GB/T 28630.2-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第2部分：套式PCR检测法

　　ICS 65. 020. 30 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28630.2—2012

　　白斑综合征(WSD) 诊断规程

　　第 2 部分 :套式 PCR检测法

　　Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease—

　　Part2:Nested PCR method

　　2012-07-31发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28630.2—2012

　　前 言

　　GB/T 28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分 :

　　— 第 1部分 :核酸探针斑点杂交检测法 ;

　　— 第 2部分 :套式 PCR检测法 ;

　　— 第 3部分 :原位杂交检测法 ;

　　— 第 4部分 :组织病理学诊断法 ;

　　— 第 5部分 :新鲜组织的 T-E染色法 。

　　本部分为 GB/T 28630的第 2部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出 。

　　本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归 口 。

　　本部分起草单位 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、农业部全国水产技术推广总站 。

　　本部分主要起草人 :黄倢 、杨冰 、陈爱平 、宋晓玲 、史成银 、杨丛海 、魏琦 、刘莉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28630.2—2012

　　白斑综合征(WSD)诊断规程

　　第 2 部分 :套式 PCR检测法

　　警告 :使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验 ,本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施 ,并保证符合国家有关法规规定的条件。

　　1 范围

　　GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征病原的套式 PCR 检测方法所需试剂与材料 、仪器设备 、操作步骤和结果判定 。

　　本部分适用于在对虾的各种样品 、环境生物和饵料生物的各种样品,以及其他各种非生物样品中对白斑综合征病原带毒情况的高灵敏度定性检测 , 以进行病原筛查和疾病的确诊 。

　　本部分单独使用时不适用于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 28630. 4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第 4部分 :组织病理学诊断法

　　3 原理

　　3. 1 白斑综合征的病原和病理学特征

　　见 GB/T 28630. 4—2012的 2. 1。

　　3. 2 技术原理

　　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是以待测样品的一段 DNA作为模板 , 以与模板两端序列互补的一 对 特 异 性 寡 核 苷 酸 序 列 作 为 引 物 , 在 四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 存 在 下 , 利 用 依 赖DNA 的 DNA 聚合酶的合成作用 。经过数十次变性 、退火和延伸的反应循环 ,使模板上介于两个引物之间的 DNA 片段得到特异性地级数扩增 ,再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段 ,从而可揭示微量病毒 DNA 的存在 。套式 PCR是在第一步 PCR扩增的产物内 ,再用一对引物进行第二步 PCR 扩增 。套式 PCR可大大增加 PCR检测的灵敏度和反应特异性 。

　　4 试剂和材料

　　4. 1 除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。

　　4. 2 无水乙醇 。

　　4. 3 液体石蜡 。

　　4. 4 含氯消毒剂 : 医用品或水产药物 。

　　4. 5 琼脂糖 : 电泳级 。

　　1

　　GB/T 28630.2—2012

　　4. 6 1 kb DNA Marker:生化试剂 。

　　4. 7 Tris平衡酚(饱和酚) :生化试剂 。

　　4. 8 TaqDNA 聚合酶(5U/μL) :生化试剂 , -20 ℃保存 。

　　4. 9 10×PCR缓冲液 :生化试剂 ,无 Mg2+ , 随 TaqDNA 聚合酶提供 , -20 ℃保存 。

　　4. 10 氯化镁溶液(25 mmol/L) :生化试剂 , -20 ℃保存 。

　　4. 11 dNTP:生化试剂 ,含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 10 mmol/L的混合物 , -20 ℃保存 。

　　4. 12 10 μmol/L 引 物 F1: 5′-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3′, 外 侧 正 向 引 物 , 用 来 扩 增WSSV DNA 的 1447bp产物 , -20 ℃保存 。

　　4. 13 10 μmol/L引物 R1: 5′-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3′, 外 侧 反 向 引 物 , 用 来 扩 增WSSV DNA 的 1447bp产物 , -20 ℃保存 。

　　4. 14 10 μmol/L 引 物 F2: 5′-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3′, 内 侧 正 向 引 物 , 用 来 从 第 一 步PCR扩增的 1447bp产物中再扩增出 941 bp的产物 , -20 ℃保存 。

　　4. 15 10 μmol/L引 物 R2: 5′-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3′, 内 侧 反 向 引 物 , 用 来 从 第 一 步PCR扩增的 1447bp产物中再扩增出 941 bp的产物 , -20 ℃保存 。

　　4. 16 10 μmol/L引物 F3: 5′-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3′,正向内参照引物 ,扩增十足类动物 DNA 中 848bp的片段 , -20 ℃保存 。

　　4. 17 10 μmol/L引物 R3: 5′-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3′ ,反向内参照引物 ,扩增十足类动物 DNA 中 848bp的片段 , -20 ℃保存 。

　　4. 18 20 mg/mL蛋白酶 K:见附录 A 的规定 。

　　4. 19 TE缓冲液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 20 抽提缓冲液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 21 10 mol/L乙酸铵 :见附录 A 的规定 。

　　4. 22 酚-三氯甲烷-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) :见附录 A 的规定 。

　　4. 23 1×电泳缓冲液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 24 6×载样缓冲液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 25 10 mg/mL 溴化乙锭(EB)贮存液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 26 70%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　4. 27 阳性对照为已知 受 WSSV 感 染 且 PCR 结 果 显 示 明 显 阳 性 结 果 的 WSSV DNA 模 板 , - 20 ℃保存 。

　　4. 28 阴 性 对 照 为 已 知 未 受 WSSV 感 染 且 PCR 结 果 显 示 阴 性 结 果 的 对 虾 组 织 DNA 模 板 , - 20 ℃保存 。

　　4. 29 空白对照以无菌双蒸水为模板 。

　　5 器材和设备

　　5. 1 PCR仪 。

　　5. 2 电泳仪 :输出直流电压 0 V~ 600V。

　　5. 3 水平电泳槽 :50 mL~ 500 mL,带有 5 cm~ 20 cm 宽度的凝胶船及相应的样孔梳 。

　　5. 4 紫外观察仪 :可遮挡可见光干扰 ,在 230 nm~ 300 nm 波长对凝胶发射紫外线 ,推荐带照相机架 。

　　5. 5 台式高速离心机 :用于 PCR前区对 1. 5 mL塑料微量离心管离心 ,转速可达 12 000 r/min以上 。

　　5. 6 手 掌 型 离 心 机 : 用 于 PCR 后 区 对 0. 2 mL PCR 管 的 离 心 , 塑 料 转 头 , 转 速 2 000 r/min~ 4 000 r/min。

　　5. 7 水浴锅 。

　　2

　　GB/T 28630.2—2012

　　5. 8 普通冰箱 :具冷藏箱 ,并带 -18℃以下冷冻箱体 。

　　5. 9 微量移液器 :量程 0. 5 μL~ 10μL、5 μL~40μL、40μL~ 200μL、200μL~ 1000μL各 4支 ,应按洁净区 、样品区 、扩增区和电泳区分为 4套隔离使用 。

　　5. 10 电炉或微波炉等其他加热设备 :可满足 10 mL~ 50 mL液体在三角烧瓶中加热 20 min。

　　5. 11 三角烧瓶 :容量 100 mL~ 250 mL。

　　5. 12 灭菌 0. 2 mL PCR管 :经高压蒸汽灭菌 ,一次性使用 。

　　5. 13 微量移液器枪头 :与各种规格的微量移液器配套使用 ,经高压蒸汽灭菌 ,并一次性使用 。

　　5. 14 医用剪刀 。

　　5. 15 医用镊子 。

　　5. 16 玻璃研磨棒或塑料研磨棒 :用于在 1. 5 mL塑料离心管中研磨样品 。

　　5. 17 1. 5 mL塑料微量离心管 :经高压蒸汽灭菌 ,一次性使用 。

　　5. 18 塑料或乳胶手套 :一次性使用 。

　　5. 19 吸水纸 。

　　6 操作步骤

　　6. 1 准备 PCR 的反应体系

　　6. 1. 1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成 。

　　6. 1. 2 第一步 PCR 的反应体系中使用引物 F1和 R1,模板为抽提的样品 DNA,其反应预混物见表 1。

　　表 1 100份第一步 PCR 的反应预混物所需试剂组成

　　试 剂

　　25 μL体系

　　50 μL体系

　　100 μL体系

　　试剂终浓度

　　10×PCR缓冲液(无 Mg2+ )

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1×PCR缓冲液(无 Mg2+ )

　　氯化镁溶液(25 mmol/L)

　　150 μL

　　300 μL

　　600 μL

　　1. 5 mmol/L

　　dNTP

　　50 μL

　　100 μL

　　200 μL

　　200 μmol/L

　　10 μmol/L引物 F1

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1 μmol/L

　　10 μmol/L引物 R1

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1 μmol/L

　　灭菌双蒸水

　　1 440 μL

　　2 880 μL

　　5 760 μL

　　—

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)

　　10 μL

　　20 μL

　　40 μL

　　0. 02 U/μL

　　100份反应预混物总体积

　　2 400 μL

　　4 800 μL

　　9 600 μL

　　注 : 25 μL体系模板量 1 μL/反应管 ;50μL体系模板量 2 μL/反应管 ;100μL体系模板量 4 μL/反应管 。

　　6. 1. 3 第二步 PCR 的反应体系中使用引物 F2和 R2,其反应预混物见表 2。

　　表 2 100份第二步 PCR 的反应预混物所需试剂组成

　　试 剂

　　25 μL体系

　　50 μL体系

　　100 μL体系

　　试剂终浓度

　　10×PCR缓冲液(无 Mg2+ )

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1×PCR缓冲液(无 Mg2+ )

　　氯化镁溶液(25 mmol/L)

　　150 μL

　　300 μL

　　600 μL

　　1. 5 mmol/L

　　dNTP

　　50 μL

　　100 μL

　　200 μL

　　200 μmol/L

　　10 μmol/L 引物 F2

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1 μmol/L

　　3

　　GB/T 28630.2—2012

　　表 2 (续)

　　试 剂

　　25 μL体系

　　50 μL体系

　　100 μL体系

　　试剂终浓度

　　10 μmol/L 引物 R2

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1 μmol/L

　　灭菌双蒸水

　　1 290 μL

　　2 580 μL

　　5 160 μL

　　—

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)

　　10 μL

　　20 μL

　　40 μL

　　0. 02 U/μL

　　100份反应预混物总体积

　　2 250 μL

　　4 500 μL

　　9 000 μL

　　注 : 25 μL体系模板量 2. 5 μL/反应管 ;50μL体系模板量 5 μL/反应管 ;100μL体系模板量 10 μL/反应管 。

　　6. 1. 4 按照所需的反应体系 ,根据近期工作量的需要 ,在洁净区分别配制好 100份 ~ 1 000份第一步PCR 和第二步 PCR 的无 TaqDNA 聚合酶的反应预混物 ,按 10份/支 ~ 100份/支对两步的无酶反应预混物分别分装 ,冻存于 -20 ℃ 。

　　6. 1. 5 检测前 ,在洁净区取出所需份数的第一步 PCR 和第二步 PCR 的无酶预混物解冻 ,按比例分别加入所需的 Taq酶量 ,混匀即为完全的第一步 PCR 和第二步 PCR反应预混合物 ,再按 1 份/支将预混合物分别分装到 0. 2 mL PCR管中 ,混匀 。若 PCR仪没有热盖功能 ,则再于各管中加入 50 μL液体石蜡 。将分装好的两步 PCR 的反应预混物同时带入样品区待用 。

　　6. 2 样品准备

　　6. 2. 1 样品的处理应在样品区完成 。

　　6. 2. 2 样品采集的要求见 GB/T 28630. 4—2012 中附录 B 的规定 。

　　6. 2. 3 活体或冰冻幼体 、仔虾及幼虾个体样品约 5 mg~ 100 mg (去掉幼虾眼) 。 活体或冰冻的成虾鳃 、胃 、游泳足或步足样品约 5 mg~ 100mg。活体或冰冻饵料生物样品约 5 mg~ 100mg。池底表土样品约 500 mg。

　　6. 2. 4 将上述待检样品放入灭菌 1. 5 mL微型离心管中 ,应避免各样品间的交叉污染 。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗 ,然后浸于新配制的有效氯含量为 3. 0×10-3 的含氯消毒剂中 5 min,经无 PCR产物污染的自来水充分清洗 ,再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品 。

　　6. 3 DNA 的提取

　　6. 3. 1 样品 DNA 的提取应在样品区完成 。

　　6. 3. 2 在样品剪碎后加入抽提缓冲液 500 μL,用研磨棒充分研磨 ,37 ℃温浴 1 h。

　　6. 3. 3 加入 2. 5 μL20mg/mL蛋白酶 K,至终浓度 100μg/mL,混匀后置于 50℃水浴 3 h,不时旋动 。

　　6. 3. 4 将溶液冷却 至 室 温 , 加 入 等 体 积 平 衡 酚 , 颠 倒 混 合 10 min, 于 10 000 r/min离 心 3 min分 离两相 。

　　6. 3. 5 水相移至新塑料微量离心管中 ,加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇 ,颠倒混合 10min,于 10000 r/ min离心 1 min分离两相 。

　　6. 3. 6 水相移至一新灭菌微型离心管中 ,加入等体积三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1) ,颠倒混合 10 min, 于10 000 r/min离心 1 min分离两相 。

　　6. 3. 7 水相移至一新灭菌微型离心管中 ,加入 100 μL 10 mol/L乙酸铵 ,混匀后 ,再加入两倍体积预冷无水乙醇( -20℃)混匀 , -20 ℃放置 2 h。 10 000 r/min离心 10 min,弃上清 。

　　6. 3. 8 用 70%乙 醇 洗 涤 沉 淀 2 次 , 每 次 10 000 r/min离 心 5 min, 小 心 倾 去 上 清 , 最 后 沉 淀 于 室 温晾干 。

　　6. 3. 9 沉淀晾干后加入 100 μL灭菌双蒸水溶解 DNA。

　　4

　　GB/T 28630.2—2012

　　6. 3. 10 若 DNA样品应保存 ,建议溶解于 100 μLTE缓冲液中并保存于 -20 ℃ 。

　　6. 4 DNA提取质量及体质监控

　　6. 4. 1 参 照 表 1 的 PCR 反 应 预 混 物 体 系 , 引 物 使 用 10 μmol/L引 物 F3 和 10 μmol/L引 物 R3按

　　6. 5. 1. 5程序进行样品提取质量及反应体系监控 。

　　6. 5 套式 PCR操作

　　6. 5. 1 第一步 PCR

　　6. 5. 1. 1 以下一个步骤的操作应在样品区完成 。

　　6. 5. 1. 2 对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板 ,待测模板除抽提的样品 DNA 外 , 同时设阳性对照 、阴性对照和以无菌双蒸水为模板的对照 。分别将各模板溶液加到各支已加有第一步 PCR反应预混物的 0. 2 mL PCR管的管盖上 ,盖严管盖 。

　　6. 5. 1. 3 以下两个步骤的操作只能在扩增区完成 。

　　6. 5. 1. 4 将 PCR管带入扩增区 ,放入 90 ℃预热的 PCR仪中 ,预热反应预混合物 2 min。逐一快速取出 PCR管在手掌型离心机上离心 1 s~ 2 s,立即放回预热的 PCR仪上 。盖上 PCR仪的盖子 。

　　6. 5. 1. 5 按以下程序进行扩增 : 94 ℃ 4 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min, 1 个循环 ; 94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min,39个循环;72 ℃延伸 5 min。4 ℃保温 。

　　6. 5. 2 第二步 PCR

　　6. 5. 2. 1 在进行 6. 5. 1. 4 步的同时 ,将已准备好的第二步 PCR反应预混物的反应管带入扩增区 。

　　6. 5. 2. 2 在扩增区 ,根据所选取的反应体系的总体积 , 分别从第一步的各 PCR 管中取相应体积的模板 ,加到第二步 PCR预混物各管的管盖上 。应小心操作 , 防止各样品间交叉污染 。

　　6. 5. 2. 3 将第二步的各 PCR管放入 90℃预热的 PCR仪中 ,预热反应预混合物 2 min。逐一快速取出PCR管在手掌型离心机上离心 1 s~ 2 s,立即放回预热的 PCR 仪上 。盖上 PCR 仪的盖子 。按照与第一步 PCR相同的扩增循环的程序进行扩增 。扩增完毕的 PCR管只能在电泳区打开 。

　　6. 6 PCR产物的分析

　　6. 6. 1 琼脂糖凝胶的制作

　　6. 6. 1. 1 在电泳区用 1×电泳缓冲液配制 1. 5%的琼脂糖凝胶 ,建议于三角烧瓶中配制 ,在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明(为避免煮沸时液体外溢 ,胶液体积应少于容器体积的 1/4) 。 待溶液冷却至 60 ℃左右 ,加入 10 mg/mL 溴化乙锭(EB,有毒)至终浓度 0. 5 μg/mL,摇匀 。

　　6. 6. 1. 2 将凝胶 液 缓 缓 倒 入 设 置 好 样 孔 梳 和 防 漏 条/套 的 水 平 放 置 的 凝 胶 船 , 胶 液 厚 度 0. 6 cm ~ 0. 8 cm。样孔梳底部水平深入凝胶层约 0. 3 cm~0. 5 cm ,并距凝胶底部 0. 2 cm , 以免穿透 。

　　6. 6. 1. 3 待凝胶完全凝固后 ,小心拔掉样孔梳 ,去掉防漏条/套 , 即可用于电泳 。

　　6. 6. 2 电泳

　　6. 6. 2. 1 将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶船一起装入水平电泳槽 ,加样孔朝负极 ,加入 1× 电泳缓冲液至没过胶面约 1 mm~ 2 mm 的深度 。

　　6. 6. 2. 2 将 10 μL第二步和第二步 PCR 反应产物分别与 2 μL 6×载样缓冲液混匀后加入到加样孔中 。 同时至少设一个泳道加入 5 μL 1 kb DNA Marker的载样混合物 。

　　6. 6. 2. 3 盖上电泳槽并通电 ,使 DNA 由阴极向阳极移动 。在 1 V/cm~ 5 V/cm 的电压下电泳约 1 h,当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的 1/2~ 2/3处时停止电泳 ,将凝胶置于紫外观察仪上观察或照相 。

　　5

　　GB/T 28630.2—2012

　　6. 6. 3 相对分子质量计算

　　6. 6. 3. 1 测定 Marker的每条区带到加样孔的迁移距离(即泳动率) ,将各区带相对分子质量的对数值对其泳动率作图 ,各点的排列应该接近是一条下降的直线 , 画出其趋势线 ,求出相对分子质量计算的回归方程 。

　　6. 6. 3. 2 测量各样品泳道 出 现 的 条 带 的 泳 动 率 , 利 用 Marker所 得 出 的 相 对 分 子 质 量 计 算 的 回 归 方程 ,计算各条带的泳动率 。

　　6. 6. 3. 3 由于凝胶在电泳时 ,其中的温度和电场的不均一性 , 以及电泳时所加样品的离子强度或 DNA浓度的差异 ,相同相对分子质量的 DNA 片段在凝胶中的泳动率会有所差异 ,各条带相对分子质量的实际测量的结果允许有 1% ~ 3%的误差 。

　　6. 6. 4 后处理

　　观察完毕的凝胶和污染有 PCR产物或 EB 的一次性用品和溶液应立即按附录 B 的规定处理 。

　　7 结果判定

　　7. 1 十足类生物样品:DNA提取质量及反应体系监控中 ,样品在 848bp处会有一条特定条带 。

　　7. 2 被检生物样品:第一步 PCR, 阳性对照在 1447 bp处有条带 , 阴性对照和无菌水为模板设立的空白对照无任何条带 ;第二步 PCR, 阳性对照在 941bp处有条带 , 阴性对照和空白对照无任何条带 。检测样品第一步 PCR后在 1447bp处有条带或第二步 PCR后在 941 bp处有条带均可判为阳性 。检测样品第一步 PCR后在 1447bp处无条带且第二步 PCR后在 941 bp处无条带可判为阴性 。

　　7. 3 白斑综合征(WSD)套式 PCR检测产物序列参见附录 C。

　　7. 4 条带的亮暗表示 PCR产物数量的多少 ,但并不对应于模板的量的多少 。样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读 。

　　7. 5 阳性结果表明样品中存在 WSSV DNA。对活虾和敏感宿主阳性表明已受到 WSSV感染 ;对虾产品和其他产品阳性表明曾受到 WSSV感染或受到 WSSV污染 。

　　7. 6 电泳结果分析和问题排除方法见表 3。

　　表 3 电泳结果分析

　　试验结果

　　结果判读及原因分析

　　问题排除

　　十足类动物样品

　　DNA提取质量及 体 系 监 控 反 应 中 样 品 在848bp处有条带 。

　　被检生物样品

　　第一步 PCR, 阳性对照在 1 447bp处有条带 , 阴性对照和无 菌 水 为 模 板 设 立 的 空 白 对照无任何条带 ;

　　第二步 PCR, 阳 性 对 照 在 941 bp处 有 条带 , 阴性对照和空白对照无任何条带 。

　　阳性样品第一步 PCR后 在 1 447 bp处 有 条带或第二步 PCR后在 941 bp处有条带 。

　　阴性样品第一步 PCR后 在 1 477 bp处 无 条带且第二步 PCR后在 941 bp处无条带

　　PCR反应正常 ,结果有效

　　6

　　GB/T 28630.2—2012

　　表 3 (续)

　　试验结果

　　结果判读及原因分析

　　问题排除

　　阳性对照有条带 ,但 Marker没有影像

　　Marker失效或量太少

　　更换 Marker或增加其加样量

　　Marker 有 影 像 , 但 十 足 类 动 物 样 品 在848bp处无条带

　　PCR反应失败

　　检 查 并 更 换 PCR 反 应 所 用 试 剂以及 PCR程序是否正确

　　阴性对照组在 1 447 bp或 941 bp处有条带出现

　　微量移液器污染

　　清洗微量移液器 ,只能用 PCR后区的微量移液器跑电泳

　　试剂污染

　　更换试剂

　　环境污染

　　清洁实 验 室 及 仪 器 设 备 ,参 见 附录 B

　　操作污染

　　禁止从 PCR后区到 PCR前区的交流 ,禁止从电泳区到 PCR操作区的交流 ,加强操作隔离 ,参见附录 B

　　阳性对照和阴性 对 照 组 正 常 ,但 十 足 类 动物样品中无任何条带(包括无 848bp条带)

　　DNA提取失败

　　检查 提 取 DNA 所 用 试 剂 情 况 ,重新试验

　　DNA 不 纯 致 使 PCR 抑 制 物介入

　　用 OD260/OD280 比 值 来 确 定 。 其正常比值应在 1. 6~ 1. 8之间 ,若低于 1. 6则表示杂质过多 。应重新提取 DNA

　　模板太少 , 第 一 步 的 产 物 被 过度稀释

　　增加第一步 PCR 的模板浓度 ,不稀释第二步的模板

　　第一步 PCR产物过浓

　　用电泳检查第一步 PCR产物 ,若可见 1 447 bp条带 ,则记录该样 品为阳性 ; 若 无 条 带 , 稀 释 样 品 或 第二 步 PCR 模 板 后 再 次 做 第 二步 PCR

　　Marker正常 ,但 阳 性 对 照 、阴 性 对 照 和 样品出现较多杂带或明显的弥散区

　　未 注 意 热 启动 操 作 , 使 PCR出现非特异性扩增

　　做好热启动操作 。 样品先要加到 PCR 管 盖 上 , 反 应 预 混 物 预 热后 ,短 暂 离 心 (数 秒) 以 混 入 样 品 ,迅速放回预热 PCR仪中

　　酶 活 性 变 化 、dNTP浓 度 变 化或 Mg2+ 浓度差异

　　确认预 混 物 制 备 的 准 确 性 、试 剂质量 ,对不 同 批 次 的 酶 重 新 测 定 最佳 Mg2+ 离子浓度

　　温度控制异常

　　检 查 PCR 仪 是 否 存 在 复 性 温 度过低的情况

　　7

　　GB/T 28630.2—2012

　　表 3 (续)

　　试验结果

　　结果判读及原因分析

　　问题排除

　　凝胶上无影像 ,包括 DNA Marker

　　紫外观察仪故障

　　检查紫外观察仪

　　背景发红太亮

　　减少 EBa 用 量 ,将 凝 胶 置 于 清 水中 30 min后再观察结果

　　凝胶片太厚

　　重新制作琼脂糖凝胶片

　　电极颠倒或电泳时间过长

　　重新加样电泳

　　EB分解失效

　　重新配置溴化乙锭(EB)

　　a 溴化乙锭(EB)有毒 ,试剂的操作和废弃物的处理按附录 B 的规定 。

　　8

　　GB/T 28630.2—2012

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试 剂 配 方

　　A. 1 1 mol/L Tris · HCl(pH8. 0)

　　Tris 121. 1 g

　　水 800 mL

　　溶解后加入约 42 mL浓盐酸调 pH 接近 8. 0,冷却至室温 ,再用 2. 5 mol/L盐酸调整 pH 至 8. 0。加水定容至 1 000 mL

　　分装后 ,高压蒸汽灭菌 ,室温贮存 。

　　A. 2 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 · 2H2 O) 18. 6 g

　　水 80 mL

　　磁力搅拌 ,用 2. 5 mol/L氢氧化钠调节溶液 pH值至 8. 0,完全溶解 ,定容至 100 mL。

　　高压蒸气灭菌 ,室温贮存 。

　　A. 3 TE 缓冲液 (pH8. 0)

　　1 mol/LTris · HCl(pH8. 0) 10 mL

　　0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0) 2 mL

　　加水定容至 1 000 mL

　　高压蒸气灭菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 4 1 mg/mL 胰 RNA 酶

　　胰 RNA酶 10 mg

　　TE缓冲液 (pH8. 0) 10 mL

　　溶解后 ,于 100 ℃加热 15 min,缓慢冷却至室温 ,分装 100 μL/管 , -20 ℃贮存 。

　　A. 5 10% SDS

　　SDS (十二烷基硫酸钠) 10 g

　　水 90 mL

　　加热至 68 ℃助溶 ,加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 至 7. 2,加水定容至 100 mL。

　　室温贮存 。若溶液有结晶形成 ,用前加热融解即可 。

　　SDS微细晶粒易 于 扩 散 , 称 量 时 要 戴 面 罩 , 称 量 完 毕 后 要 清 除 残 留 在 称 量 工 作 台区 和 天 平 上的 SDS。

　　9

　　GB/T 28630.2—2012