GB/T 28630.1-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分：核酸探针斑点杂交检测法

　　ICS 65. 020. 30 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28630. 1—2012

　　白斑综合征(WSD) 诊断规程

　　第 1 部分 :核酸探针斑点杂交检测法

　　Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease—

　　Part1:Dotblothybridization method with DNA probe

　　2012-07-31发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28630. 1—2012

　　前 言

　　GB/T 28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分 :

　　— 第 1部分 :核酸探针斑点杂交检测法 ;

　　— 第 2部分 :套式 PCR检测法 ;

　　— 第 3部分 :原位杂交检测法 ;

　　— 第 4部分 :组织病理学诊断法 ;

　　— 第 5部分 :新鲜组织的 T-E染色法 。

　　本部分为 GB/T 28630的第 1部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出 。

　　本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归 口 。

　　本部分起草单位 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、农业部全国水产技术推广总站 。

　　本部分主要起草人 :黄倢 、杨冰 、陈爱平 、宋晓玲 、史成银 、杨丛海 、魏琦 、刘莉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28630. 1—2012

　　引 言

　　本文件的发布机构提请注意 ,声明符合本文件时 ,涉及到国家发明专利 “对虾流行病病原检测试剂盒及其检测方法 ”(ZL 00 1 11336. 4)的使用 。

　　本文件的发布机构对于该专利的真实性 、有效性和范围无任何立场 。

　　该专利持有人已向本文件的发布机构保证 ,他们愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 ,就专利授权许可进行谈判 。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 。相关信息可以通过以下联系方式获得 :

　　专利持有人姓名 :史成银 、杨冰 、黄倢 、宋晓玲 、杨丛海 。

　　地址:中国水产科学研究院黄海水产研究所 , 山东省青岛市南京路 106号 。

　　请注意除上述专利外 ,本文件的某些内容仍可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　Ⅱ

　　GB/T 28630. 1—2012

　　白斑综合征(WSD)诊断规程

　　第 1 部分 :核酸探针斑点杂交检测法

　　1 范围

　　GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征核酸探针斑点杂交检测方法所需试剂与材料 、仪器设备 、操作步骤和结果判定 。

　　本部分适用于对虾的成虾 、幼虾 、仔虾 、幼体和受精卵的活体 、冰鲜或冰冻产品和其他对白斑综合征病毒敏感的甲壳类生物白斑综合征病原的筛查 、临床病症的确诊 ,不适用于对病毒感染活性的估测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 28630. 4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第 4部分 :组织病理学诊断法

　　3 原理

　　3. 1 白斑综合征的病原和病理学特征

　　见 GB/T 28630. 4—2012的 2. 1。

　　3. 2 技术原理

　　以非放射性标记物 — 地高辛标记的白斑综合征病毒(WSSV)DNA 片段 , 即核酸探针 , 与存在于样品中的病毒 DNA进行特异性的核酸分子杂交 ,通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应显示样品中病毒的存在 。

　　4 试剂和材料

　　4. 1 除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。

　　4. 2 含氯消毒剂 : 医用品或水产药物 。

　　4. 3 杂交膜 :硝酸纤维素膜 。

　　4. 4 PCR DIG Probe Synthesis Kit1) 。

　　4. 5 十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl) :生化试剂 。

　　4. 6 十二烷基硫酸钠(SDS) :生化试剂 。

　　4. 7 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 · 2H2 O) :生化试剂 。

　　4. 8 巯基乙醇 :生化试剂 。

　　4. 9 Tris平衡酚(饱和酚) :生化试剂 。

　　1) PCR DIG Probe Synthesis Kit是由 Roche公司提供的产品的商品名 。给出这一信息是为了方便本部分的使用者 ,并不表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果 ,则可使用这些等效产品 。

　　1

　　GB/T 28630. 1—2012

　　4. 10 封闭剂 :Blocking Reagent2) ,生化试剂 。

　　4. 11 碱性磷酸酶偶联的 DIG抗体(AP-抗 DIG,0. 75 U/μL,4 ℃) :生化试剂 。

　　4. 12 琼脂糖 : 电泳级 。

　　4. 13 1 kb DNA Marker:生化试剂 。

　　4. 14 TaqDNA 聚合酶(5U/μL) :生化试剂 , -20 ℃保存 。

　　4. 15 10×PCR缓冲液 :生化试剂 ,无 Mg2+ , 随 TaqDNA 聚合酶提供 , -20 ℃保存 。

　　4. 16 氯化镁溶液(25 mmol/L) :生化试剂 , -20 ℃保存 。

　　4. 17 dNTP:生化试剂 ,含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 10 mmol/L的混合物 , -20 ℃保存 。

　　4. 18 核酸探针引物序列 F:5′-CTGTAATTGGACGAGGAG-3′。

　　4. 19 核酸探针引物序列 R:5′-CTGCCAACCTTAGAGTTC-3′。

　　4. 20 研磨液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 21 泡膜液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 22 预杂交母液 :见附录 A 的规定 。

　　4. 23 1×缓冲液 A:见附录 A 的规定 。

　　4. 24 1×缓冲液 B:见附录 A 的规定 。

　　4. 25 1×清洗液 Ⅰ :见附录 A 的规定 。

　　4. 26 1×清洗液 Ⅱ :见附录 A 的规定 。

　　4. 27 显色剂 A:见附录 A 的规定 。

　　4. 28 显色剂 B:见附录 A 的规定 。

　　4. 29 溶有显色剂 A 和显色剂 B 的 1×缓冲液 B:见附录 A 的规定 。

　　4. 30 扁头镊子 。

　　4. 31 剪刀 。

　　4. 32 洗涤皿 :直径 5 cm~ 9 cm 的平皿 。

　　4. 33 吸管 。

　　4. 34 玻璃研磨棒或塑料研磨棒 。

　　4. 35 杂交袋 。

　　4. 36 暗盒 :不透光的容器 ,可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替 。

　　4. 37 1. 5 mL塑料微量离心管 :经高压蒸汽灭菌 。

　　4. 38 一次性塑料手套 。

　　4. 39 滤纸 。

　　5 仪器设备

　　5. 1 普通冰箱 :具冷藏箱 ,并带 -18℃以下冷冻箱体 。

　　5. 2 台式高速离心机 :用于 1. 5 mL塑料微量离心管的离心 ,最高转速可达 12 000 r/min以上 。

　　5. 3 恒温箱 :可满足 80 ℃ ±5 ℃ 。

　　5. 4 水浴锅 :可满足 65 ℃ ±1 ℃ 。

　　5. 5 振荡器 :振荡频率 40 r/min~ 220 r/min。

　　5. 6 塑料封口机 :可满足 5 cm 以上杂交袋热塑封 口 ,溶液溢出到电阻丝或外壳上时不会发生漏电 。

　　5. 7 电炉或其他加热设备 :可满足 200 mL~ 2 000 mL水在敞口容器中沸腾 10 min。

　　2) Blocking ReagentⅡ是由 Roche公司提供的产品的商品名 。给出这一信息是为了方便本部分的使用者 ,并不表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果 ,则可使用这些等效产品 。

　　2

　　GB/T 28630. 1—2012

　　5. 8 微量移液器 :量程 0. 5 μL~ 10 μL。

　　5. 9 温度计 :量程 0 ℃ ~ 100 ℃ ,精度 ±1 ℃ 。

　　6 操作步骤

　　6. 1 样品的准备

　　6. 1. 1 样品采集的要求见 GB/T 28630. 4—2012 中附录 B 的规定 。

　　6. 1. 2 取对虾的个体(适用于 3 cm 以下幼虾 、仔虾 ,幼体和受精卵)或对虾的胃或鳃丝组织(适用于活体或冰冻的养成期幼虾 、成虾和亲虾)样品约 0. 1 g,置于 1. 5 mL灭菌塑料微型离心管中 ,加入 0. 3 mL研磨液 ,用研磨棒将样品充分研磨后 ,于 8000 r/min~ 10 000 r/min离心 2 min取上清备用 。

　　6. 1. 3 为防止交叉污染 ,接触样品的工具及研磨棒要浸于新配制的有效氯含量 3. 0×10-3含氯消毒剂中 5 min,再充分清洗后方可用于下一个样品 。

　　6. 2 核酸探针的制备

　　6. 2. 1 模板为纯化病毒核酸 。标记之前需优化并确定 PCR反应条件 。 100 μL反应体系 : 10 μL 10× PCR缓冲液 、1 μL 10 mmol/L dTTP、2 μL dNTP、8 μL 25 mmol/LMgCl2 、5 μL引物 F(10ng/μL) 、 5 μL引物 R(10ng/μL) 、2 μL模板 、灭菌双蒸水 66μL;混匀后 ,进行一个热启动(94 ℃ 10 min、55 ℃ 5 min) ;离心后加入 1 μLTaq DNA 聚合酶(5U/μL) ,进行 35个循环(92 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min) ,72 ℃ 5 min后 4 ℃保存 。PCR产物大小 :546bp。

　　6. 2. 2 核酸探针标记方法按照 4. 4 的说明进行 。

　　6. 3 泡膜

　　按样品数量隔着衬纸在杂交膜上用软铅笔划格 ,每样为 5 mm×5 mm 小格 , 同时要加上阴性对照和阳性对照的数目 ,沿框线将所需大小的杂交膜剪下 ,共需两张 。左上角剪角的一张为测试膜 ,左上角用软铅笔点点标记的为对照膜 。将杂交膜飘浮于蒸馏水表面 , 吸水后沉入水中 10 min,后浸泡于泡膜液中 5 min,再将膜置于滤纸上晾干 。

　　6. 4 点样

　　将准备好的样品上清液(包括阴性对照和阳性对照)在 100 ℃水浴中煮沸 10 min,再迅速置于冰水浴中 2 min以上 。稍离心使管内水珠集中 ,在晾干的测试膜和对照膜相应方格内点样 ,每样 1 μL, 自然晾干 。

　　6. 5 交联

　　将晾干的杂交膜夹于两张滤纸中间 ,放于 80 ℃烘箱中烘烤 2 h。

　　6. 6 预杂交

　　按杂交膜大小准备适量的预杂交母液(0. 2 mL/cm2 )并加入封闭剂(每毫升预杂交母液加入 10 mg封闭剂) ,在 65 ℃不断搅动溶解 。

　　将两张膜分别置于两个杂交袋中 ,加入溶有封闭剂的预杂交母液 ,封 口 ,在 65 ℃水浴中孵育 2 h。

　　6. 7 杂交

　　按膜大小计算所需探针含量 :每毫升溶有封闭剂的预杂交母液中加入 1 μL~ 4 μL标记核酸探针 。

　　3

　　GB/T 28630. 1—2012

　　将探针于 100 ℃水浴中煮沸 10 min,再迅速置于冰水浴中 , 2 min后 , 剪开测试膜杂交袋一角 , 加入探针 ,封 口 。混匀袋中液体 ,两个杂交袋在 65 ℃水浴中孵育 6 h~ 16h。

　　6. 8 加入抗体

　　按杂交膜大小 ,在适量 1×缓冲液 A(0. 2 mL/cm2 )中加入封闭剂(每毫升 1×缓冲液 A加入 10mg封闭剂) ,在 70 ℃ ~ 90 ℃水浴中不断搅动溶解 。

　　完全剪开两个杂交袋 ,取出杂交膜 ,按下列步骤洗涤 :

　　a) 1×清洗液 Ⅰ ,5 min/次 ×2 次 ,室温(在洗涤皿中进行 , 间歇摇晃) ;

　　b) 1×清洗液 Ⅱ ,15 min/次 ×2 次 ,65 ℃(在杂交袋中分别进行 ,>0. 5 mL/cm2 ,每次换袋) ;

　　c) 1×缓冲液 A,2 min/次 ×1 次 ,室温(在洗涤皿中进行 , 间歇摇晃) ;

　　d) 将两张杂交 膜 分 别 置 于 两 个 杂 交 袋 中 , 加 入 溶 有 封 闭 剂 的 1 × 缓 冲 液 A, 封 口 , 室 温 放 置30 min;

　　e) 剪开两个 杂 交 袋 一 角 , 分 别 加 入 1/50体 积 的 100× 碱 性 磷 酸 酶 偶 联 的 DIG 抗 体 (AP-抗DIG) ,在振荡器上于室温振荡 30 min。

　　6. 9 显色

　　完全剪开两个杂交袋 ,取出膜 ,按下列步骤洗涤 :

　　a) 1×缓冲液 A,15 min/次 ×2 次 ,室温(在平皿中进行 , 间歇摇晃) ;

　　b) 1×缓冲液 B,2 min/次 ×1 次 ,室温(在平皿中进行 , 间歇摇晃) 。

　　将两张杂交膜分别装于两个杂交袋中 ,加入溶有显色剂 A和显色剂 B 的 1×缓冲液 B(0. 2 mL/cm2 ) ,封口 ,置于暗盒中显色 15min~120min(显色时间与温度有关) 。 中间可取出短时间观察 ,勿搅动 ,观察后立即放回 。

　　6. 10 观察

　　测试膜上阳性对照样品明显出现颜色而杂交膜本底刚有所变色时 ,立即剪开杂交袋 ,取出膜 ,置于蒸馏水中漂洗 15 min~ 30 min终止显色 。将膜置于滤纸上晾干 。对光观察 ,记录结果 。

　　7 结果判定

　　7. 1 测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色 , 阴性对照样品无色 ,对照膜上两个样品均无色 。膜上的黄色 、红色等颜色都不属于病毒导致的显色 。检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行 。测试膜上样品斑点显蓝褐色而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时 ,该样品判断为阳性 。依据显色结果强弱分为弱阳性结果(+) 、阳性结果(++ , +++)和强阳性结果(++++) 。

　　7. 2 测试膜斑点不显色 ,该样品判断为阴性 。

　　7. 3 测试膜与对照膜均有明显的颜色 ,表明样品存在明显的非特异性反应干扰 ,测试结果无效 ,应重新取样检测 。

　　白斑综合征(WSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图参见附录 C。

　　7. 4 阳性结果表明存在 WSSV DNA。活虾和敏感宿主阳性表明已受到 WSSV感染 ;对虾产品和其他产品阳性表明携带 WSSV。

　　7. 5 结果可疑时 ,补充组织病理学诊断或 PCR检测进行结果确认 。

　　4

　　GB/T 28630. 1—2012

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试剂配方

　　A. 1 泡膜液(20×SSC)

　　氯化钠(NaCl)

　　175. 32 g

　　柠檬酸三钠(2H2 O)

　　88. 23 g

　　加水溶解定容至

　　1 000 mL

　　调节 pH 至 7. 0

　　高压蒸汽灭菌后 ,室温贮存 。

　　A. 2 研磨液

　　20×SSC

　　125 mL

　　0. 5 mol/L EDTA

　　70 mL

　　10% SDS

　　50 mL

　　巯基乙醇

　　2. 5 mL

　　Tris平衡酚至饱和(即溶液呈乳白色)约加水定容至

　　15 mL~ 20 500 mL

　　mL

　　溶解过程有絮状沉淀可以稍加热并搅拌混匀 。4 ℃贮存 ,使用时取上清 。

　　A. 3 5×SSC

　　20×SSC 250 mL

　　水 750 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 4 预杂交母液

　　5×SSC 10 mL

　　20% Sarkosyl 50 μL

　　10% SDS 20 μL

　　混匀 ,4 ℃贮存 。

　　A. 5 10×缓冲液 A

　　Tris 121. 1 g

　　氯化钠(NaCl) 87. 7 g

　　加水溶解至 800 mL

　　用浓盐酸调节 pH 至 7. 5

　　5

　　GB/T 28630. 1—2012

　　加双蒸水定容至 1 000 mL

　　高压蒸汽灭菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 6 1× 缓冲液 A

　　10×缓冲液 A 100 mL

　　水 900 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 。

　　A. 7 10×缓冲液 B

　　Tris 121. 1 g

　　氯化钠(NaCl) 58. 4 g

　　加水溶解至 800 mL

　　用浓盐酸调节 pH 至 9. 5

　　六水合氯化镁(MgCl2 · 6H2 O) 101. 6 g

　　加双蒸水定容至 1 000 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 , 出现沉淀后丢弃 。

　　A. 8 1× 缓冲液 B

　　10×缓冲液 B 100 mL

　　水 900 mL

　　混匀 ,0. 45 μm 滤膜过滤除菌 ,4 ℃贮存 , 出现沉淀后丢弃 。

　　A. 9 1× 清洗液 Ⅰ

　　20×SSC 10 mL

　　10% SDS 0. 1 mL

　　加水定容至 100 mL

　　混匀 ,室温贮存 ,若出现白色浑浊沉淀加热直至溶解后使用 。

　　A. 10 1× 清洗液 Ⅱ

　　20×SSC 0. 5 mL

　　10% SDS 0. 1 mL

　　加水定容至 100 mL

　　混匀 ,室温贮存 ,若出现白色浑浊沉淀加热直至溶解后使用 。

　　A. 11 显色剂 A

　　四氮唑蓝(NBT)

　　100 mg

　　二甲基甲酰胺

　　0. 931 mL

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　　GB/T 28630. 1—2012

　　水 0. 402 mL

　　避光 , -20 ℃贮存 。

　　A. 12 显色剂 B

　　5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(BCIP) 100 mg

　　二甲基甲酰胺 2 mL

　　避光 , -20 ℃贮存 。

　　A. 13 溶有显色剂 A 和显色剂 B 的 1× 缓冲液 B

　　1×缓冲液 B 1 mL

　　显色剂 A 4. 5 μL

　　显色剂 B 3. 5 μL

　　立即使用 。

　　7

　　GB/T 28630. 1—2012

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　白斑综合征病毒(WSSV)核酸探针斑点杂交检测标记探针序列

　　1 AGTTTCCAGAAGACAACATAATTTAGCTGT AATTGGACGA GGAGACTTCT TGTAATGAGA F

　　61 GAACCACAAAATTCTTCTTC CCGTCTTTTC TGGTATAAAA GTAGTCCCAT AATATGTTCC

　　121 TTTCTGGACT ACCACATTAT CTTCGTTTAA GGGAACATAT CTGACCGACT TTCTCATCAA

　　181 GGGCTGATCT CCATTTCTTG TTGTGCTTAG AGCCGATTTG TATTCCCCGT CGTTCACGTT

　　241 ATAGTTGCAT ATAGAACAGT GGGATGAAAGGAACTTGTCG GTTACGTGTT CAGTTTGTAC

　　301 AAGATAACTG GACGCATTTGCTAGTTCTGG AGGGACGTCC TGGTTTTTGT TTATTGTTGA

　　361 AGTAGGTTTT ATCTTTTTCC TATTTAAGCA CACACCCTTT GAATTAATGT GTATGCGATT

　　421 CGCATTGATG TATATGCAGA TTGTGAGTGCTGGAGAAAAT GGTATCTCAA AATCGGTAGC

　　481 TGGTTCAATA ATTTCTGGTTCAACTTCCTG TTGTTCTTCT TCCTCATCTT TCTCTTCCTT

　　541 ATTTTTGACA CCTAGAACTCTAAGGTTGGC AGTACTAATT ATTCTGGCTG CAGCCGTGCT R

　　601 GGTAGCAGAAGGGGAAGA

　　8

　　GB/T 28630. 1—2012

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　白斑综合征(WSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图

　　D4— 阳性对照 ;

　　D5— 阴性对照 ;

　　B1— 强阳性结果 , ++++ ; C4— 阳性结果 , +++ ;

　　C5— 阳性结果 , ++ ;

　　C1— 弱阳性结果 , + ;

　　其他为阴性结果 , - 。

　　图 C. 1 白斑综合征(WSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图

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