GB/T 28064-2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28064—2011

　　蚕豆染色病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofbroadbean stain virus

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28064—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 : 陈红运 、陈青 、林石明 、郑耘 、赵文军 、李一农 、廖富荣 、余芳平 、朱水芳 、陈枝楠 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28064—2011

　　蚕豆染色病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法 。

　　本标准 适 用 于 蚕 豆 Viciafaba、小 扁豆 Lensculinaris、豌 豆 Pisum sativum 和 菜 豆 Phaseolus vulgaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 蚕豆染色病毒基本信息

　　中文名 :蚕豆染色病毒 。

　　学名 :broad bean stain virus。

　　缩写 :BBSV。

　　属豇豆花叶病毒科 Comoviridae;豇豆花叶病毒属 Comovirus。

　　病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子 ;远距离通过种子传播 ,种传寄主有蚕豆(种传率 4% ~ 16%) 、豌豆(20%)和小扁豆(0. 2% ~ 32. 4%) 。BBSV 易机械接种传播 ,并可通过甲虫传毒 , 豆长喙象甲 Apionvorax 是最主要的传毒介体 。

　　蚕豆染色病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　主要根据 BBSV 的血清学特性和基因组特征进行鉴定 ,生物学测定为辅助鉴定手段 。

　　5 仪器、设施及试剂

　　5. 1 仪器与设施

　　酶联检测仪 、电子天平(感量 0. 000 1 g) 、定性 PCR 仪 、电泳仪 、电泳槽 、紫外透射仪 、恒温水浴 、低温冰箱 、普通冰箱 、离心机等 ;微量移液器(2. 5 μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL) ;酶联板 、研钵等 ; 防虫温室 。

　　5. 2 试剂

　　酶联免疫吸附测定试剂(见附录 B) 、RT-PCR检测试剂(见附录 C) 。

　　1

　　GB/T 28064—2011

　　6 检测与鉴定

　　6. 1 抽样

　　按照 SN/T 2122的规定执行 。

　　6. 2 制样

　　选取种皮呈 BBSV 为害症状的可疑病粒 ,无可疑病粒时随机选取 。 用无菌水浸种 16 h,磁盘中放入两层吸满水的滤纸 ,将充分吸水的种子摆放在滤纸上 ,20 ℃催芽 ,芽长 2 cm~4 cm 时取芽进行检测 。检测方法见 6. 3。

　　注 : 资源性引种时 ,每份资源选 10粒 ~ 14粒种子播种于防 虫 温 室 或 网 室 内 ,待 长 出 4 片 ~ 6 片 叶 时 挑 选 有 病 毒 症状植株的叶片进行检测 。

　　6. 3 检测

　　6. 3. 1 酶联免疫吸附测定

　　双抗体夹心法见附录 B。

　　6. 3. 2 RT-PCR检测

　　称取 0. 1 g 植 物 组 织 提 取 总 RNA, 沉 淀 充 分 干 燥 后 溶 于 30 μL DEPC 处 理 的 去 离 子 水 中 。 RT-PCR 检测方法见附录 C。

　　6. 3. 3 生物学测定

　　生物学测定参见附录 D。

　　7 结果判定与记录

　　7. 1 结果判定

　　酶联测定为阳性后 ,RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录 D 描述不符合 ,判定未检出蚕豆染色病毒 。

　　酶联测定为阳性后 ,RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录 D 描述相符合 ,判定检出蚕豆染色病毒 。

　　直接对样品进行 RT-PCR检测时 ,检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒 。

　　7. 2 结果记录

　　记录包括 :样品来源 、种类 、取样人员 、原始记录和检测结果等 。酶联测定应有酶联板反应的原始数据 ,RT-PCR检测应有电泳结果图片 ,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 。

　　8 样品保存

　　经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存 ,种子保存在 4 ℃ ,病株在 -20℃或者 -80℃冰箱中保存 ,做好标记和登记工作 。

　　2

　　GB/T 28064—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状

　　A. 1 寄主范围

　　BBSV侵染 7种豆科植物 :美丽猪屎豆(Crotalariaspectabilis) 、毛羽扇豆(Lupinushirsutus) 、白花草木犀(Melilotusalba) 、菜豆 、豌豆 、绛车轴草(Trifolium incarnatum)和蚕豆 。

　　A. 2 病害症状

　　A. 2. 1 蚕豆

　　蚕豆感染 BBSV后 ,症状分为花叶型和坏死型 。 花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑 ,新叶均呈褪绿条纹状 、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状 ;坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局部斑 , 叶脉和茎出现坏死条纹 ,最后茎坏死 、顶枯 、全株萎蔫 。种子表皮出现褐色坏死色斑 。

　　A. 2. 2 豌豆

　　豌豆感染 BBSV后 ,症状分为花叶型 、顶枯型和花叶 、顶枯混合型 。花叶型先在新叶出现系统褪绿点 ,后发展为花叶 、畸形 ;顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹 ,后顶梢枯死 。

　　A. 2. 3 菜豆

　　豌豆感染 BBSV后 ,症状分为局部斑和系统斑 。局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部褪绿斑而后病斑中心坏死 ,系统斑不但在接种叶上有坏死斑 ,新生叶还出现系统枯斑 。

　　A. 2. 4 小扁豆

　　小扁豆感染 BBSV后 ,症状不明显或很长时间才有症状反应 ,有些品种出现死株 ,有些品种接种后25 d才见新叶上出现不明显花叶 。 因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主 。

　　A. 3 分布地区

　　英国 、法国 、德国 、瑞典 、捷克 、奥地利 、波兰 、匈牙利 、意大利 、叙利亚 、黎巴嫩 、苏丹 、摩洛哥 、埃及和突尼斯等欧洲 、西亚和北非国家 。

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　　GB/T 28064—2011

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　B. 1 试材

　　B. 1. 1 酶联板 。

　　B. 1. 2 包被抗体 :特异性的蚕豆染色病毒抗体 。

　　B. 1. 3 酶标抗体 :碱性磷酸酯酶标记的蚕豆染色病毒抗体 。

　　B. 1. 4 底物 :对硝基苯磷酸二钠(ρNPP) 。

　　B. 1. 5 PBST缓冲液(洗涤缓冲液 pH7. 4) NaCl 8. 0 g

　　Na2 HPO4 1. 15 g

　　KH2PO4 0. 2 g

　　KCl 0. 2 g

　　Tween-20 0. 5 mL

　　蒸馏水定容至 1 L。

　　B. 1. 6 样品抽提缓冲液(pH7. 4)

　　Na2SO3 1. 3 g

　　PVP(MW24000~40000) 20. 0 g

　　NaN3 0. 2 g

　　PBST定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1. 7 包被缓冲液(pH9. 6)

　　Na2CO3 1. 59 g

　　NaHCO3 2. 93 g

　　NaN3 0. 2 g

　　蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1. 8 酶标抗体稀释缓冲液(pH7. 4)

　　BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉 2. 0 g

　　PVP (MW24000~40000) 20. 0 g

　　NaN3 0. 2 g

　　PBST定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1. 9 底物(ρNPP)缓冲液(pH9. 8)

　　MgCl2 0. 1 g

　　NaN3 0. 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,用 HCl调 pH值至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L。4 ℃储存 。

　　B. 2 程序

　　B. 2. 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按说明稀释 ,加入酶联板的孔中 , 100 μL/孔 , 37 ℃孵育 2 h, 清空孔中溶液 , PBST洗涤 3 次 。

　　4

　　GB/T 28064—2011

　　B. 2. 2 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入抽提缓冲液 ,用研钵研磨成浆 ,7 500g离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。 阴性对照 、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 ; 空白对照为样品抽提缓冲液 。

　　B. 2. 3 加样

　　根据检测需要设计 96孔(或 48孔)酶联板 ,包括 2个阴性对照孔 、2个阳性对照孔 、2个空白对照孔和多个待测样品孔 。加样量为 100 μL/孔 ,每个样品设 1 个重复 。 4 ℃冰箱孵育过夜 ,酶联板用 PBST洗涤 3 次 。

　　B. 2. 4 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度 ,并加入到酶联板中 , 100 μL/孔 , 37 ℃孵育 4 h,PBST洗涤 3 次 。

　　B. 2. 5 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100μL/孔 ,加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B. 2. 6 读数

　　用酶标仪在 30 min、1 h 和 2 h 于 405 nm 处读 OD值 。

　　注 : 实际检测时 ,PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 。

　　B. 3 结果判断

　　B. 3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15;

　　阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >2;

　　同一样品的 OD405值应基本一致 。

　　B. 3. 2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果原则上可判断如下 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值接近阈值 ,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 。

　　B. 3. 3 若满足不了 B. 3. 1 质量要求 ,则不能进行结果判断 。

　　注 : 质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 。

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　　GB/T 28064—2011

　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 TrizoL裂解液 。

　　C. 1. 2 三氯甲烷 。

　　C. 1. 3 异丙醇 。

　　C. 1. 4 75%乙醇 。

　　C. 1. 5 去离子水(DEPC处理) 。

　　C. 1. 6 50×TAE

　　Tris 242 g

　　冰醋酸 52. 1 mL

　　Na2EDTA · 2H2 O 37. 2 g

　　加去离子水定容至 1 L。用时加水稀释至 1×TAE。

　　C. 1. 7 6×加样缓冲液

　　0. 25%溴酚蓝

　　40%(质量浓度)蔗糖水溶液

　　C. 2 实验步骤

　　C. 2. 1 总 RNA提取

　　称取 0. 1 g植物组织加液氮研磨成粉末状 ,迅速将其移入灭菌的 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL 的TrizoL试剂 ,剧烈振荡摇匀后室温保持 5 min;4℃ ,12000g离心 10min,取上清液 ;加入 0. 2 mL三氯甲烷并剧烈振荡混匀;4 ℃ ,12 000g离心 10min,取上清液 ;加 0. 6倍体积的异丙醇 ,颠倒混匀 ,室温保持 5 min;4℃ ,12000g离心 10min,弃上清液 ;加 75%的乙醇洗涤沉淀 ,4 ℃ ,7500g离心 2 min,弃乙醇 ;沉淀于室温下充分干燥后 ,溶于 30 μL去离子水(DEPC处理)中 , -20 ℃保存备用 。也可采用等效的试剂盒提取总 RNA。

　　C. 2. 2 RT-PCR反应

　　RT-PCR检测引物见表 C. 1。cDNA 的合成 :在 0. 2 mL反应管中 ,加入总 RNA 6 μL,1 μL下游引物(20 μmol/L) ,去离子水 4 μL,10 mmol/LdNTPs1 μL,65 ℃水浴 5 min,取出后立即放在冰上 ,加入5×FirstStrand Buffer 4 μL,40 U/μL RNase Block Ribonuclease Inhibitor1 μL,0. 1 mol/L DTT 2 μL, 42 ℃水浴 2 min,然后再加入 200U/μLReverseTranscriptase1 μL,混匀后 42℃水浴 50min,70℃水浴 15min,合成 cDNA。FirstStrand Buffer和 ReverseTranscriptase的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整 。也可采用一步法 RT-PCR试剂盒进行扩增 。

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　　GB/T 28064—2011

　　表 C. 1 RT-PCR检测的引物

　　检测基因

　　引物序列(5’-3’)

　　小外壳蛋白(SCP)

　　上游引物

　　TggCAA gTCACA gTT CgC

　　下游引物

　　CgCCTC TTT ggT TTCACg

　　PCR反应体系见表 C. 2。反 应 参 数 : 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 35个 循 环 ; 72 ℃ 7 min。

　　表 C. 2 PCR反应体系

　　10×PCR Buffer(MgCl2 plus)

　　2. 5

　　上游引物(20 μmol/L)

　　0. 5

　　下游引物(20 μmol/L)

　　0. 5

　　Taq酶(5U/μL)

　　0. 2

　　cDNA模板

　　2. 0

　　去离子水

　　补足反应总体积为 25 μL

　　C. 2. 3 电泳

　　C. 2. 3. 1 制备凝胶

　　配制 1. 5%(质量 ∶浓度)的琼脂糖凝胶 。溴化乙锭可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为 0. 5 μg/mL) ,也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色 。

　　C. 2. 3. 2 电泳

　　用 1 μL6×加样缓冲液与 5 μL样品混合 ,然后将其和适合的 DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中 。 电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察 ,拍照并保留结果 。

　　C. 3 结果判断

　　C. 3. 1 阳性对照在 499bp处有扩增片段 , 阴性对照和空白对照无特异性扩增 ,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 ,可判定为阳性 。

　　C. 3. 2 阳性对照 、阴性对照和空白对照结果正确 ,且样品在 499bp处无扩增条带 ,判定结果为阴性 。

　　GB/T28064—2011

　　GB T 28064 2011

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　生物学测定

　　D. 1 接种

　　病叶加 1 ∶ 1(质量 ∶ 体积) 的磷酸盐缓冲液(0. 01 mol/L,pH7. 2) 于研钵中充分研碎 ,在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土 ,用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面 。

　　D. 2 寄主症状

　　D. 2. 1 鉴别寄主(diagnosticspecies)

　　菜豆:品种 Tendergreen和 Canadian Wonder表现褪绿局部斑和系统褪绿花叶 。 品种 Prince仅为局部侵染 ,BBSV不能侵染品种 Pinto、Idaho Refugee、Blue Lake和 Tendercrop。

　　豌豆 :BBSV可侵染所有品种 ,产生系统褪绿斑驳症状 ,在冷凉气候下茎和叶片出现坏死 。

　　蚕豆 :BBSV侵染品种 “成胡 10号 ”后表现花叶型 , 即接种叶片上有或无局部斑 ,新叶均呈褪绿条纹状 、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状 。

　　BBSV不能 侵 染 苋 色 藜 (Chenopodium amaranticolor) , 千 日 红 (Gomphrena globosa, 普 通 烟(Nicotianatabacum)和克利夫兰烟(N. clevelandii) 。

　　D. 2. 2 繁殖寄主(propagation species)

　　豌豆品种 Onward,菜豆品种 Tendergreen和蚕豆品种“成胡 10号 ”。

　　D. 2. 3 试验寄主(assay species)

　　BBSV在菜豆品种 Tendergreen上引起局部斑 ,在蚕豆上表现系统侵染 。