GB/T 28065-2011 地中海实蝇生物芯片检测方法
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资料介绍
ICS 65. 020. 01 B 16
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB/T 28065—2011
地中海实蝇生物芯片检测方法
Biochip detection ofCeratitiscapitata (Wiedemann)
2011-12-30发布 2012-06-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会
发
布
GB/T 28065—2011
前 言
本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。
本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 ,本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院 。
本标准主要起草人:余道 坚 、李 建 光 、任 鲁 风 、徐 浪 、周 琦 、章 桂 明 、陈 枝 楠 、汪 万 春 、康 林 、仲 建 忠 、向才玉 。
Ⅰ
GB/T 28065—2011
地中海实蝇生物芯片检测方法
1 范围
本标准确定了地中海实蝇 Ceratitiscapitata (Wiedemann) (双翅 目 Diptera实蝇科 Tephritidae)的生物芯片制备 、检测和结果判定方法 。
本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵 、幼虫 、蛹的鉴定和成虫的鉴定或复核 。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。
SN/T 2039 地中海实蝇检疫鉴定方法 PCR法
3 缩略语
SN/T 2039界定的缩略语适用于本文件 。
4 方法原理
选择实蝇科昆虫线粒体 DNA COI基因核苷酸片段为分子标记探针 ,将探针按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体(如:醛基化基片)的表面形成微点阵 ,利用反向固相杂交技术 ,用 Cy3标记脱氧胞苷三磷酸(Cy3-dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交 , 实现多个分子之间的杂交反应 ,并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在 ,最后确定是否为地中海实蝇 。
5 仪器和用具
PCR扩增仪 、芯 片 点 样 仪 、芯 片 扫 描 仪 、离 心 机 、水 浴 锅 、涡 旋 器 、冰 箱 、电 子 天 平 、烘 箱 、磁 力 搅拌器 。
醛基化基片 、多孔板 、芯片盖片 、芯片分隔围栏 、芯片粘贴工具 、湿盒 、杂交盒 、计时器 、磁柱 、芯片架 、 2 L烧杯 、15 mL离心管 、量筒 、移液器等 。
6 试剂
6. 1 昆虫基因组 DNA提取试剂盒 。
6. 2 DNA快速纯化/回收试剂盒 。
6. 3 去离子水 。
6. 4 50%二甲基亚砜(DMSO) 。
6. 5 0. 2%十二烷基磺酸钠(SDS) 。
6. 6 0. 2%硼氢化钠 。
1
GB/T 28065—2011
6. 7 10×SSPE (20×SSPE:3 mol/L氯化钠 ,200 mmol/L磷酸二氢钠 ,25 mmol/LEDTA, pH 7. 4) 。
6. 8 0. 3×SSC、0. 06×SSC (20×SSC:3 mol/L氯化钠 ,300 mmol/L柠檬酸钠) 。
6. 9 10×PCR缓冲液(Mg2+ ,15 mmol/L) 。
6. 10 dATP,dTTP, dCTP,dGTP (10 pmol/μL) 。
6. 11 Cy3-dCTP。
6. 12 Taq酶 。
6. 13 引物(10 pmol/μL) 。
6. 14 探针(50 μmol/L) 。
6. 15 阳性质粒 。
6. 16 乙醇(70%和 99. 9%) 。
6. 17 洗液 Ⅰ (0. 3×SSC,0. 2% SDS) 。
6. 18 洗液 Ⅱ (0. 06×SSC) 。
7 生物芯片检测方法
7. 1 样品前处理
按照 SN/T 2039进行 。
7. 2 基因组 DNA 制备
按照 SN/T 2039进行 。
7. 3 生物芯片探针
7. 3. 1 检测探针
检测探针包括以下类型的探针(见 A. 1) :
— 实蝇科通用探针 ;
— 地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针 ;
— 地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针 ;
— 地中海实蝇种特异探针 ;
— 纳塔尔实蝇 C. rosa种特异探针 ;
— 非洲芒果实蝇 C. cosyra种特异探针 。
注 1: 检测探针是一条 20 nt~ 29 nt的寡核苷酸 ;序列为实蝇科昆虫的特异性序列 ,5’端氨基修饰 。
注 2: 实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫 ,近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种 ,地中海实蝇 、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇 。
7. 3. 2 质控探针
质控探针包括以下四种类型探针(见 A. 2) :
— 定位点探针 ;
— 阳性对照探针 ;
— 阴性对照探针 ;
— 空白对照 。
7. 4 芯片制备
7. 4. 1 芯片基片:选择光学级醛基基片 。
2
GB/T 28065—2011
7. 4. 2 探针稀释:探针用 50%DMSO溶解至终浓度为 50 μmol/L,按照探针点阵排布顺序 ,将探针溶液用移液器加入多孔板中 。
7. 4. 3 点样:用芯片点样仪将探针点至基片上 。实蝇芯片探针阵列排布图参见 B. 1。一张基片四个探针点阵的示意图参见 B. 2。
注 : 每个阵列共 5行 10列 ,第 1行和第 1列为定位点探针 ,其他探针各设三个重复 。每张基片可以根据实际需求点1个或多个相同探针点阵 。
7. 4. 4 水合:基片置湿盒(内盛三分之一体积水) ,在烘箱 37 ℃水合 12 h。
7. 4. 5 固定:将基片放在芯片架上 ,置盛有 0. 2%SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗 5 min。取出再放入盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗 3 次 ,每次 2 min。
注 : 漂洗时溶液应没过基片 ,洗涤时应在洗液中加入磁柱 ,打开磁力搅拌器搅拌 ;每漂洗一次 ,更换去离子水 。
7. 4. 6 封闭:将固定的基片放入盛有 0. 2%NaBH4 封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗 5 min,关闭磁力搅拌器 ,静置 5 min,再磁力搅拌漂洗 5 min;最后用去离子水磁力搅拌漂洗 3 次 ,每次 2 min。
7. 4. 7 质检:基片置 15 mL离心管中 ,2 000 r/min离心 2 min除去水分 ;用芯片扫锚仪对基片进行预扫描质检 ,质检合格后芯片避光冷藏保存 。
注 : 基片表面无残余固定剂 ,探针阵列完整 ,定位点清晰的为合格的芯片 。
7. 5 荧光标记 PCR
荧光标记 PCR反应在常规 PCR仪上进行 ,引物 P3 和 P5 序列见 C. 1,标记 PCR 反应体系见 C. 2。扩增条件 :94 ℃ 90s;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s,30个循环;72℃ 5 min。待测样品模板 DNA 和实蝇阳性质粒平行进行荧光标记 PCR, 阳性质粒基因序列见 C. 3。
注 : 阳性质粒是一段人工合成的 DNA片段 ,其 5’端和 3’端核苷酸序列分别为引物 P3 和 P5 的互补链 。
7. 6 杂交反应
7. 6. 1 杂交液预热
10×SSPE芯片杂交液在水浴锅中预热至 50 ℃ 。
7. 6. 2 变性
分别取杂交液 10μL和 PCR产物 10μL(实蝇模板扩增产物 8 μL和阳性质粒扩增产物 2 μL)到一个灭菌的 50 μL离心管中 ,涡旋混匀 ,在 PCR仪上 95 ℃变性 5 min。
7. 6. 3 杂交
盖上芯片盖片 ,取变性后的产物 20μL加入点样区 ,芯片用锡箔纸包装 ,置湿盒中在烘箱 46℃避光杂交 3 h。
7. 6. 4 清洗
杂交后的芯片依次在 42 ℃预热的洗液 Ⅰ 、洗液 Ⅱ 中磁力搅拌清洗 2 min。
7. 6. 5 离心
芯片置 15 mL离心管中 ,2 000 r/min离心 2 min除去水分 。
7. 7 芯片扫描
杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区 532 nm 处进行扫描 ,PMT 值设为 800。通过扫描仪软件获得所有探针阵列的荧光数据 。
注 : 芯片扫描结果存入计算机 ,扫描后芯片避光室温保存 。
3
GB/T 28065—2011
7. 8 结果判读
芯片杂交信号判读原则见附录 D。在质控探针和定位点探针杂交信号正常的情况下 ,检测探针杂交信号满足以下情况判定为地中海实蝇 :
— 实蝇科探针(teph)杂交信号阳性 ;
— 地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针(caro)杂交信号阳性 ;
— 地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针(caco)杂交信号阳性 ;
— 地中海实蝇特异探针(ccca)杂交信号阳性 。
4
GB/T 28065—2011
附 录 A
(规范性附录)
地中海实蝇生物芯片检测探针、质控探针及探针阵列
A. 1 地中海实蝇生物芯片检测探针见表 A. 1。
表 A. 1 地中海实蝇生物芯片检测探针
探针类型
探针名称
探针序列(5’-3’)
特异性说明
科通用探针
teph
AGCAAAGACTGCTCCTATTGATAAT
实蝇科通用探针
近缘种特异探针
caco
ATAGCTGGGGAATAATTTAATTG
地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针
近缘种特异探针
caro
CGTTAAACCTCCAACTGTAAA
地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针
种特异探针
ccca
AGAACAACGCCCGTTAAACC
地中海实蝇特异探针
种特异探针
ccco
CTGTTAAACCCCCAACTGTGA
非洲芒果实蝇特异探针
种特异探针
cpro
ACATAATGGAAGTGTGCTACAAC
纳塔尔实蝇特异探针
A. 2 地中海实蝇生物芯片检测质控探针见表 A. 2。
表 A. 2 地中海实蝇生物芯片检测质控探针
类型
代码
序列(5’-3’)
长度
nt
定位点探针
A
TGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC
28
阳性对照探针
P
TGAGACCAACCAACTGAAACG
21
阴性对照探针
N
GACTATAGTATAAGCGCGGTCCA
23
空白对照a
B
—
—
a 空白对照为水对照 。
5
GB/T 28065—2011
附 录 B
(资料性附录)
芯片检测探针点阵图及在基片上布局示意图
B. 1 地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图见图 B. 1。
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
teph
teph
teph
A
caco
caco
caco
caro
caro
caro
A
ccca
ccca
ccca
ccco
ccco
ccco
cpro
cpro
cpro
A
P
P
P
N
N
N
B
B
B
图 B. 1 地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图
B. 2 探针点阵在基片上布局示意图见图 B. 2。
单位为毫米
说明 :
每张基片有四个探针点阵(小正方形区域) 。
图 B. 2 探针点阵在基片上布局示意图
6
GB/T 28065—2011
附 录 C
(规范性附录)
荧光标记 PCR 引物、反应体系和阳性质粒序列
C. 1 地中海实蝇生物芯片检测荧光标记 PCR 引物(李文芬等 2008)见表 C. 1。
表 C. 1 地中海实蝇生物芯片检测荧光标记 PCR 引物
引物名称
引物序列(5’-3’)
长度
nt
正/反向
来源基因
P3
TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGG
27
正向
COI
P5
CTGGAGGGGTATTTTGAAGTCATT
24
反向
C. 2 荧光标记 PCR反应体系见表 C. 2。
表 C. 2 荧光标记 PCR反应体系见表
试剂名称
PCR反应体系终浓度
杂交信号阳性参考体系a
10×缓冲液(Mg2+ )
1. 5 mmol/L
1. 0 μL
dNTPb
0. 2 mmol/L
0. 2 μL
正向引物 P3
0. 2 mmol/L
0. 2 μL
反向引物 P5
0. 2 mmol/L
0. 2 μL
Taq酶
1 U
0. 15 μL
DNA模板或阳性质粒
10 ng~ 20 ng
0. 5 μL
去离子水
补足反应总体积到 10 μL
7. 75 μL
a 反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整 。
b dNTP配方(以 10 μL为例) :dATP 1 μL, dCTP 1 μL, dGTP 1 μL, dTTP 0. 65μL, 1mM CY3-dCTP 3. 5 μL,去离子水 2. 85 μL。
C. 3 实蝇芯片阳性质粒序列(扩增长度 :235 bp)
TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGGCACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATAT TCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAG AGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAA TAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTGAATGACTTCAAAATACCCCTCCAG
注 : 实蝇芯片阳性质粒载体为 T载体 。
GB/T28065—2011
GB T 28065 2011
— /
附 录 D
(规范性附录)
杂交信号阳性结果判读原则
D. 2 空白对照平均信号值= 3个空白对照点信号值的平均值 。
D. 1 每个检测点信号值=该点荧光强度值 -该点背景强度值 。
D. 3 阴性对照平均信号值= 3个阴性对照点信号值的平均值 -空白对照平均信号值 。
D. 4 每条探针的每个检测点信号值 -空白对照平均信号值 >3倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性 。
D. 5 每条探针的 3个重复检测点平均值为阳性即判读该条探针杂交结果为阳性 。
D. 6 如定位探针部分或全部为阴性 ,则表明探针与片基结合有问题 ,实验结果不准确 ,重做试验 。
D. 7 如阳性对照为阴性 ,则表明扩增标记环节或杂交环节存在问题 ,实验结果不准确 ,重做试验 。
