长或典型菌落数均小于 15 CFU,且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

　　8 . 2 . 4 . 3 特殊情况

　　第一稀释度平板上的典型菌落数均大于 150 CFU,且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平

　　板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 15 CFU~150 CFU 之间，则以确证的菌落数乘以第一

　　稀释倍数计算。

　　若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于 1乘以最低稀释倍数计算。

　　上述各种情况的计算示例参见附录 B。

　　8 . 3 结果报告

　　8.3. 1 菌落数小于 100 CFU/g(mL)时，以整数报告。

　　8.3.2 菌落数大于或等于 100 CFU/g(mL)时，用 10 的指数形式来表示，采用两位有效数字，数字修约按“四舍五入”原则进行，报告单位为 CFU/g(mL)。

　　8 . 3 . 3 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

　　9 MPN计数法

　　9 . 1 检验流程关键控制环节

　　MPN 计数法检验流程关键控制环节按照图 2 进行。

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　　图 2 MPN计数法检验流程关键控制环节

　　9 . 2 试验步骤

　　9 . 2 . 1 试样处理

　　试验样品处理按照 8 . 2 . 1 进行。

　　9 . 2 . 2 接种和培养

　　9 . 2 . 2 . 1 前增菌

　　根据预估试样的污染情况及相关限量要求，选择适宜的 3 个连续稀释度的试样匀液，每个稀释度

　　3 管，共 9 管 BPW 于 36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h±2 h。

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　　9 . 2 . 2 . 2 选择性增菌

　　从 BPW各稀释度培养管中，分别移取 1 mL 培养物，接种于 10 mL EE 肉汤中，36 ℃ ± 1 ℃培养

　　24 h±2 h。

　　9 . 2 . 2 . 3 分离

　　用接种环从各 EE 肉汤管分别取培养物 1 环，划线接种于 VRBGA平板，36 ℃ ± 1 ℃培养 24 h±2 h,

　　观察平板上有无典型菌落。

　　9 . 2 . 3 典型菌落确认

　　典型菌落确认按照 8 . 2 . 3 进行。

　　9 . 3 结果报告

　　只要有 1 个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的 EE 肉汤管即为肠杆菌科阳性。 按照附录 C 中 MPN表查询并报告每克(毫升)试样中肠杆菌科的 MPN值。

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　　附 录 A (规范性)

　　培养基和试剂

　　A.1 BPW

　　A.1 . 1 成分

　　BPW 的成分包括：

　　a) 蛋白胨，10.0 g;

　　b) 氯化钠，5.0 g;

　　c) 磷酸氢二钠，3.5 g;

　　d) 磷酸二氢钾，1.5 g;

　　e) 水，1 000 . 0 mL。

　　A.1 . 2 制法

　　将 A.1.1 所含成分混合，加热溶解，放冷至室温，调节 pH 至 7.2±0.2 ,分装于 500 mL广口瓶中，每瓶 225 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.2 EE 肉汤

　　A.2 . 1 成分

　　EE 肉汤的成分包括：

　　a) 蛋白胨，10.0 g;

　　b) 葡萄糖，5.0 g;

　　c) 磷酸氢二钠(无水)，6.45 g;

　　d) 磷酸二氢钾，2.0 g;

　　e) 牛胆盐，20.0 g;

　　f) 煌绿，0.013 5 g;

　　g) 水，1 000.0 mL。

　　A.2 . 2 制法

　　将 A.2.1 所含成分混合，加热煮沸至完全溶解，加热不宜超过 30 min,迅速冷却培养基，放冷至室温，调节 pH 至 7.2±0.2 ,分装于灭菌的 18 mm×180 mm试管中，每管 10 mL,不需高压灭菌，5 ℃ ± 3 ℃

　　可存放一个月。

　　A.3 VRBGA

　　A.3 . 1 成分

　　VRBGA 的成分包括：

　　a) 蛋白胨，7.0 g;

　　b) 酵母浸膏，3.0 g;

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　　c) 3 号胆盐，1.5 g;

　　d) 葡萄糖，10.0 g;

　　e) 氯化钠，5.0 g;

　　f) 中性红，0.03 g(或 0.6%乙醇溶液 5 mL) ;

　　g) 结晶紫，0.002 g(或 0.1%水溶液 2 mL)。

　　A.3 . 2 制法

　　将 A.3.1 所含成分混合，加热煮沸至完全溶解，放冷至室温，调节 pH 至 7.4±0.2 ,分装于灭菌的锥形烧瓶中，不需要高压灭菌，用前制备。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板 5 ℃ ± 3 ℃可存放

　　两周。

　　A.4 NA 平板

　　A.4 . 1 成分

　　NA平板的成分包括：

　　a) 牛肉浸膏，3.0 g;

　　b) 蛋白胨，5.0 g;

　　c) 琼脂粉，10.0 g~12.0 g;

　　d) 水，1 000 . 0 mL。

　　A.4 . 2 制法

　　将 A.4.1 所含成分混合，加热煮沸，放冷至室温，调节 pH 至 7.3 ± 0.2 , 121 ℃高压灭菌 15 min。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板于 5 ℃ ±3 ℃可存放两周。

　　A.5 葡萄糖琼脂

　　A.5 . 1 成分

　　葡萄糖琼脂的成分包括：

　　a) 胰蛋白胨，10.0 g;

　　b) 酵母浸膏，1.5 g;

　　c) 葡萄糖，10.0 g;

　　d) 氯化钠，5.0 g;

　　e) 溴甲酚紫，0.015 g(或 0.4%溴甲酚紫酒精溶液 3.75 mL) ;

　　f) 琼脂粉，10.0 g~12.0 g;

　　g) 水，1 000.0 mL。

　　A.5 . 2 制法

　　将 A.5.1 所含成分混合，加热煮沸，放冷至室温，调节 pH 至 7.0±0.2 ,分装于 15 mm× 150 mm 试管，每管约 5 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min后，试管垂直放置。于 5 ℃ ±3 ℃可存放 1 周。为去除培养基中的氧气，使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中 15 min,然后迅速冷却，备用。

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　　A.6 革兰氏染色液

　　A.6 . 1 结晶紫染色液

　　A.6 . 1 . 1 成分

　　结晶紫染色液的成分包括：

　　a) 结晶紫，1.0 g;

　　b ) 95%乙醇，20 . 0 mL ;

　　c) 1%草酸铵水溶液，80 . 0 mL。

　　A.6 . 1 . 2 制法

　　将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

　　A.6 . 2 革兰氏碘液

　　A.6 . 2 . 1 成分

　　革兰氏碘液的成分包括：

　　a) 碘，1.0 g;

　　b) 碘化钾，2.0 g;

　　c) 水，300 . 0 mL。

　　A.6 . 2 . 2 制法

　　将碘和碘化钾先行混合，加入少许水充分振摇，待完全溶解后，再加水至 300 mL。

　　A.6 . 3 沙黄复染液

　　A.6 . 3 . 1 成分

　　沙黄复染液的成分包括：

　　a) 沙黄，0.25 g;

　　b ) 95%乙醇，10 . 0 mL ;

　　c) 水，90 . 0 mL。

　　A.6 . 3 . 2 制法

　　将沙黄溶解于乙醇中，然后用水稀释。

　　A.7 氧化酶试剂

　　A.7 . 1 成分

　　氧化酶试剂的成分包括：

　　a) N, N, N′, N′-四甲基对苯二胺盐，1.0 g;

　　b ) 水，90 . 0 mL。

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　　A.7 . 2 制法

　　将 N, N, N′, N′-四甲基对苯二胺盐溶解于冷水中，少量新鲜配制。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　结果计算示例

　　B.1 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的肠杆菌科菌落，数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 肠杆菌科平板计数结果示例 1

　　犖 = = = 11 955

　　上述数据按 8.3.2 数字修约后，表示为 12 000 或 1.2 × 104 。

　　B.2 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板，数据见表 B. 2 。

　　表 B.2 肠杆菌科平板计数结果示例 2

　　犖 = = = 11 667

　　上述数据按 8.3.2 数字修约后，表示为 12 000 或 1.2 × 104 。

　　B.3 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落，则相应的平板不作为计数平板，数据见表 B. 3 。

　　表 B.3 肠杆菌科平板计数结果示例 3

　　GB/T 40850—202 1

　　犖

　　上述数据按 8.3.2 数字修约后，表示为 12 000 或 1.2 × 104 。

　　B.4 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，但无已确证的肠杆菌科菌落，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

　　B.5 第一稀释度平板上的菌落数超过 150 CFU,且有证实的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 15 CFU~150 CFU 之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，数据见表 B. 4 。

　　表 B.4 肠杆菌科平板计数结果示例 5

　　犖

　　上述数据按 8.3.2 数字修约后，表示为 18 000 或 1.8 × 104 。

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　肠杆菌科 MPN表

　　每克(毫升)试样中肠杆菌科 MPN 检索见表 C. 1 。

　　表 C.1 肠杆菌科 MPN检索表