GB/T 29582-2013 花生矮化病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29582—2013

　　花生矮化病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofpeanutstuntvirus

　　2013-07-19发布 2013-12-06实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29582—2013

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :于翠 、杨翠云 、印丽萍 、郑耘 、廖富荣 、郑建中 、易建平 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29582—2013

　　花生矮化病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了花生矮化病毒检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于活体植物材料 ,包括无性繁殖材料 、组培苗 、种子和苗木中花生矮化病毒的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 花生矮化病毒基本信息

　　中文名 :花生矮化病毒 。

　　英文名 :Peanutstuntvirus。

　　异 名 :groundnut stunt virus; peanut stunt cucumovirus; robinia mosaic virus; clover blotch virus;peanutcommon mosaic virus。

　　缩 写 :PSV。

　　属雀麦花叶病毒科 Bromoviridae,黄瓜花叶病毒属 Cucumovirus。

　　花生矮化病毒的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　利用基于抗原抗体反 应 的 双 抗 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbentassay,DAS-ELISA) 、体 外 反 转 录 和 体 外 DNA 合 成 技 术 的 反 转 录 聚 合 酶 链 式 反 应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行检测鉴定 。

　　5 仪器设备、设施、用具和试剂

　　5. 1 仪器

　　PCR仪 、超净工作台 、电子天平(0. 001 g) 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 、电子透射显微镜 、水浴锅 、高速冷冻离心机 、-80 ℃超低温冰箱 、高压灭菌锅 、制冰机 、微波炉 、涡旋振荡器 。

　　5. 2 设施

　　隔离温室(10 ℃ ~ 30 ℃) 。

　　5. 3 用具

　　可调式微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL)及相应的无 RNase 吸头 、无RNase离心管 、PCR管和研钵等 。

　　1

　　GB/T 29582—2013

　　5. 4 试剂

　　病毒检测试剂盒 、Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC) 、液氮 、三氯甲烷 、异戊醇 、异丙醇 、乙醇 、β-巯基乙醇 、AMV反转录酶 、TaqDNA 聚合酶 、DNA分子标记 、溴化乙锭 、琼脂糖 、溴酚蓝等 。血清学和分子生物学试剂配制参见附录 B。

　　注 : 除有特殊说明外 ,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂 。

　　6 检测

　　PSV 的症状根据 寄 主 植 物 和 病 毒 株 系 的 不 同 而 变 化 , 自 然 感 染 的 植 物 症 状 是 持 久 的 。 在 花 生(Arachishypogaea Linn. ) 上 有 不 同 程 度 的 矮 化 、节 间 缩 短 、叶 片 变 小 、轻 斑 驳 、豆 荚 畸 形 。 在 菜 豆(PhaseolusvulgarisLinn. )上 ,小三叶表现褪绿斑驳和花叶 ,而有些栽培种的小三叶变长 ,不能长成正常的叶片 ;烟草(Nicotianatabccum Linn. ) ,表面严重的斑驳 ,整株植物褪绿 ,或有褪绿斑并有橡树叶状的叶片 ;羽扇豆(LupinusmicranthusGuss. ) , 叶片 、花器畸形 ,植株矮化 。 当寄主植物表现症状时 ,可根据症状采样 ; 当寄主植物无症状时 ,则可以按 SN/T 2122 中规定的抽样方法进行 。

　　7 鉴定

　　7. 1 鉴定流程

　　有多种方法可对 PSV进行检测鉴定 。免疫电镜是一种快速方法 ,但是仅能对少量病毒含量高的样品进行检测 ,且需要透射电镜这样的贵重仪器 。PT-PCR作为单一方法能够快速灵敏地进行检测 ,但是需要实验室人员具备相当的专业技能 。ELISA 方法是一种快速 、简单易学且需试验设备最少的方法 ,但是 某 些 株 系 由 于 血 清 学 关 系 远 而 可 能 被 漏 检 。 通 常 初 筛 时 , 根 据 样 品 量 的 多 少 选 择 ELISA 或RT-PCR方法 。具体操作流程可参照图 1。鉴定样品是否带毒应两种或两种以上的方法相互验证 。

　　图 1 PSV鉴定流程图

　　2

　　GB/T 29582—2013

　　7. 2 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)

　　对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨 ,并按植物组织重量和抽提缓冲液 1 ∶ 10 的比例稀释 ,制备的汁液分别盛装于离心管中 ,低速离心后吸取上清液待用于 ELISA 检测 。具体检测步骤见附录 C。

　　7. 3 RT-PCR检测

　　植株叶片或种子液氮研细 ,取 0. 1 g用于提取植物总 RNA。RT-PCR具体操作步骤见附录 D。

　　7. 4 生物学检测

　　在室温(20 ℃ ~ 25 ℃)条件下 ,栽种于检疫隔离温室中的昆诺藜或苋色藜 、菜豆 、普通烟 、豇豆 、番茄等鉴别寄主植物第一对真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种 。对经 DAS-ELISA或 RT-PCR检测阳性的植株或种子 ,加入适量接种缓冲液研磨成汁液后接种指示植物 。 当任意一种指示植物出现如下描述症状时 , 即可判定接种成功 :

　　a) 苋色藜或昆诺藜(Chenopdiumamaranticolor,C. quinoa) :接种叶出现褪绿斑 ,后系统叶出现褪绿斑和花叶 ;

　　b) 菜豆(PhaseolusvulgarisLinn) :褪绿或局部坏死斑 ,系统褪绿花叶或仅有花叶症状(不同栽培种上的症状也不同) ;

　　c) 普通烟(N. tabacum) :接种叶上有直径 5 mm~ 10 mm 的线黄绿色环 ,系统感染的新叶上有褪绿区 ;

　　d) 豇豆(Vignaunguiculata) : 第一叶接种后的 4 d~ 5 d产生褪绿斑 ,2 d~ 3 d后小三叶表现脉明和向上束起 ;

　　e) 番茄(Lycopersiconesculentum Linn) :表现为类似感染黄瓜花叶病毒或番茄不孕病毒所引起的蕨叶的叶片呈带状 。

　　7. 5 免疫电镜检测

　　按照 SN/T 1840中的方法进行电镜观察病毒粒子形态 。在免疫电镜下如观察到直径为 29 nm 的病毒球状粒子 , 即可判定免疫电镜结果阳性 。

　　8 结果判定

　　当 DAS-ELISA结果阳性 ,且同时 7. 3、7. 4 或 7. 5 中任一结果为阳性时 ,可判定样品携带有花生矮化病毒 ; 当 RT-PCR结果阳性 ,且同时 7. 2、7. 4 或 7. 5 中任一结果为阳性时 ,也可判定样品携带有花生矮化病毒 。

　　9 样品与记录结果保存

　　9. 1 经检验确定携带花生矮化病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核 。如种子保存在干燥条件下 ,其他情况取试验样品保存在 -20℃冰箱中 ,有条件的保存在 -80℃冰箱中更好 。做好登记和标记工作 。

　　9. 2 记录包括 :样品来源 、种类 ,取样人员 ,试验的时间 、地点 、方法和结果 ,检验检疫员的签字等 。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值 ,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 ,RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析 。

　　3

　　GB/T 29582—2013

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　花生矮化病毒其他信息

　　A. 1 寄主范围

　　PSV 自然侵染大豆 、花生 、菜豆 、刺槐 、烟草 、豌豆以及三叶草等多种豆科牧草 。

　　A. 2 为害症状

　　PSV影响寄主植物的整个生长期 。典型症状为节间缩短 、叶片变小 、褪绿 、畸形 ;在某种程度上 , 中期感染的症状与番茄 斑 萎 病 毒 属 引 起 的 症 状 相 似 。早 期 感 染 的 植 株 几 乎 不 产 生 种 子 或 种 子 不 明 显 。 PSV 的症状根据主寄植物和病毒株系的不同而变化 。 自然感染的植物的症状是持久的 。

　　A. 3 分布地区

　　欧洲 :法国 、匈牙利 、意大利 、波兰 、西班牙 。

　　亚洲 : 印度 , 日本 ,朝鲜半岛 , 中国的河北 、山东 、河南 、江苏等省 。

　　非洲 :摩洛哥 、苏丹 。

　　美洲 :美国 。

　　A. 4 传播方式

　　A. 4. 1 介体传播

　　PSV 可由蚜虫以非持久性方式传播 。介体的获毒时间不到 1 min,传毒时间不到 1 min,无潜伏期 ,病毒不传给幼蚜 。在试验条件下易摩擦接种 。

　　A. 4. 2 种子传毒

　　可通过花生种子传给下一代植株 ,PSV从花生的种子传给幼苗的百分率低(大约 0. 1%) 。 大豆是否可种传该病毒 , 目前还无定论 ,有报道种传率可达 3% ~4% ,也有报道不种传 。 尚无其他植物种子传播 PSV 的报道 。

　　A. 4. 3 其他传染源

　　在美国 ,病毒可在白三叶草 、烟草 、菜豆上越冬 ,这几种植物是感染源 。

　　A. 5 粒体形态

　　PSV 粒体为等轴对称二十面体 ,直径 29 nm。

　　4

　　GB/T 29582—2013

　　A. 6 基因组

　　PSV基因 组 为 三 分 体 基 因 组 , 每 个 病 毒 粒 子 包 裹 有 单 分 子 的 RNA1 或 RNA2 , 或 者 RNA3 和RNA4 。存在广泛的株系分化现象 ,根据分子遗传亲缘关系将 PSV划分为三个亚组 。

　　5

　　GB/T 29582—2013

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　试 剂 配 置

　　B. 1 10×PBST缓冲液(pH7. 4)

　　氯化钠(NaCl)

　　80 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 )

　　2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 )

　　11. 5 g

　　氯化钾(KCl)

　　2 g

　　吐温-20(Tween-20 )

　　5 mL

　　溶于 900 mL 的蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 7. 4,并定容至 1 000 mL。

　　B. 2 样品抽提缓冲液(pH7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 )

　　1. 3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP)

　　20 g

　　叠氮钠(NaN3 )

　　0. 2 g

　　吐温-20(Tween-20)

　　20 mL

　　溶于 900 mL 的 1×PBST 中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 7. 4,定容至 1 000 mL。

　　B. 3 包被抗体缓冲液(pH9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　溶解于 900 mL蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 9. 6,并定容至 1 000 mL。

　　B. 4 酶标抗体缓冲液(pH7. 4)

　　1×PBST缓冲液

　　800 mL

　　牛血清白蛋白(BSA)

　　2 g

　　PVP(相对分子质量 24

　　000~40000)

　　20 g

　　用无菌蒸馏水定容至 1

　　000 mL。

　　B. 5 底物(ρNPP)缓冲液(pH9. 8)

　　二乙醇胺 97 mL

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶解于 600mL 的无菌蒸馏水中 ,用浓盐酸(HCl)调节 pH 至 9. 8,然后用蒸馏水定容至 1000mL。

　　6

　　GB/T 29582—2013

　　B. 6 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH)120g溶于 1 000 mL 的无菌蒸馏水中 ,浓度 3 mol/L。

　　B. 7 电泳缓冲液 TAE(50× )

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸 52. 1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠(EDTA,0. 5 mol/L ) 100 mL

　　用时加蒸馏水稀释至 1×TAE。

　　B. 8 溴化乙锭(EB)溶液(10μg/μL)

　　溴化乙锭 20 mg

　　灭菌去离子水 20 mL

　　7

　　GB/T 29582—2013

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)

　　C. 1 检测

　　C. 1. 1 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上 ,包括 2 个阳性对照孔 、2 个阴性对照孔 、2 个空白对照孔和多个待检测样品孔 。待测样品孔重复两次 。

　　C. 1. 2 每孔加入 100 μL 的 PSV 的包被抗体溶液 , 封口膜包好 , 37 ℃孵育 2 h~ 4 h(或 4 ℃冰 箱 过夜) 。

　　C. 1. 3 将酶联板孔中溶液控干 ,用 200 μL的 1×PBST洗涤液洗涤酶联板 3 次 ,每次 3 min,然后在干净毛巾或滤纸上扣干 。

　　C. 1. 4 将 100μL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中 ,对照孔中也各加入 100μL相应的阴性对照 、阳性对照和空白对照 。封口膜包好 ,37 ℃孵育 2 h~ 3 h(或 4 ℃冰箱过夜) 。

　　C. 1. 5 洗涤 ,步骤同 C. 1. 3。

　　C. 1. 6 用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体 ,每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 ,封口膜包好 ,并于 37 ℃孵育 2 h~4 h。

　　C. 1. 7 洗涤 ,步骤同 C. 1. 3。

　　C. 1. 8 将 ρNPP溶于底物缓冲液中 ,使最终浓度为 1 mg/mL。 每孔加入 100 μL配好的底物溶液 ,室温孵育 0. 5 h~ 2 h。必要时每孔加入 50 μL的 3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应 。

　　C. 1. 9 酶标仪 405 nm 波长下检测各孔的吸收值并记录 。

　　C. 2 结果判定

　　C. 2. 1 质量控制要求 :缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值小于 0. 15, 阴性对照孔的 OD405值小于 0. 05时 ,按 0. 05计算 。 阳性 对 照 有 明 显 的 颜 色 反 应 , 孔 的 重 复 性 以 样 品 OD 值 的 平 行 允 许 率 控 制 , 按 照式(C. 1)进行计算 :

　　P

　　式中 :

　　P — 平行允许率 ;

　　OD1— 重复样品 1 的 OD 值 ;

　　OD2— 重复样品 2 的 OD 值 。

　　当重复检测样品 OD 值平行允许率(P)小于 20%时 ,判定检测结果有效 。

　　C. 2. 2 若满足不了 C. 2. 1 的质量要求 ,则不能进行结果判定 。

　　C. 2. 3 在满足了 C. 2. 1 的质量要求后 ,则按如下原则作出判定 :

　　样品 OD405/阴性对照 OD405值明显大于 2,结果判定为阳性 ;

　　样品 OD405/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重做一次或者用其他方法进行验证 ;样品 OD405/阴性对照 OD405值明显小于 2,判为阴性 。

　　8

　　GB/T 29582—2013

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测方法

　　D. 1 植物总 RNA提取

　　D. 1. 1 取 0. 1 g样品,液氮研细 ,加入 1 mL Trizol,混匀 ,倒入 1. 5 mL离心管中 。

　　D. 1. 2 加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,猛烈振荡 15 s ,4℃ 11000 r/min离心 10min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 。

　　D. 1. 3 加入等体积异丙醇 ,混匀 , -20 ℃静置 10 min,4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min,保留沉淀 。 D. 1. 4 加入 1 mL 75%冷乙醇 ,悬浮沉淀 ,4 ℃8000 r/min离心 10 min,干燥沉淀 。

　　D. 1. 5 加入 30 μL DEPC-H2 O,溶解沉淀(必要时 ,55 ℃ ~ 60 ℃水浴 10 min,加速溶解) ,存于 -80 ℃备用 。

　　注 : 或者按照商品 RNA提取试剂盒进行操作 。

　　D. 2 引物序列

　　正向引物 PSV-1F: 5’GCTCATGCTAGAGAGCTCCG3’; 反 向 引 物 PSV-1R: 5’GAAGGGAT- TCGCTGATGCTC3’。扩增片断长度约 550 bp。

　　D. 3 反转录

　　利用提取的 RNA在 PCR管中进行反转录 。首先加入 3 μL模板 RNA,1 μL下游引物(20μmol/L) , 8 μL水混 合 后 70 ℃ 温 育 5 min; 立 即 置 于 冰 上 , 2 min 后 加 入 4 μL AMV 缓 冲 液 、1 μL dNTP (10 mmol/L) 、1 μLAMV反转录酶(10U/μL) 、1 μL RNA酶抑制剂(40U/μL) ,42 ℃反应 1 h。也可采用 RT-PCR一步法试剂盒 ,操作步骤按使用说明进行 。

　　注 : 如不立即进行 PCR扩增 ,应将逆转录产物置于 -20℃保存 。

　　D. 4 核酸扩增

　　PCR反应体系见表 D. 1,每个样品设 2个平行处理 。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以含花生矮化病毒材料的 cDNA 或含有花生矮化病毒 目标片断的质粒作为阳性对照 , 以健康植物材料作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 D. 1 RT-PCR反应体系

　　名称

　　储存液浓度

　　终浓度

　　加样量/μL

　　PCR 缓冲液

　　× 10

　　× 1

　　2. 5

　　dNTP

　　2. 5 mmol/L

　　200 μmol/L

　　2

　　上游引物

　　10 μmol/L

　　0. 2 μmol/L

　　0. 5

　　下游引物

　　10 μmol/L

　　0. 2 μmol/L

　　0. 5

　　9

　　GB/T 29582—2013

　　表 D. 1 (续)

　　名称

　　储存液浓度

　　终浓度

　　加样量/μL

　　Taq酶

　　5 U/μL

　　0. 05 U/μL

　　0. 25

　　cDNA

　　—

　　—

　　1. 5

　　无菌水

　　—

　　—

　　17. 75

　　总体积

　　—

　　—

　　25

　　D. 4. 1 PCR反应循环参数 :

　　普通 PCR反应参数见表 D. 2 ,不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 。

　　表 D. 2 普通 RT-PCR反应参数

　　变性

　　扩增条件

　　循环次数

　　延伸

　　94 ℃ 4 min

　　94 ℃ ,30 s

　　30

　　72 ℃ , 10 min

　　58 ℃ , 30 s

　　72 ℃ , 45 s

　　D. 4. 2 PCR扩增产物的电泳检测

　　用电泳缓冲液(1× TAE) 配 制 2. 0%的 琼 脂 糖 凝 胶 (55 ℃ ~ 60 ℃ 时 加 入 溴 化 乙 锭 至 终 浓 度 为0. 5 μg/mL,也可在电泳后进 行 染 色) 。 在 电 泳 槽 中 加 入 电 泳 缓 冲 液 , 使 液 面 刚 刚 没 过 凝 胶 。将 9 μL PCR扩增产物 ,加 1 μL10×上样缓冲液上样 。恒压(5V/cm~ 6 V/cm)电泳 40min~ 50min。凝胶成像系统中观察电泳结果 ,拍照并记录结果 。

　　D. 5 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现预期大小的条带 ,样品未出现预期大小的条带 ,则可判定样品为花生矮化病毒阴性 。

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现预期大小的条带 ,样品出现预期大小条带 ,可通过测序的方式进一步确认 。如果 PCR产物序列与花生矮化病毒的序列同源 ,则可判定样品为花生矮化病毒阳性 ,若序列不 同 源 , 则 可 判 定 样 品 为 花 生 矮 化 病 毒 阴 性 。 也 可 通 过 荧 光 PCR 的 方 式 进 一 步确认 。

　　10