GB/T 27640-2011 马痘诊断技术

　　ICS 11. 220 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27640—2011

　　马 痘 诊 断 技 术

　　Diagnostictechniquesforhorsepox disease

　　2011-12-30发布 2012-04-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27640—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、中国动物卫生与流行病学中心 。

　　本标准主要起草人 :梁成珠 、朱来华 、肖西志 、郑小龙 、邓明俊 、岳志芹 、毕道荣 、梁君妮 、徐彪 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27640—2011

　　马 痘 诊 断 技 术

　　1 范围

　　本标准规定了马痘临床诊断 、病毒分离与鉴定等诊断技术要求 。

　　本标准适用于马痘的诊断 。

　　2 临床检查

　　2. 1 临床特征

　　病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹 , 随后变为水疱 ,最后为脓疱 ,并干涸而结痂 。 由于局部疼痛 ,可引起跛行 ,病马一般不显全身症状 ;有的病马于唇内侧 、齿龈 、舌 、舌系带 、颊部等粘膜上发生痘疹 ,也是先发丘疹 ,继而水疱和脓疱 ,脓疱破裂形成浅的溃疡 ;母畜外生殖器水肿 ,并在皮肤和粘膜上形成水疱 、脓疱和溃疡 ,公畜的病变表现为阴茎 、包皮和龟头上的痘疹样病变 。

　　2. 2 初步判定

　　2. 2. 1 根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定 。

　　2. 2. 2 最终判定应进行病毒分离鉴定 。

　　3 病毒分离

　　3. 1 样品采集和运送要求

　　采取病变部位的渗出液 、水疱液和溃疡部位组织作为采集对象 ,尽量无菌采集 ,采集后低温送实验室进行病毒分离 。

　　3. 2 病毒分离试验

　　3. 2. 1 所需仪器、设备

　　3. 2. 1. 1 CO2 培养箱 。

　　3. 2. 1. 2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　3. 2. 1. 3 倒置显微镜 。

　　3. 2. 1. 4 带冷冻功能的离心机 。

　　3. 2. 2 材料准备

　　3. 2. 2. 1 细胞培养基 DMEM。

　　3. 2. 2. 2 Hela细胞 。

　　3. 2. 2. 3 Hanks液(Hanks液 ,见 A. 1;含抗生素 ,见 A. 4) 。

　　3. 2. 2. 4 小牛血清 。

　　3. 2. 2. 5 待检马组织 :采取病变部渗出液 、水疱液或丘疹和溃疡部组织作为标本 ,用 Hanks液配制成1 ∶ 10悬液 , 以 1500r/min离心 10min,取上清备用 。

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　　GB/T 27640—2011

　　3. 2. 2. 6 接种方法 :用含 10%小牛血清的 DMEM培养液培养 Hela细胞 ,待细胞长成单层后弃去培养液 。将 3. 2. 2. 5 中的待检组织接种 Hela细胞 ,然后加入含 5%小牛血清的 DMEM 培养液 。CO2 培养箱内 37 ℃ ,48h后观察细胞病变 。

　　3. 3 判定

　　如果 48h后出现明显的细胞病变 ,如细胞圆缩 、聚集 , 可进一步做病毒鉴定 。 正常的 Hela 细胞为多角形 ,贴壁生长 。

　　4 电子显微镜检查

　　4. 1 材料准备

　　4. 1. 1 戊二醛 , 碳 网 膜 , 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷-乙 二 胺 四 乙 酸(Tris-EDTA) , 磷 钨 酸(pH7. 2) , 滤 纸 , 载玻片 。

　　4. 1. 2 病毒液或待检病料 ,如病变部位的渗出液或水疱液 。

　　4. 2 负染操作方法

　　4. 2. 1 用戊二醛固定待检病料 。

　　4. 2. 2 负染方法为 :取一滴待检病料于载玻片上 ,将碳网膜漂浮于液滴上 1 min,再置于一滴三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液中浸泡 20s,然后用一滴 1%的磷钨酸(pH7. 2)染色 10 s。取出碳网膜 ,用滤纸吸干膜上液体 ,待自然干燥后镜检 。

　　4. 3 判定

　　电镜下见到砖形或大卵圆形 ,有一个双凹面的核心体 , 同时具有包膜 。 观察到上述结果 ,可判定为马痘感染 。

　　5 分子生物学检测

　　5. 1 材料准备

　　5. 1. 1 待检样品材料

　　分离的病毒 、病毒感染的细胞或所采集的病料 ,如病变部位的渗出液或水疱液 。

　　5. 1. 2 仪器设备

　　PCR仪 ,恒温水浴锅 , 电泳仪 ,冷冻离心机 ,凝胶成像系统或其他类似设备(观察电泳结果) ,微波炉或相关仪器(琼脂糖凝胶的制备) ,超声波破碎仪 , -20℃冰箱 。

　　5. 1. 3 试剂

　　0. 25%胰蛋白酶溶液(见 A. 2) , RNase,70%乙 醇 , TaqDNA 聚 合 酶 , PBS缓 冲 液 , 酚 三 氯 甲 烷 , 引物 ,dNTPs,去离子水 ,加样缓冲液 , 电泳缓冲液 ,溴化乙锭溶液(见 B. 3)或相关染料(现在已经有溴化乙锭的替代产品,而且无致癌性 ,如 GelRed) 。缓冲液的配方见附录 B。

　　5. 2 病毒基因组 DNA 的制备

　　用 0. 25%的胰酶消化感染病毒的 Hela细胞 ,3000r/min离心 5 min,收集的细胞沉淀用 PBS缓冲

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　　液重悬 ,于 95℃水浴灭活 30min。重复离心 ,收集沉淀 。再用 2 mL PBS缓冲液重悬细胞 。将细胞至于冰浴 ,超声波粉碎 ,输出功率为 40W ,时间 3 min,每 5 s暂停 5 s。 细胞经破碎后加入 10μL RNase, 37℃反应 30min。待溶液温度降至室温后 ,加入 400μL酚三氯甲烷 ,混匀后于冰浴中放置 5 min,然后13000r/min离心 5 min,收集 DNA沉淀 。用 70%乙醇洗沉淀一次 。空气干燥沉淀 ,加入 100μL去离子水溶解 DNA,分装保存于 -20℃冰箱中备用 。本步骤也可采取相关商品化的病毒 DNA 提取试剂盒 。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒 DNA 的提取 。

　　5. 3 痘苗病毒血细胞凝集素 HA(Hemagglutinin, HA)基因的 PCR扩增

　　5. 3. 1 引物序列

　　上游引物 :5’-ATG ACA CGA TTG CCA ATA C-3’;

　　下游引物 :5’-CTA GAC TTT GTT TTC TG-3’。

　　5. 3. 2 各反应物浓度

　　引物 25pmol/μL,dNTPs2. 5 mmol/μL,TaqDNA聚合酶 5 U/μL,反应体系为 25μL。

　　5. 3. 3 扩增条件

　　93℃ ,5 min, 92℃ ,30s;55℃ ,30 s ;72℃ ,1 min。共 35个循环 。预扩增片段大小为 940bp。

　　5. 3. 4 电泳

　　制备 1%琼脂糖凝胶板 ,加样 6 μL~ 8 μL, 电压 80V~ 100V, 电流 40 mA~ 50 mA, 电泳 30min~ 40min。

　　5. 4 马痘病毒的 PCR检测

　　5. 4. 1 引物序列

　　上游引物 :5’-GAAAATCCAGATACAGCCACC-3’;

　　下游引物 :5’-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT-3’。

　　5. 4. 2 各反应物浓度

　　引物 25pmol/μL,dNTPs2. 5 mmol/μL,TaqDNA聚合酶 5 U/μL,反应体系为 25μL。

　　5. 4. 3 扩增条件

　　93℃ ,5 min,93℃ , 30 s, 53℃ ,30s,72℃ ,30s,35个循环 。预片段大小为 637bp。

　　5. 4. 4 电泳

　　制备 1%琼脂糖凝胶板 ,加样 6 μL~ 8 μL, 电压 80V~ 100V, 电流 40 mA~ 50 mA, 电泳 30min~ 40min。

　　5. 4. 5 结果判定

　　如果不出现 940bp和 637bp大小的片段 ,判定为阴性 ;如果出现 940bp和 637bp中的任何一个片段则判定为阳性 ,并对 PCR产物进行测序 ,与参考毒株进行序列比对 。

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　　6 结果的综合判定

　　根据 2. 2,可作出初步判定 。确诊需要根据 4. 3、5. 4. 5进行最终判定 ,如果电子显微镜检查发现特征性病毒粒子可判为马痘阳性 ,否则为阴性 ;如果 PCR 检测结果为阳性 ,可判为马痘阳性 ,否则为马痘阴性 。 当 4. 3 和 5. 4. 5结果不一致时 , 以 5. 4. 5结果为准 。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　细胞培养用试剂的配制

　　A. 1 汉克液(Hanks)(10倍浓缩液)

　　A. 1. 1 成分

　　A. 1. 1. 1 成分甲

　　氯化钠 80. 0 g

　　氯化钾 4. 0 g

　　氯化钙 1. 4g

　　硫酸镁(MgSO4 · 7H2 O) 2. 0 g

　　A. 1. 1. 2 成分乙

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 · 12H2 O) 1. 52g

　　磷酸二氢钾 0. 6g

　　葡萄糖 10. 0 g

　　1%酚红 16mL

　　A. 1. 2 配制方法

　　按顺序将上述成分分别溶于双蒸水 450mL 中 , 即配成甲液和乙液 ,然后将乙液缓缓加入甲液 ,边加边搅拌 。补足双蒸水至 1000mL。用滤纸过滤后 ,加入三氯甲烷 2 mL,置 2 ℃ ~ 8 ℃保存 。

　　A. 1. 3 使用方法

　　使用时 ,用双蒸水稀释 10倍 ,107. 6kPa灭菌 15min,置 4 ℃保存备用 。用前以 7. 5%碳酸氢钠溶液调 pH 为 7. 2~ 7. 4。

　　A. 2 0. 25%胰蛋白酶溶液

　　A. 2. 1 成分

　　氯化钠 8. 0 g

　　氯化钾 0. 2 g

　　柠檬酸钠(Na3C6 H5 O7 · 5H2 O) 1. 12g

　　磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H2 O) 0. 056g

　　碳酸氢钠 1. 0 g

　　胰蛋白酶(1 ∶ 250) 2. 5 g

　　双蒸水 加至 1000mL

　　A. 2. 2 配制方法

　　放 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱过夜 ,待胰酶充分溶解后 ,用碳酸氢钠溶液调 pH 为 7. 4~ 7. 6。用 0. 2 μm 的微

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　　孔膜或 G6型玻璃滤器滤过除菌 。分装于小瓶中 , -20℃保存 。

　　A. 3 EDTA-胰蛋白酶分散液(10倍浓缩液)

　　A. 3. 1 成分

　　氯化钠 80. 0 g

　　氯化钾 4. 0 g

　　葡萄糖 10. 0 g

　　碳酸氢钠 5. 8g

　　胰蛋白酶(1 ∶ 250) 5. 0 g

　　乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 2. 0 g

　　按顺序溶于双蒸水 900mL 中 ,然后加入下列各液 :

　　1%酚红溶液 2. 0 mL

　　青霉素(10万 IU/mL) 10. 0 mL

　　链霉素(10万 μg/mL) 10. 0 mL

　　补足双蒸水至 1000mL

　　A. 3. 2 过滤除菌

　　用 0. 2 μm 的微孔膜或 G6型玻璃滤器滤过除菌 。分装小瓶 , -20℃保存 。

　　A. 3. 3 分装

　　临用前 ,用双蒸水稀释 10倍 ,适量分装于试管中 , -20℃冻存备用 。

　　A. 3. 4 使用方法

　　分散细胞时 ,将细胞分散液取出融化后 ,再置 35℃ ~ 37℃热水中预热,并用 7. 5%碳酸氢钠调 pH为 7. 6~ 8. 0。

　　A. 4 抗生素溶液(1万 IU/mL)

　　A. 4. 1 10倍浓缩液

　　青霉素 400万 IU(80万单位/瓶 × 5瓶)

　　链霉素 400万 μg(100万单位/瓶 × 4瓶)

　　双蒸水 40mL

　　溶液充分混合后 ,分装小瓶 ,放 -20℃保存 。

　　A. 4. 2 工作溶液

　　取上述浓缩液适量 ,用双蒸水稀释 10倍 ,分装后放于 -20℃保存备用 。

　　A. 5 Tris-EDTA 缓冲液

　　10mmol/LTris · Cl,pH7. 5

　　1 mmol/L EDTA,pH8. 0

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　　A. 6 5%乳汉液

　　水解乳蛋白 5 g

　　汉克氏液 1000mL

　　完全溶解后适量分装 ,经 107. 6 kPa灭菌 15min,放 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 ,用时以 7. 5%碳酸氢钠溶液调 pH 到 7. 2~ 7. 4。

　　GB/T 27640—2011

　　GB T 27640 2011

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　电泳用试剂的配制

　　B. 1 10×加样缓冲液

　　20%(质量浓度) Ficoll400

　　0. 1 mol/LNa2EDTA, pH8. 0

　　1. 0%(质量浓度) SDS

　　0. 25%(质量浓度) 溴酚蓝

　　0. 25%(质量浓度) 二甲苯青

　　B. 2 50× TAE 电泳缓冲液

　　Tris碱 242g

　　冰乙酸 57. 1 mL

　　Na2EDTA · 2H2 O 37. 2 g

　　加 H2 O 至 1 L。

　　B. 3 1000×溴化乙锭溶液

　　溴化乙锭 50mg

　　H2 O 100mL

　　按 1 ∶ 1000稀释配制凝胶和染色液 ,溶液应避光 。

　　小心 :溴化乙锭是一种诱变剂 ,必须小心操作 。

　　B. 4 PBS缓冲液

　　NaCl

　　8g

　　KCl

　　0. 2 g

　　Na2 HPO4

　　1. 42g

　　KH2PO4

　　0. 27g

　　溶于 1 L去离子水中 ,调节 pH 至 7. 4。高温高压灭菌 ,室温保存 。