GB/T 40642-2021 桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素的检测 高效液相色谱法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40642—2021

　　桑叶提取物中 1-脱氧野尻霉素的检测

　　高效液相色谱法

　　Determinationof1-deoxynojirimycininextractofmulberryleaf—

　　HPLC

　　2021-10-1 1 发布 2022-05-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40642—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由国家林业和草原局提出。

　　本文件由全国林化产品标准化技术委员会(SAC/TC 558)归口 。

　　本文件起草单位：北京林业大学、深圳市品牌建设促进中心、浙江圣氏生物科技有限公司、河北冠卓检测科技股份有限公司、中国标准化研究院、中山洪力健康食品产业研究院、中国林业科学研究院林产化学工业研究所、北京电子科技职业学院、中国科学院兰州化学物理研究所、无限极(中国)有限公司共同。

　　本文件主要起草人：雷建都、杨志花、刘静、王璐莹、章兴、席兴军、张敬轩、张逸、辛秀兰、赵新颖、陈亮、邸多隆、王成章、裴栋、兰韬、李文君、孙红梅。

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　　桑叶提取物中 1-脱氧野尻霉素的检测

　　高效液相色谱法

　　1 范围

　　本文件描述了采用高效液相色谱测定桑叶中 1-脱氧野尻霉素含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、检测方法、结果计算与表示、重复性、精密度和加标回收率。

　　本文件适用于桑叶提取物中 1-脱氧野尻霉素含量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 原理

　　笏甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)是一种氨基酸衍生化试剂，主要适用于伯胺和仲胺的衍生化，反应后的衍生物具有较强的紫外吸收，最大吸收波长为 254 nm。由于 1-脱氧野尻霉素(DNJ)分子中有仲胺结构，因此可以采用 FMOC-Cl作为衍生化试剂对 DNJ 进行衍生，利用 HPLC 对 1-脱氧野尻霉素进行定量检测，检测波长为 254 nm。DNJ 与笏甲氧羰酰氯的反应式见图 1 。

　　图 1 DNJ与笏甲氧羰酰氯的反应式

　　5 试剂或材料

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合 GB/T 6682 一级的水。

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　　5 . 1 试剂

　　5 . 1 . 1 乙腈(C2 H 3 N),色谱纯 。

　　5 . 1 . 2 冰乙酸(CH 3 COOH) 。

　　5. 1 .3 笏甲氧酰羰氯(C15 H11 ClO2)。

　　5 . 1 . 4 甘氨酸(C2 H 5 NO2) 。

　　5. 1 .5 硼酸钾缓冲液，pH 8.5。

　　5 . 2 溶液配制

　　笏甲氧酰氯 FMOC-Cl 乙腈溶液：称取 0.065 g FMOC-Cl, 精确至 0.001 g, 用乙腈溶解，并定容至50 mL,得到 5 mmol/L 的 FMOC-Cl 乙腈溶液。FMOC-Cl 乙腈溶液应现配现用。

　　5 . 3 标准品

　　1-脱氧野尻霉素标准品，纯度 ≥98%。

　　5 . 4 1-脱氧野尻霉素标准储备溶液

　　称取 100 mg(精确至 0.001 g) 1-脱氧野尻霉素标准品，置于 100 mL容量瓶中，用 0.01 mol/L 盐酸

　　水溶液溶解并定容至刻度线，混匀。

　　5 . 5 1-脱氧野尻霉素标准工作溶液

　　将 1-脱氧野尻霉素标准储备溶液用盐酸水溶液稀释制备一系列标准溶液，标准液浓度分别为

　　0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL, 临用时配制。

　　5 . 6 材料

　　滤膜，孔径 0 . 45 μm 有机相滤膜。

　　6 仪器与设备

　　6 . 1 分析天平：灵敏度万分之一克。

　　6 . 2 超声振荡器/超声清洗器：超声频率 40 kHz~80 kHz。

　　6 . 3 高效液相色谱仪：包含紫外检测器或二极管检测器、色谱工作站。

　　6 . 4 恒温水浴锅。

　　7 检测方法

　　7 . 1 样品处理

　　称取桑叶提取物 0 . 100 g试样，精确至 0 . 001 g,用 0 . 010 mol/ L 盐酸水溶液超声辅助溶解 15 min,冷却至室温后，定容至 50 mL,得到试样溶液。

　　7 . 2 衍生化反应

　　取标准品或试样溶液 100 μL 置于 1 . 5 mL 的离心管中，依次加入 0 . 4 mol/ L 的硼酸钾缓冲溶液(pH 8.5) 175 μL 和 5 mmol/L衍生化试剂 FMOC-Cl 乙腈溶液 250 μL,充分混合 30 s, 在 25 ℃恒温水

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　　浴下反应 25 min,然后加入 0.1 mol/L甘氨酸溶液 100 μL用于中和过量的 FMOC-Cl,反应 20 min,再

　　加入 75 μL体积分数为 1%乙酸水溶液和 300 μL 去离子水，待反应结束后，用 0 . 45 μm 有机相滤膜微滤，得到衍生后的样品溶液。 样品溶液避光保存备用。

　　7 . 3 测定条件

　　按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪;以下色谱分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。

　　色谱条件如下：

　　— 色谱柱：RP-C18(250 mm×4.6 mm i.d. , 5 μm) ;

　　— 流动相：乙腈-0 . 1%乙酸水溶液(32 ∶ 68,体积比);

　　— 流速：1.0 mL/min;

　　— 柱温：30 ℃ ;

　　— 进样量：10 μL;

　　— 检测波长：254 nm。

　　7 . 4 标准曲线绘制

　　按 7 . 3 色谱条件检测，分别吸取不同浓度标准工作溶液并按照 7 . 2 进行衍生化反应，吸取衍生后的样品溶液 10 μL,进样于高效液相色谱仪，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的样品溶液浓度为横坐标，进行线性回归得到标准曲线方程。

　　1-脱氧野尻霉素标准品的 HPLC色谱图参见附录 A。

　　7 . 5 试样测定

　　按 7 . 3 的色谱条件，取 7 . 2 步骤中衍生后的样品溶液进样，得到试样溶液的峰面积，根据保留时间和1-脱氧野尻霉素标准品色谱图定性。 从标准曲线上查得试样溶液中 1-脱氧野尻霉素的含量。

　　试样溶液中 1-脱氧野尻霉素的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应将试样溶液稀释后测定或增加提取物的质量重新检测。

　　8 结果计算与表示

　　8 . 1 结果计算

　　桑叶提取物中 1-脱氧野尻霉素含量按式(1)进行计算：

　　X ……………………………………( 1 )

　　式中：

　　X —样品中 1-脱氧野尻霉素的含量，单位为毫克每克(mg/g) ;

　　c —样品中 1-脱氧野尻霉素的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　V —最终定容后样品的体积，单位为毫升(mL) ;

　　m —试样的质量，单位为克(g) 。

　　8 . 2 结果表示

　　计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留至小数点后两位有效数字。

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　　9 重复性

　　在重复条件下获得的 5 次独立测定结果的相对标准偏差小于 5%。

　　10 精密度

　　取同一试样，连续进样 5 次，按 7 . 3 的色谱条件检测其 HPLC 图谱;比较 1-脱氧野尻霉素对应色谱峰的峰面积，5 次进样的峰面积的相对标准偏差(RSD)不应超过 5%。

　　1 1 加标回收率

　　标准品添加量在待测样品浓度 0 . 5~1 . 5 倍浓度范围内，加标回收率应在 90%~110%之间，相对标准偏差应小于 10%。

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　　附 录 A (资料性)色谱图示例

　　1-脱氧野尻霉素标准样品及桑叶提取物的色谱图示例见图 A. 1 和图 A. 2 。其中，峰 1 为 1-脱氧野尻霉素，峰 2 为笏甲氧羰酰-甘氨酸结合物，峰 3 为笏甲氧羰酰氯水解物。

　　图 A.1 1-脱氧野尻霉素标准样品的色谱图

　　图 A.2 桑叶提取物的色谱图