GB/T 40641-2021 松针聚戊烯醇含量的测定 高效液相色谱法

　　ICS 65 . 020 CCS B 60

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40641—2021

　　松针聚戊烯醇含量的测定

　　高效液相色谱法

　　Determinationofpolyprenolfrom pineneedles—Highperformance

　　liquidchromatography

　　2021-10-1 1 发布 2022-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40641—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件由国家林业和草原局提出。

　　本文件由全国林化产品标准化技术委员会(SAC/TC 558)归口 。

　　本文件起草单位：中国林业科学研究院林产化学工业研究所、中国标准化研究院、北京林业大学、浙江科技学院、南京林业大学、深圳市标准技术研究院、中山洪力健康食品产业研究院有限公司。

　　本文件主要起草人：李文君、王成章、汪咏梅、周昊、陶冉、席兴军、雷建都、刘铁兵、黄超伯、兰韬、刘静、陈虹霞、张昌伟、叶建中、杨志花、张逸。

　　GB/T 40641—202 1

　　松针聚戊烯醇含量的测定

　　高效液相色谱法

　　1 范围

　　本文件描述了用高效液相色谱法测定松针聚戊烯醇含量的方法。

　　本文件适用于松科植物松针中的聚戊烯醇含量的测定。

　　本文件的定量限：4 μg/kg。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　松针聚戊烯醇 polyprenolfrom pineneedles

　　从松科植物的针状叶子中得到的由一系列异戊烯基(isoprenyl)单元聚合构成的，具有不同链长的聚戊烯醇(C50、C55、C60、C65、C70、C75、C80、C85、C90、C95、C100、C105)的混合物 。

　　4 原理

　　松针原料经石油醚热回流提取、皂化、石油醚萃取、硅胶柱层析、乙酸乙酯-石油醚溶剂系统梯度洗脱，再用 0 . 22 μm 滤膜过滤后得澄清液，将酯变成游离的醇，经反相色谱柱分离后，用高效液相色谱仪测定，根据保留时间定性，外标法定量。

　　5 试剂或材料

　　本文件所用试剂除另有说明外，皆为分析纯，用水为 GB/T 6682 规定的一级水;未指明用何种溶剂配制时，均指水溶液。

　　5 . 1 甲醇，正己烷，异丙醇：色谱纯。

　　5.2 石油醚(60 ℃ ~90 ℃), 乙酸乙酯。

　　5.3 5%氢氧化钠-甲醇溶液( 质量分数)：称取 5 g 氢氧化钠，用 95 mL 甲醇溶解，经 0 . 22 μm 滤膜过滤。

　　5 . 4 聚戊烯醇标准物质：纯度 ≥99% 。

　　5 . 5 聚戊烯醇标准储备溶液：精确称取 500 mg(精确到 0 . 1 mg)聚戊烯醇标准物质于 50 mL棕色容量

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　　瓶中，加正己烷使其溶解并定容至刻度，混匀，此溶液可在温度低于 4 ℃冰箱中冷藏保存两个月。

　　5 . 6 聚戊烯醇标准工作液：将聚戊烯醇标准储备液用正己烷稀释制备一系列标准溶液，标准系列浓度为 0.10 mg/mL、0.60 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、4.00 mg/mL、6.00 mg/mL, 临用时配制。

　　5.7 无水 Na2 SO4 。

　　5.8 有机相微孔滤膜：孔径 0 . 22 μm。

　　5.9 硅胶：粒径 0.075 mm~0.150 mm。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

　　6 . 2 分析天平：感量 0 . 1 mg。

　　6 . 3 粉碎机。

　　6 . 4 旋转蒸发仪。

　　6 . 5 水浴锅。

　　6 . 6 真空干燥箱。

　　6 . 7 干燥器。

　　6.8 层析柱：300 mm×16 mm(内径)。

　　7 样品

　　7 . 1 试样的制备

　　将松针原料干燥(含水率不大于 3%)处理后，用粉碎机将其粉碎，得到试样后，装入洁净干燥器中，于常温下密闭、干燥保存备用。

　　7 . 2 试样溶液制备

　　7 . 2 . 1 提取

　　精确称取试样 10 g(精确到 0 . 1 mg)于 500 mL 圆底烧瓶中，加 200 mL石油醚，65 ℃下热回流 2 h ; 50 ℃下减压浓缩回收溶剂，得石油醚软膏抽提物;然后加入 50 mL 5%氢氧化钠-甲醇溶液，于 80 ℃水浴中皂化水解并搅拌 3 . 5 h,冷却;加水稀释至 100 mL,用石油醚萃取 3 次，每次 100 mL,合并 3 次石油醚萃取相;水洗至中性，再用无水 Na2 SO4 干燥，过滤，回收溶剂后，得松针聚戊烯醇软膏。

　　7 . 2 . 2 纯化

　　将 7. 2. 1 中所得软膏用适量石油醚溶解后，上硅胶层析柱进行分离(上样量与硅胶质量比为 1 ∶ 30);先用石油醚洗脱4个柱体积，再用乙酸乙酯-石油醚(体积比 4 ∶ 96)溶剂洗脱 8个柱体积，洗脱液减压浓缩回收溶剂后，所得软膏用适量石油醚溶解后，再用硅胶层析柱进行分离，用乙酸乙酯-石油醚(体积比 2 ∶ 98)溶剂洗脱 8个柱体积，洗脱液减压浓缩回收溶剂后，真空干燥得到聚戊烯醇样品，置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容，混匀，吸取 1 mL溶液用 0. 22 μm滤膜过滤，滤液用于高效液相色谱仪测定。

　　8 测定步骤

　　8 . 1 高效液相色谱参考条件

　　高效液相色谱条件参考如下：

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　　a) 色谱柱：C18 , 150 mm×4.6 mm(内径)，粒径 5 μm, 或相当者;

　　b ) 流动相：甲醇-异丙醇(体积比 9 ∶ 16) ;

　　c) 流速：0.50 mL/min;

　　d) 进样量：5 μL;

　　e) 检测波长：210 nm ;

　　f) 柱温：25 ℃ 。

　　8 . 2 标准曲线的制作

　　向液相色谱柱中注入浓度为 0.10 mg/mL、0.60 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、4.00 mg/mL、

　　6 . 00 mg/mL 的标准工作溶液，在上述色谱条件下得到色谱峰面积(以 C65 、C70 、C75 、C80 、C85 为主要特征峰计算，下同)，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。 浓度为 6 . 00 mg/mL 的标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 。

　　8 . 3 试样溶液的测定

　　对同一试样平行做两份试验。 向高效液相色谱柱中注入样品试验溶液得到色谱峰面积，根据标准曲线得到待测液聚戊烯醇的浓度。

　　8 . 4 空白实验

　　除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行测定。

　　9 结果计算与表示

　　试样中聚戊烯醇含量利用数据处理系统计算或按式(1)计算。

　　犡 ……………………( 1 )

　　式中：

　　犡 —试样中聚戊烯醇的含量，单位为毫克每克(mg/g) ;

　　犮 —试样中聚戊烯醇的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　50 —试样定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　犿 —试样的质量，单位为(g) 。

　　测定结果以两次平行测定的算术平均值表示，计算结果保留至小数点后两位有效数字。 样品吸收峰应在聚戊烯醇标准工作曲线的校准范围内，若样品吸收峰高于 6 . 00 mg/mL 浓度的聚戊烯醇标准工作溶液的吸收峰，则应重新配制高浓度聚戊烯醇标准工作液进行校准。

　　10 精密度

　　在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 5%。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　聚戊烯醇高效液相色谱图

　　松针聚戊烯醇标准溶液色谱图见图 A. 1 。

　　图 A.1 6.00 mg/mL松针聚戊烯醇标准溶液高效液相色谱图