GB/T 28630.3-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第3部分：原位杂交检测法

　　ICS 65. 020. 30 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28630.3—2012

　　白斑综合征(WSD) 诊断规程

　　第 3 部分 :原位杂交检测法

　　Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease—

　　Part3:Insitu hybridization method

　　2012-07-31发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28630.3—2012

　　前 言

　　GB/T 28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分 :

　　— 第 1部分 :核酸探针斑点杂交检测法 ;

　　— 第 2部分 :套式 PCR检测法 ;

　　— 第 3部分 :原位杂交检测法 ;

　　— 第 4部分 :组织病理学诊断法 ;

　　— 第 5部分 :新鲜组织的 T-E染色法 。

　　本部分为 GB/T 28630的第 3部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出 。

　　本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归 口 。

　　本部分起草单位 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、农业部全国水产技术推广总站 。

　　本部分主要起草人 :黄倢 、杨冰 、陈爱平 、宋晓玲 、史成银 、杨丛海 、魏琦 、刘莉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28630.3—2012

　　白斑综合征(WSD)诊断规程

　　第 3 部分 :原位杂交检测法

　　1 范围

　　GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征原位杂交检测法所需试剂与材料 、仪器设备 、操作步骤和结果判定 。

　　本部分适用于进行对虾及白斑综合征的其他敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估和疾病的确诊 。不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 28630. 1—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第 1部分 :核酸探针斑点杂交检测法

　　GB/T 28630. 4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第 4部分 :组织病理学诊断法

　　3 原理

　　3. 1 白斑综合征的病原和病理学特征

　　见 GB/T 28630. 4—2012的 2. 1。

　　3. 2 技术原理

　　原位杂交检测方法是以非放射性标记物 — 地高辛(DIG)标记的白斑综合征病毒(WSSV) 核酸探针与存在于切片中的 WSSV DNA进行核酸分子杂交 ,并通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应在组织切片上显示出 WSSV 的存在位点 。原位杂交可完整保持组织与细胞形态 ,能在复杂组织中对单一细胞进行病毒检测 ,准确反映组织细胞中病毒的分布 。

　　4 试剂和材料

　　4. 1 除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。

　　4. 2 核酸探针按 GB/T 28630. 1—2012 中 6. 2 的规定 。

　　4. 3 碱性磷酸酶偶联的 DIG抗体(AP-抗 DIG,0. 75 U/μL,4 ℃) :生化试剂 。

　　4. 4 二甲苯 。

　　4. 5 无水乙醇 。

　　4. 6 95%乙醇 。

　　4. 7 中性树胶 :生物染色用 。

　　4. 8 石蜡(熔点 52 ℃ ~ 54 ℃) :切片级 。

　　4. 9 戴维森氏 AFA (Davidson’sAFA)固定液 :见附录 A 的规定 。

　　1

　　GB/T 28630.3—2012

　　4. 10 80%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　4. 11 70%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　4. 12 50%乙醇 :见附录 A 的规定 。

　　4. 13 500 μg/mL多聚赖氨酸 :见附录 A 的规定 。

　　4. 14 2×SSC:见附录 A 的规定 。

　　4. 15 1×SSC:见附录 A 的规定 。

　　4. 16 0. 5×SSC:见附录 A 的规定 。

　　4. 17 TNE:见附录 A 的规定 。

　　4. 18 100 μg/mL蛋白酶 K:见附录 A 的规定 。

　　4. 19 0. 4%甲醛 :见附录 A 的规定 。

　　4. 20 杂交缓冲液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 21 缓冲液 Ⅰ :见附录 A 的规定 。

　　4. 22 缓冲液 Ⅱ :见附录 A 的规定 。

　　4. 23 缓冲液 Ⅲ :见附录 A 的规定 。

　　4. 24 缓冲液 Ⅳ :见附录 A 的规定 。

　　4. 25 显影液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 26 0. 5%俾斯麦棕 Y(Bismark brown Y) :见附录 A 的规定 。

　　4. 27 阳性对照为受 WSSV感染且组织病理学上有明显 WSSV病灶的对虾组织切片(未脱蜡) 。

　　4. 28 阴性对照为未受 WSSV感染且经原位杂交证明为阴性的对虾组织切片(未脱蜡) 。

　　5 器材和设备

　　5. 1 石蜡切片机 :满足 4 μm~ 7 μm 厚度的石蜡连续切片要求 。

　　5. 2 水浴锅 :室温至 100 ℃ ,上下波动 1 ℃ 。

　　5. 3 显微镜 :带高倍镜(40×)和油镜(100×) 。

　　5. 4 微量移液器 :量程 0. 5 μL~ 10 μL、5 μL~40 μL、40 μL~ 200 μL、200 μL~ 1 000 μL各 1 支 。

　　5. 5 普通冰箱 :具冷藏箱 ,并带 -18℃以下冷冻箱体 。

　　5. 6 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤 。

　　5. 7 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤 。

　　5. 8 程控切片染色机或使用手工染色步骤 。

　　5. 9 切片保湿孵育箱 :室温至 50 ℃ ,上下波动 1 ℃或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中 。

　　5. 10 展片水浴锅 : 敞 口 ,无盖水浴锅或使用自制保温盒内加一定温度的水代替 。

　　5. 11 平板烘片机 :室温至 100 ℃或使用恒温箱代替 。

　　5. 12 切片染色杯 。

　　5. 13 医用镊子 。

　　5. 14 毛笔 。

　　5. 15 玻片架 。

　　5. 16 吸管 。

　　5. 17 载玻片 。

　　5. 18 盖玻片 。

　　5. 19 吸水纸 。

　　5. 20 暗盒 :可用任何能避免强光直射的盒子 。

　　2

　　GB/T 28630.3—2012

　　6 操作步骤

　　6. 1 组织切片制备

　　6. 1. 1 样品采集的要求 、固定方法和修整取材见 GB/T 28630. 4—2012 中附录 B 的规定 。

　　6. 1. 2 样品按 GB/T 28630. 4—2012 中 5. 2~ 5. 5 的规定将样品在程控组织脱水机中进行脱水 、透明 、浸蜡 ,在石蜡包埋机上进行包埋 ,用石蜡切片机进行切片 ,切片厚度 5 μm。用毛笔将切片移入展片水浴锅内展片 ,用已预包被 500 μg/mL 多聚赖氨酸的载玻片捞出 ,置于平板烘片机上 65 ℃烘烤 45 min。

　　6. 2 原位杂交

　　6. 2. 1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照) 在程控切片染色机中依次通过二甲苯(3次 , 5 min/次) 、无水乙醇 (2 次 , 1 min/次) 、95%乙 醇 (2 次 , 10 s/次) 、80%乙 醇 (2 次 , 10 s/次) 、50%乙 醇 ( 1 次 , 10 s/次) , 然后用蒸馏水冲洗 6次(勿让切片干燥) 。

　　6. 2. 2 组织切片置于 TNE 中 5 min,而后平放在切片保湿孵育箱中 , 吸取 500 μL 100 μg/mL蛋白酶K溶液 ,加于每张组织切片上 ,37 ℃孵育 15 min。

　　6. 2. 3 把组织切片上的蛋白酶 K溶液吸干 ,然后将其放入预冷到 4 ℃的 0. 4%甲醛溶液中浸 5 min。

　　6. 2. 4 室温下 ,用 2×SSC浸洗组织切片 5 min。

　　6. 2. 5 把组织切片平放 在 切 片 保 湿 孵 育 箱 中 , 吸 500 μL杂 交 缓 冲 液 于 每 张 组 织 切 片 上 , 42 ℃孵 育30 min。

　　6. 2. 6 按每毫升杂交缓冲液中加入 1 μL~ 4 μL核酸探针的用量取核酸探针置于一只微量离心管中 ,在 100 ℃沸水中将含核酸探针溶液的离心管煮沸 10 min,然后置于碎冰中淬冷 。

　　6. 2. 7 将上述核酸探针与相应量(每张切片应 500 μL)的杂交缓冲液混合 , 吸取 500 μL混合液于每张组 织切片上 ,置于 90℃ ~ 95℃平板烘片机上保温 6 min~ 10min,使组织 DNA变性 。注意补充切片上过度蒸发的杂交缓冲液 。

　　6. 2. 8 把组织切片放在平整的冰上淬冷 5 min。

　　6. 2. 9 在切片保湿孵育箱内 42 ℃下孵育 16h~ 18h。

　　6. 2. 10 用缓冲液 2×SSC (15 min,室温) 、1× SSC (5 min,室温) 、0. 5× SSC (15 min,42 ℃) 、0. 5× SSC (15 min,42 ℃) 、缓冲液 Ⅰ (5 min,室温)洗组织切片 。

　　6. 2. 11 用缓冲液 Ⅱ封闭组织切片(500μL/片) ,37 ℃温浴 30 min。

　　6. 2. 12 用缓冲液 Ⅱ将 AP-抗 DIG稀释至 0. 75U/mL(1μL0. 75U/μLAP-抗 DIG加到 1 mL缓冲液Ⅱ 中) ,把组织切片平放在湿盒中 ,每片吸 250μL已用缓冲液 Ⅱ稀释的 AP-抗 DIG 于组织切片上 ,37 ℃温浴 30 min。

　　6. 2. 13 用缓冲液 Ⅰ (2次 ,10 min/次 ,室温) 、缓冲液 Ⅲ(1次 ,5 min,室温)洗玻片 。

　　6. 2. 14 吸 500 μL显影液于每张组织切片上 ,室温下黑暗中放置 1 h~ 3 h。 中间可取出短时间在显微镜下观察显色情况 , 当阳性对照有明显显色时可中止反应 ,如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特异性显色 ,则应立即终止显色 。

　　6. 2. 15 室温下把组织切片置于缓冲液 Ⅳ中 15 min终止反应 。

　　6. 2. 16 组织切片上滴加双蒸水(1次 , 10 s/次) 、0. 5%俾斯麦棕 Y(1次 , 1 min/次) 、95%乙醇(3次 , 10 s/次) 、无水乙醇(3次 ,10 s/次) 、二甲苯(4次 ,10 s/次) 。

　　6. 2. 17 滴加 2滴中性树胶封片 。

　　6. 2. 18 在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色的细胞内沉淀物并拍照 。

　　3

　　GB/T 28630.3—2012

　　7 结果判定

　　7. 1 受 WSSV感染的细胞显示阳性反应 , 即细胞核内有较深的蓝黑色颗粒沉淀 ,而阴性结果则无此沉淀 。感染程度越深 ,则着色越明显 。对虾甲壳上的显色是非特异性反应所致 ,如果加有核酸探针和杂交缓冲液的切片在 90 ℃ ~ 95 ℃平板烘片机上保温 6 min~ 10 min过程中 , 因缓冲液蒸发而使组织干燥 ,干燥部分也会出现非特异性反应 。

　　7. 2 阳性对照样品不显阳性反应或阴性对照样品出现与阳性显色反应程度相当的非特异性反应 ,判断检测结果无效 ,重新取样检测 。

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　　GB/T 28630.3—2012

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试 剂 配 方

　　A. 1 20×SSC

　　氯化钠 175. 32 g

　　柠檬酸三钠 · 2H2 O 88. 23 g

　　加水溶解定容至 1 000 mL

　　调节 pH 至 7. 0

　　高压蒸汽灭菌后 ,室温贮存 。

　　A. 2 2×SSC

　　20×SSC 100 mL

　　水 900 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 3 1×SSC

　　20×SSC 50 mL

　　水 950 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 4 0. 5×SSC

　　20×SSC 50 mL

　　水 1 950 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 5 10×缓冲液 Ⅰ

　　Tris 121. 1 g

　　氯化钠 87. 7 g

　　加水溶解至 800 mL

　　用浓盐酸调节 pH 至 7. 5

　　加双蒸水定容至 1 000 mL

　　高压蒸汽灭菌 ,4 ℃贮存 。

　　5

　　GB/T 28630.3—2012

　　A. 6 缓冲液 Ⅰ

　　10×缓冲液 Ⅰ

　　水

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　100 mL

　　900 mL

　　A. 7 10×缓冲液 Ⅲ

　　Tris

　　121. 1 g

　　氯化钠

　　58. 4 g

　　加水溶解至

　　800 mL

　　用浓盐酸调节 pH 至

　　9. 5

　　六水氯化镁(MgCl2 · 6H2 O)

　　101. 6 g

　　加双蒸水定容至

　　1 000 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 , 出现沉淀后丢弃 。

　　A. 8 缓冲液 Ⅲ

　　10×缓冲液 Ⅲ

　　100 mL

　　水

　　900 mL

　　混匀 ,0. 45μm滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 , 出现沉淀后丢弃 。

　　A. 9 NBT贮存液

　　四氮唑蓝(NBT)

　　100 mg

　　二甲基甲酰胺

　　0. 931 mL

　　水

　　0. 402 mL

　　避光 , -20 ℃贮存 。

　　A. 10 BCIP贮存液

　　5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(BCIP)

　　100 mg

　　二甲基甲酰胺

　　2 mL

　　避光 , -20 ℃贮存 。

　　A. 11 10× TNE

　　Tris

　　60. 57 g

　　氯化钠

　　5. 84 g

　　EDTA · 2H2 O

　　3. 72 g

　　加水溶解至

　　900 mL

　　6

　　GB/T 28630.3—2012

　　用盐酸调 pH 至

　　加水定容至

　　高压蒸气灭菌后 ,4 ℃贮存 。

　　7. 4 1 000 mL

　　A. 12 TNE

　　10×TNE

　　100 mL

　　水

　　900 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃保存 。

　　A. 13 10mg/mL 蛋白酶 K

　　蛋白酶 K

　　100 mg

　　加水定容至

　　10 mL

　　分装于无菌离心管中(0. 25 mL/管) , -20 ℃下保存 。

　　A. 14 100μg/mL 蛋白酶 K

　　10 mg/mL 蛋白酶 K

　　0. 25 mL

　　TNE

　　24. 75 mL

　　用前临时配制 ,混匀 ,4 ℃存放 。

　　A. 15 0. 4%甲醛

　　甲醛(37%)

　　5. 4 mL

　　水

　　500 mL

　　倒掉前可重复使用 4次 ,用前预冷 。

　　A. 16 20×丹哈特氏液(Denhardt’s)

　　牛血清白蛋白(组分 5)

　　0. 4 g

　　聚蔗糖 400 (ficoll400)

　　0. 4 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 360 (PVP 360)

　　0. 4 g

　　加水溶解并定容至

　　100 mL

　　0. 45 μm 的滤器过滤 ,5 mL/支分装 , -20 ℃贮存 。

　　A. 17 25% 硫酸葡聚糖

　　硫酸葡聚糖(dextran sulfate)

　　25 g

　　加水定容至

　　100 mL

　　低热搅拌片刻使之溶解 , -20 ℃保存 。

　　7

　　GB/T 28630.3—2012

　　A. 18 10mg/mL 鲑精 DNA

　　鲑精 DNA 250 mg

　　水 25 mL

　　将鲑精 DNA钠盐加入水中 , 用 玻 璃 棒 搅 拌 直 至 完 全 溶 解 。 用 6 号 针 头 的 注 射 器 反 复 抽 打 数 次 。在 100 ℃水浴中加热 10 min, 立 即 放 于 冰 浴 中 淬 冷 , 分 装 于 无 菌 小 试 管 中 , - 20 ℃保 存 。 使 用 前 在100 ℃水浴中加热 5 min,然后淬冷 。

　　A. 19 杂交缓冲液

　　20×SSC 10 mL

　　100%甲酰胺 25 mL

　　20×丹哈特氏液 2. 5 mL

　　10 mg/mL 鲑精 DNA 2. 5 mL

　　25%硫酸葡聚糖 10 mL

　　混匀 ,4 ℃贮存 。

　　A. 20 缓冲液 Ⅱ

　　blocking reagent Ⅱ 0. 5 g

　　缓冲液 Ⅰ 100 mL

　　在 60 ℃ ~ 80 ℃水浴中溶解 ,不断晃动 ,直至颗粒溶解 。4 ℃可贮存 2周 。

　　A. 21 10×缓冲液 Ⅳ

　　Tris 12. 1 g

　　EDTA-Na2 · 2H2 O 3. 7 g

　　加水溶解 ,并定容至 1 000 mL

　　用盐酸调 pH 至 8. 0,高压灭菌 。4 ℃贮存 。

　　A. 22 缓冲液 Ⅳ

　　10×缓冲液 Ⅳ 100 mL

　　水 900 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 。4 ℃贮存 。

　　A. 23 10% 聚乙烯醇

　　聚乙烯醇 (相对分子质量 30 000~ 70000) 10 g

　　加水溶解并定容至 100 mL

　　搅拌溶解后 ,分装 10 mL/管 , -20 ℃贮存 。

　　8

　　GB/T 28630.3—2012

　　A. 24 显影液

　　缓冲液 Ⅲ

　　90 mL

　　盐酸左旋咪唑

　　24 mg

　　10% 聚乙烯醇

　　4 ℃保存

　　10 mL

　　用前在每毫升上述混合液中加入 :

　　NBT贮存液

　　4. 5 μL

　　BCIP贮存液

　　3. 5 μL

　　A. 25 0. 5%俾斯麦棕 Y

　　俾斯麦棕 Y (Bismark brown Y)

　　2. 5 g

　　水

　　500 mL

　　把染料溶于水中 ,过滤 。室温贮存 。

　　A. 26 500μg/mL 多聚赖氨酸

　　多聚赖氨酸(相对分子质量 25000)

　　5 mg

　　水

　　10 mL

　　溶解后 ,4 ℃贮存 。

　　A. 27 戴维森氏 AFA(Davidson’sAFA)固定液

　　95%乙醇

　　330 mL

　　甲醛(37%)

　　220 mL

　　冰乙酸

　　115 mL

　　海水(用于海洋甲壳类)或自来水

　　混匀 ,室温密封贮存 。

　　335 mL

　　A. 28 80%乙醇

　　95%乙醇

　　800 mL

　　加水定容至

　　950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　A. 29 70%乙醇

　　95%乙醇

　　700 mL

　　加水定容至

　　950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　9

　　GB/T 28630.3—2012

　　A. 30 50%乙醇

　　95%乙醇 500 mL

　　加水定容至 950 mL

　　混匀 ,室温贮存 。

　　10