GB/T 28066-2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28066—2011

　　丁香假单胞杆菌豌豆致病型

　　检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPseudomonassyringae

　　pv. pisi(Sackett) Young etal.

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28066—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271) 提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中 华 人 民 共 和 国 厦 门 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 上 海 出 入 境 检 验 检疫局 。

　　本标准主要起草人 :林石明 、黄蓬英 、易建平 、陈青 、廖富荣 、吴媛 、陈红运 、王宏毅 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28066—2011

　　丁香假单胞杆菌豌豆致病型

　　检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学 、血清学及分子生物学的检测鉴定方法 。

　　本标准适用于植物种子 、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定 。

　　2 丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息

　　中文名 :丁香假单胞杆菌豌豆致病型 。

　　中文别名 :豌豆(细菌性) 枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌 、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等 。

　　学名 :PseudomonassyringaeVan Hall,1902pv. pisi(Sackett,1916) Young,Dyeand Wilkie,1978。

　　病害英文名 :bactrialblightof pea。

　　异名 :Bacteiumpisi(Sackett) Smith,1920;Chlorobacterpisi (Sackett) Patel & Kulkarni, 1951; Pseudomonas pisi Sackett, 1916; Pseudomonas syringae Van Hall, 1902; Pytomonas ( Sackett) Bergey,etal. ,1923。

　　属原核生物界 Procaryotes,变形细菌门 Proteobacteria,γ-变形细菌纲 Gammaproteobacteria,假单胞杆菌目 Pseudomonadales,假单胞杆菌科 Pseudomonadaceae,假单胞杆菌属 Pseudomonas。

　　丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　依据病菌在培养基上生长的菌落形态 、碳源的利用情况 、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 、基于体外 DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PCR) , 以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定 。

　　4 主要试剂

　　本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂 :

　　硫酸镁 、磷酸氢二钾 、蔗糖 、甘油 、硼酸 、氯化镁 、蛋白胨 、生理盐水 、三氯甲烷 、异戊醇 、异丙醇 、Tris-盐酸 、EDTA、SDS(十二烷基硫酸钠) 、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺) 、溴化乙锭 、头孢氨苄 、万古霉素 、头孢呋辛酸 、溴酚蓝 、放线(菌) 酮或制霉菌素和 PCR相关试剂 。

　　5 主要仪器

　　本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器 :

　　超净工作 台 、高 压 灭 菌 锅 、显 微 镜 、培 养 箱 、电 子 天 平 、离 心 机 、PCR 仪 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系 统 、 BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪 。

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　　6 病菌分离

　　6. 1 种子样品的制备

　　检查皱缩种子和其他为害状的种子 。每份种子检测样品至少检测 2 000粒种子 。将种子倒入 5 L桶内 ,加 3 L无菌水 ,搅拌 ,用无菌(新) 的塑料袋严密封盖 ,4 ℃下静置 16h~ 18h或过夜 ;去掉塑料袋 ,充分搅拌 。取种子浸出液 10 mL,用 15 000g离心 5 min,用蒸馏水分 2 次(每次 1 mL) 洗下沉淀物 ,制成种子浸出液 , 以备分离培养 。

　　6. 2 种子中病菌的分离培养

　　取 100 μL的种子浸出液涂布于 P3和(或) S4培养基平板上(培养基配制见附录 B) 。 每个样品设3个 ~ 10个重复 ,无菌水作为空白对照 。

　　在 25 ℃ ±2 ℃下黑暗中培养 ,3 d后开始观察 。

　　如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表 1) ,则将菌落转移至 KB平板上划线培养 1 d~ 2 d进行纯化(培养基配制见附录 B) ,纯化 3 次后进行生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR等方法鉴定 。

　　表 1 培养基上的菌落特征

　　P3培养基

　　S4培养基

　　Pspi的菌落扁平状 , 白色 、透明 ,边缘不规则

　　Pspi的菌落较大 ,半球形 , 白色 ,边缘整齐

　　多数菌株有蓝色荧光

　　—

　　6. 3 植物组织中病菌的分离培养

　　仔细检查植物叶片 、豆荚等组织的症状(参见图 A. 1) ,用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块 ,加一滴无菌水 ,置于载玻片上 ,盖上盖玻片后在显微镜下观察 。如果观察到细菌的菌脓 ,则进行分离培养 。

　　选择新鲜症状的叶片 、豆荚等组织 ,切取病斑前沿部分 2 mm~ 7 mm 的组织 ,用 70%酒精表面消毒 15 s,无菌水洗 2 次 ~ 3 次 ,在 S4和(或) P3培养基平板上划线分离 。

　　在 25 ℃ ±2 ℃下黑暗中培养 3 d后 ,开始观察 。

　　如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表 1) ,则将菌落转移至 KB平板上培养 1 d~ 2 d 进行纯化 ,纯化 3 次后进行生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR等方法鉴定 。

　　7 病菌鉴定

　　7. 1 生化鉴定

　　采用 BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定 。

　　7. 2 DAS-ELISA 方法

　　将可疑菌落配制成 104 CFU/mL 悬 浮 液 , 取 100 μL悬 浮 液 作 为 检 测 样 品 。 每 个 检 测 样 品 重 复一次 。用已知菌株作阳性对照 ,用缓冲液作空白对照 。

　　具体操作步骤见附录 C。

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　　7. 3 PCR方法

　　将可疑菌落制备成 108 CFU/mL 的细菌悬浮液 ,进行 PCR扩增 。或者把可疑菌落接种到 NB培养基中(培养基配制见附录 B) ,25 ℃ ± 2 ℃下振荡培养过夜 , 离心后提取沉淀的 DNA,进行 PCR 扩增 。用已知菌株作阳性对照 ,用无菌水作空白对照 。

　　具体操作步骤见附录 D。

　　7. 4 致病性测试

　　如果生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性 ,则进行致病性测试以确认鉴定结果 。

　　将豌豆种子播种于小盆钵中 ,待长出 2 片 ~ 3 片真叶的小苗 。 取在 KB培养基上培养 24 h~ 48 h的菌落 , 用 消 毒 的 昆 虫 针 蘸 取 菌 落 , 在 最 为 幼 嫩 的 秸 秆 处 进 行 刺 伤 接 种 。 每 个 菌 落 接 种 5 株 小 苗 。 5 d~ 7 d后 ,观察是否产生致病性 。如果出现扩展型的水渍状病斑 ,则有致病性 ;反之 ,则没有致病性 。

　　注 : 有些 Pspi的菌株在接种 1 d~ 2 d后 ,就引起小苗倒伏 。

　　8 结果判定与检测报告

　　8. 1 结果判定

　　8. 1. 1 未分离到可疑菌落

　　如果经 S4或 P3培养基分离培养 ,7 d后仍未产生可疑菌落 ,则未检出 Pspi。

　　8. 1. 2 分离到可疑菌落

　　分离培养后的可疑菌落 ,应经生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR方法检测 ,并通过致病性测试的确认 。

　　— 如果生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性 ,致病性测试也产生典型症状 ,则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型 ;

　　— 如果生化鉴定 、DAS-ELISA检测或 PCR 的结果为阴性 ,则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型 ;

　　— 如果生化鉴定 、DAS-ELISA或 PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性 ,而致病性测试为阴性 ,则应重新进行致病性测试 。致病性重新测试后 ,如果仍然未产生典型症状 ,则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型 。

　　8. 2 检测报告

　　检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据 ,包括 DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告 、菌落形态特征照片 、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　丁香假单胞杆菌豌豆致病型相关资料

　　A. 1 寄主植物

　　自然寄主 :豌豆(Pisum sativum) 、扁 豆(Dolichoslablab) 、香 豌 豆(Lathyrusodoratus) 和 野 豌 豆(Vicia sepium,V. benghlensis) 等 。

　　接种寄主 :天蓝苜蓿(Medicagolupulina) 、豇豆(V. unguiculata) 和菜豆(Phaseolusvulgaris) 等 。

　　A. 2 传播途径

　　病菌通过种子进行远距离传播 。病菌在种子表面或种子内部至少存活 10个月 ,在田间病残体上存活几个月 ,在干燥的种子上可以保持活性 3 年以上 。 即使只有 0. 01%的种子带菌率 ,也会引起病害发生 ,产生严重为害 。

　　病残体也是侵染源 。在大田 ,病菌通过雨水的飞溅 、风和人工或机械传带而扩散 。

　　A. 3 症状特征

　　豌豆植株所有的地上部分均会产生症状 ,包括叶柄 、复叶 、托叶 、茎 、卷须 、花芽和豆荚 ,其中在茎秆和托叶上的症状最为明显 。发病严重的田块颗粒无收 ,一般损失在 20%以下 。

　　在干燥且偶有霜冻的天气条件下 ,症状通常出现在土表的茎部 ,其上形成水渍状病斑 ,后期呈橄榄色至紫褐色 。病斑向上发展 ,侵染复叶和托叶 ,使叶脉变成褐色至黑色 ,周围组织发病形成扇形图案 ,脉间组织变成水渍状 ,并逐渐变黄色至褐色 ,最后叶片干枯呈纸质状 。

　　在多雨的条件 ,复叶和豆荚上会出现病斑 ,初期为圆形或卵圆形或不规则的水渍状小斑点 ,呈暗绿色 ;斑点扩大后相互融合成较大的病斑 ,但是只限于脉间 。在病斑表面可能出现乳白色的菌脓 , 干燥后有亮光 。

　　在叶片和托叶上 ,最初症状为小的 、暗绿色水渍状病斑 。病斑经常扩展并融合 ,但是均会受到叶脉的限制 。在小叶上 ,病斑发黄 ,后变褐色 ,而呈薄纸状 。复叶后期变黄 ,病斑呈褐色纸状 。

　　茎秆上的病斑向托叶和小叶扩展 ,在托叶上产生伞形病斑 。受侵染的叶脉变黑褐色 , 叶片组织变成黄色至褐色 ,干枯后变薄纸状结构 。茎秆上的病斑可能融合 ,引起萎缩死亡 。

　　在果荚上 ,病斑凹陷 ,橄榄褐色 ;在近土表的茎秆上也会产生病斑 ,最初病斑呈水渍状 , 而后变榄绿色至暗褐色 。发病的豆荚成熟后扭曲 ,病斑下陷 ,呈暗绿色 。 豆荚上的病斑只限于缝隙处的一条窄带 。发病的种子在种脐周围形成水渍状的斑点 ,或呈皱缩状 ,褐黄色 。

　　出苗前后可发生瘁倒 ,而后植株死亡 。严重者种子变色 ,但多数种子表面没有明显症状 。

　　一般只在潮湿的季节或受霜害之后才发生该病害 。在潮湿 、雨后或重露水的生长季节 ,易于侵染 ;潮湿季节发病最重 。大降雨加上雨水或重露水极其有利于病菌的扩散 。受霜冻或大雨损害的植株最容易发病 。Pseudomonassyringaepv. pisi和 Pseudomonassyringaepv. syringae所产生的症状相似 ,难于区别 。

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　　GB/T 28066—2011

　　图 A. 1 豌豆细菌性枯萎病的症状

　　A. 4 地理分布

　　非洲 :马拉维 、肯尼亚 、摩洛哥 、南非 、坦桑尼亚 、津巴布韦等 。

　　美洲 : 巴西 、百慕大 、加拿大 、墨西哥 、美国 、阿根廷 、乌拉圭等 。

　　亚洲 : 印度尼西亚 、以色列 、日本 、黎巴嫩 、尼泊尔 、叙利亚 、印度等 。

　　欧洲 :保加利亚 、丹麦 、英国 、法国 、德国 、希腊 、荷兰 、匈牙利 、意大利 、罗马尼亚 、瑞士等 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、新西兰等 。

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　　附 录 B (规范性附录)培养基的配制

　　B. 1 KB培养基(改良 KB培养基 ,King,etal. , 1954)

　　称取以下试剂 :3号朊蛋白胨 20. 0 g、磷酸氢二钾(K2 HPO4 ) 1. 5 g、硫酸镁(MgSO4 · 7H2 O) 1. 5 g、甘油 15. 0 mL、琼脂 15. 0 g,倒入适宜的容器内 ,加 1 000 mL蒸馏水 ,溶解所有的试剂 。在 121 ℃下湿热灭菌 15 min;冷却至 45 ℃ ~ 50 ℃后 ,加入头孢氨苄(Cephalexin) 50mg(溶解于 75%的酒精中 ,配制成 25×10-6浓度) ;缓慢地倒入培养皿内(每个直径 9 cm 的培养皿 20 mL) ,避免产生气泡 。

　　培养基在超净工作台凝固后直接使用 ,或者反扣过来装入塑料袋中 ,在 4 ℃下保存 。最长的保存时间是 2周 ~ 3周 ,否则抗生素会失效 。

　　B. 2 S4培养基

　　称取蔗糖 50 g、硼 酸 1. 5 g 和 琼 脂 15. 0 g,溶 解 于 1 000 mL 的 蒸 馏 水 中 , 在 121 ℃下 湿 热 灭 菌15 min,冷却至 50 ℃加入制霉菌素(Nystatine) 或放线菌酮(溶解于 30 mL 70%酒精中配制成母液) 。

　　B. 3 P3培养基

　　称取甘油 10g、硼酸 1. 5 g 和 PseudomonasF琼脂 38g,溶解于 1000mL 的蒸馏水中 ,在 121℃下湿热灭菌 15 min,冷却至 50 ℃加入制霉菌素(Nystatine) 或放线菌酮(溶解于 30 mL 的 70%酒精中) 。

　　B. 4 NB(NutrientBroth) 培养基

　　蛋白胨 5. 0 g,牛肉浸膏 3. 0 g,蒸馏水 1 000 mL,121 ℃湿热灭菌 15 min。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　DAS-ELISA 方法

　　C. 1 包被

　　用碳酸钠缓冲液稀释抗体溶液(如 1 ∶ 200) ,在微孔板中每孔加入 100 μL包被抗体溶液 。在室温下孵育 2 h~4 h或 4 ℃下包被过夜 。

　　C. 2 捕获抗原

　　倒去孔中的抗体包被溶液 ,用 PBS-Tween洗 4次 ~ 5 次孔(或在洗板机上完成) 。加入菌悬液或样品提取液到酶标板的孔中 ,每孔 100 μL,每个样品 2 个孔(重复 1 次) 。并设置阳性和阴性对照 。 在室温下孵育 2 h或 4 ℃下过夜 。

　　C. 3 加入酶标抗体

　　根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如 1 ∶ 200) 。倒去孔中的样品提取液 , 用 PBS- Tween洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 。在室温下孵育 2 h。

　　C. 4 加底物

　　用二乙醇胺缓冲液(pH9. 8) 配制 1 mg/mL 的对硝基苯磷酸酯的底物溶液 。倒去酶标抗体溶液 ,用PBS-Tween洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。每孔加入 100 μL新鲜配制的底物溶液 。 室温下避光放置 ,直至阳性对照孔明显显色(约 30 min~ 60 min) 。

　　C. 5 读数

　　用酶标仪在 405 nm 处读吸光值 。

　　C. 6 结果判定

　　C. 6. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　— 缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15;

　　— 阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >2;

　　— 同一样品的 OD405值应基本一致 。

　　C. 6. 2 在满足了 C. 6. 1 质量要求后 ,结果原则上可判断如下 :

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显 >2,判为阳性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显<2,判为阴性 。

　　C. 6. 3 若满足不了 C. 6. 1 质量要求 ,则不能进行结果判断 。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　PCR方法

　　D. 1 PCR模板的制备

　　D. 1. 1 菌悬液 PCR模板的制备

　　取 3 μL的 108 CFU/mL(OD600 =0. 1) 的菌体悬浮液 ,转入装有 100μL无菌双蒸水的 1. 5 μL离心管中 ,在 99 ℃水浴 10 min,10 000g离心 10 min,冷却后 ,取上清液作为 PCR反应模板 。

　　D. 1. 2 DNA 的提取

　　取 1 mL在 NB培 养 基 中 振 荡 培 养 过 夜 的 菌 液 , 10 000 g 离 心 2 min, 提 取 沉 淀 的 DNA;或 者 取0. 1 g 的发病植物组织 ,研磨后 ,提取植物总 DNA。提取步骤根据商用试剂盒说明进行 。

　　D. 2 引物序列

　　用于检测 Pspi的特异性引物及其序列见表 D. 1,经合成纯化后 ,冻干备用 。

　　表 D. 1 用于 PCR扩增的引物及其序列

　　引 物 名 称

　　引 物 序 列

　　扩 增 产 物

　　EFEP1

　　5’-ACGCTGGGATGTTACTTG-3’

　　303 bp

　　EFEP2

　　5’-GCCTGTTCAAAACGTGTG-3’

　　D. 3 PCR反应

　　50μL反应体系中加入 :10×PCR缓冲液(含 MgCl2 ) 5. 0 μL,10 mmol/L的 dNTP混合物1. 0 μL, TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0. 5 μL,10μmol/L的上下引物各 2. 0 μL,DNA模板 2 μL,去离子水补足至50 μL。

　　在 PCR仪上完成以下程序 :95 ℃预变性 3 min;然后 94 ℃变性 1 min、60 ℃退火 1 min、72 ℃延伸1 min,共 30个循环 ;最后在 72 ℃下保持 10 min。

　　D. 4 电泳分析

　　取 5 μL扩增产物与 1 μL的 6×上样缓冲液混合均匀 ,在 0. 5×TBE缓冲液配制的 1. 5%琼脂糖凝胶中 ,4 V/cm~ 6 V/cm 电泳 50 min,溴化乙锭(EB) 染色后在凝胶成像系统中观察 ,拍照并保存 。

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　　D. 5 结果判定

　　在阳性对照扩增 出 预 期 大 小 的 条 带 (约 303 bp) , 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 扩 增 到 预 期 大 小 条件下 :

　　— 如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带 ,则 PCR检测结果为阳性 ;

　　— 如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带 ,则 PCR检测结果为阴性 。

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