GB/T 29581-2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29581—2013

　　胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofXanthomonasaxonopodispv. betlicola

　　(Pateletal. ) Vauterinetal.

　　2013-07-19发布 2013-12-06实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29581—2013

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国海南出入境检验检疫局 、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :刘福秀 、冯黎霞 、龙海 、李伟东 、凌杏园 、韩玉春 、周先超 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29581—2013

　　胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodispv.betlicola)的检疫和鉴定方法 。

　　本标准适用于植物苗木等繁殖材料及组织中胡椒叶斑病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 4789. 28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法 、培养基和试剂

　　3 胡椒叶斑病菌基本信息

　　中文名 :胡椒叶斑病菌(胡椒细菌性叶斑病菌 ;地毯草黄单胞杆菌蒌叶致病变种) 。

　　学名 :Xanthomonasaxonopodispv.betlicola(Patel, Kulkarni& Dhande 1951) Vauterin, Hoste, Kersters & Swings1995。

　　异名 :Xanthomonascampestris pv.betlicola (Patel, Kulkarni& Dhande 1951) Dye1978。

　　病害英文名 :bacterial leaf spotof pepper、pepper bacterial leaf spot。

　　属原核生物界 Procaryotes、变形细菌门 Proteobacteria、γ-变形细菌纲 Gammaproteobacteria、黄单胞菌目 Xanthomonadales、黄单胞菌科 Xanthomonadaceae、黄单胞菌属 Xanthomonas、地毯草黄单胞杆菌 Xanthomonasaxonopodis。

　　胡椒叶斑病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据胡椒叶斑病菌的寄主范围 、培养性状 、生理生化特性和所致病害的症状特点 ,采用病原菌的分离 、病菌培养性状观察 、生理生化特性检测以及致病性测定等方法进行检测和鉴定 。

　　5 试剂与培养基

　　5. 1 试剂

　　无菌水 、琼脂 、酵母提取物 、蛋白胨 、葡萄糖 、营养琼脂 、牛肉膏 、氯化钠 、氢氧化钠 。

　　果糖 、木糖 、半乳糖 、乳糖 、麦芽糖 、甘露醇 、海藻糖 、甘油 、水杨苷 、蔗糖 、山梨糖 、鼠李糖 、棉子糖 、肌醇 、草酸钠 、β-羟基丁酸钠 、琥珀酸钠 、苹果酸 、乳酸钠 、柠檬酸钠 、酒石酸钠 、DL-精氨酸明胶 、石蕊牛奶 。

　　5.2 培养基

　　病菌分离采用 NGA培养基(见附录 B) ,病菌增殖采用营养琼脂培养基(见附录 B) 。

　　1

　　GB/T 29581—2013

　　6 仪器和用具

　　天平 、搅拌器 、冰箱(4 ℃ ±2 ℃ ; -80 ℃) 、无菌(新)塑料封口袋 、脱脂棉 、石棉铁丝网 、高压灭菌锅 、培养箱(29 ℃ ±1 ℃;或其他可以控制温度的暗室) 、无菌昆虫针 、紫外灯 、小型离心机 、酸度计(或精密pH试纸) 、超净工作台等 。

　　7 检测与鉴定

　　7. 1 现场检疫

　　7. 1. 1 感官检查

　　仔细检查 ,观察典型症状或可疑症状(参见附录 A) 。感病组织表面可能有菌脓 。

　　7. 1.2 样品抽取

　　发现可疑植株 ,切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验 。

　　7.2 室内检测与鉴定

　　7.2. 1 病原菌分离

　　取小块病组织用无菌水冲洗后放入 0. 5 mL~ 2. 0 mL无菌水中 ,观察是否有细菌溢出 。 如果有喷菌现象 ,则用接种环挑取喷出的菌液 ,在 NGA 培养基(参见附录 B) 上划线分离 。 如没有喷菌现象 ,则用灭菌玻棒将病组织研碎 ,在室温下浸泡 15 min~20 min,用接种环挑取组织液在 NGA培养基上划线分离 。看不到症状的情况下 ,用无菌水洗涤病组织(病组织为叶片时 ,洗涤量应在 10片以上) ,洗涤液离心浓缩后做适当稀释 ,在 NGA培养基上划线分离 。划线细菌在 28℃ ~ 30 ℃下黑暗培养 。至少设 2个重复 。3 d后即可观察所产生的菌落 。如果发现可疑的菌落应该及时使用 NGA 培养基进一步纯化培养观察 ,并进行后续试验 。

　　7.2.2 菌落形态观察

　　配制表 1所列 9种培养基 ,并按表 1所列培养条件培养待检菌株 ,其中 1是必需的 ,2~ 9 可选 。

　　表 1 胡椒叶斑病菌在不同培养基上的培养性状

　　序号

　　培养基

　　培养条件

　　典型培养性状

　　1

　　营养琼脂

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌落圆形 ,黄色 ,有光泽 ,全缘 ,稍隆起 ,粘稠

　　2

　　牛肉膏胨培养液

　　28 ℃ ~ 30 ℃下 振 荡 培养 24h或静止培养 7 d

　　培养液轻度浑浊 ,无液面生长 ,沉淀物不明显

　　3

　　牛肉膏胨琼脂平面

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌落圆形 ,直径 1 mm~ 2 mm , 表 面 光 滑 , 闪 光 , 边 缘完整 ,乳 酪 状 , 低 度 凸 起 , 半 透 明 或 不 透 明 , 乳 白 带 浅黄色

　　4

　　酵母膏胨培养液

　　28 ℃ ~ 30 ℃下 振 荡 培养 24h或静止培养 7 d

　　培养液轻度浑浊 ,无液面生长 ,沉淀物不明显

　　5

　　牛肉膏胨酵母葡萄糖培养液

　　28 ℃ ~ 30 ℃下 振 荡 培养 24h或静止培养 7 d

　　培养液中度浑浊 ,液面生长环状 ,沉淀物少量

　　2

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　　表 1 (续)

　　序号

　　培养基

　　培养条件

　　典型培养性状

　　6

　　牛肉膏胨酵母葡萄糖琼脂斜面

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌苔均为线 状 , 快 速 生 长 , 乳 酪 状 , 不 粘 稠 , 乳 白 带 浅黄色 ,培养基不变色

　　7

　　牛肉膏胨酵母葡萄糖琼脂平板

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌落圆形 ,直径 3 mm~ 5 mm , 表 面 光 滑 , 闪 光 , 边 缘完整 ,乳 酪 状 , 低 度 凸 起 , 半 透 明 或 不 透 明 , 乳 白 带 浅黄色

　　8

　　牛肉膏胨琼脂斜面

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌苔均为线 状 , 中 度 生 长 , 乳 酪 状 , 不 粘 稠 , 乳 白 带 浅黄色 ,培养基不变色

　　9

　　酵母膏胨琼脂斜面

　　28 ℃ ~ 30 ℃下培养 7 d

　　菌苔均为线 状 , 中 度 生 长 , 乳 酪 状 , 不 粘 稠 , 乳 白 带 浅黄色 ,培养基不变色

　　发现典型菌落的结果判为阳性 , 同时记录可疑菌落数 ,并进行后续试验 。如没有发现典型的菌落 ,结果判为阴性 。

　　7.2.3 革兰氏染色

　　革兰氏染色按 GB/T 4789. 28—2003中 2. 2 的规定进行试验 。 观察革兰氏染色反应的试验结果和菌体形态 。

　　胡椒叶斑病菌革兰氏染色呈阴性反应 。典型菌体短杆状 ,末端圆形 , 大小为(0. 4 μm~ 0. 7 μm) × (1. 0 μm~ 2. 4 μm) ,单个或成双排列 ,有 3~ 5个的短链 。无芽孢 ,无荚膜 ,有运动性 ,鞭毛为单根极生 。

　　革兰氏染色呈阴性反应 ,且观察到菌体典型形态的结果判为阳性 ,并进行后续试验 。如革兰氏染色反应呈阳性 ,或革兰氏染色反应呈阴性但没有观察到菌体典型形态 ,结果判为阴性 。

　　7.2.4 生理生化特性测定

　　将上述分离的等检细菌用微量生化反应管进行生理生化特性测定 。 以 X.axonopodispv.betlicola阳性菌株做对照 ,每个测定项目设 3 个重复 。生理生化特性测定结果与附录 C 结果一致判定为阳性 ,并进行致病性测定 。否则判为阴性 。

　　7.3 致病性测定

　　7.3. 1 针刺接种

　　采用平板划线法在营养 琼 脂 培 养 基 平 板 上 纯 化 刚 分 离 的 待 测 细 菌 , 在 28 ℃ ~ 30 ℃温 度 下 培 养2 d~4 d,移出单个菌落后进一步扩大繁殖 。取待测细菌在营养琼脂培养基上培养 24 h~ 48 h,用灭菌的昆虫针蘸取菌落 ,在胡椒苗嫩叶背面进行刺伤接种(Pan-niyur系列品种或其他品种都行 , 国内主栽品种都感病) 。每个菌株接种 3 片叶 。接种标准的阳性菌株作为阳性对照 , 同时接种非致病菌和无菌水作为阴性对照 。接种后的植株 置 放 于 人 工 气 候 箱 , 在 28 ℃ ~ 30 ℃温 度 下 , 先 在 100%相 对 湿 度 下 保 湿24h~48h,然后在 80%左右的相对湿度下 ,每天在 7 000 lx~ 10 000 lx下光照培养 16 h,黑暗下培养8 h。接种 5 d~ 7 d后 ,观察是否出现水渍状角形病斑 ,每天观察一次 ,接种后 30 d不表现症状的视为不发病 。试验重复 3 次 。

　　用喷雾法接种于胡椒或蒌叶叶片上也能产能水渍状多角形病斑 。

　　3

　　GB/T 29581—2013

　　7.3.2 病菌再分离

　　按 7. 2. 1 的方法对 7. 3. 1 中发病的植株进行病菌再分离 ,能得到 7. 2. 2 描述的纯培养判为阳性 ,否则判为阴性 。

　　8 结果评定

　　没有发现典型的菌落 , 即菌落形态观察结果为阴性 ,判定为未检出胡椒叶斑病菌 。

　　革兰氏染色呈阳性反应 , 即革兰氏染色结果为阴性 ,判定为未检出胡椒叶斑病菌 。

　　生理生化特性测定结果与附录 C结果不一致 , 即生理生化特性测定结果为阴性 ,判定为未检出胡椒叶斑病菌 。

　　致病性测定试验中 ,接种后没有出现典型症状 ,或出现了典型症状但没有从接种后发病的组织中再分离到与原接种物相同的病原菌 , 即致病性测定结果为阴性 ,判定为未检出胡椒叶斑病菌 。

　　菌落形态观察结果 、革兰氏染色结果 、生理生化特性测定结果和致病性测定结果四者均为阳性 ,判定为检出胡椒叶斑病菌 。

　　9 样品和菌种保存

　　9. 1 样品保存

　　样品(包括健康和发病的植株或组织)拍照后均应制成干标本 ,经登记和签字后置于 4 ℃冰箱或阴凉干燥 、防虫防鼠处妥善保存 。对鉴定为胡椒叶斑病菌的样品至少应保存 6 个月 , 以备复检 、谈判和仲裁 ,样品保存期满后 ,需经灭菌处理 。

　　9.2 菌种保存

　　从样品中分离并鉴定为胡椒叶斑病菌的新鲜菌种在营养琼脂培养基上 28 ℃ ~ 30 ℃培养 24 h 后 ,用灭菌的昆虫针刮取细菌 ,放入装有无菌水的玻璃管中 ,封口后经登记和签字 ,置于室温或 4 ℃冰箱中保存 ;或用真空干燥机制成冻干粉置于 -20℃以下低温冰箱保存 。对欲废弃的菌种应做灭菌处理 。

　　4

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　胡椒叶斑病菌的其他信息

　　A. 1 地理分布

　　柬埔寨 、马来西亚 、印度 、孟加拉国 、新西兰 、巴西 。

　　A.2 寄主植物

　　自然寄主 : 胡 椒 (Piper nigrum) 、假 蒟 (Piper sarmentosum) 、海 南 蒟 (Piper hainanense) 、蒌 叶(Piperbetle) 、假高粱(Sorghum halepense) 、柠檬(Citruslimonum)等 。

　　接种寄主 :菜豆(Phaseolusvulgaris)等 。

　　A.3 症状特点

　　胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola) 可侵染蔓 、枝 、叶 、花序及果穗 ,但主要侵害叶片 。

　　感病的叶片初为透明状的侵染点 , 随后扩大成多角形病斑 ,数天后 ,病斑中间呈褐色 ,外缘有黄晕 ,叶背病健交界处呈水渍状 ,雨天或湿度大时 ,常见有细菌溢脓 ,成一层明胶状薄膜 。高温干旱期 ,病斑多在植株下层叶边缘和叶尖发生 。

　　蔓枝一般在节上或伤口感染 ,初为紫褐色 , 随后干枯脱节 。

　　花序及果穗一般先从穗的末端感病 ,病部呈紫黑色 、易脱落 。

　　A.4 传播方式

　　该病菌主要通过伤口和自然孔口侵入寄主 ,侵染来源一是带病种苗 ,二是病株的残枝落叶 ,病菌在病组织中可存活 1个月以上 ,三是野生杂草 。病菌靠雨水 、露水 、风 、昆虫及农事操作等近距离传播 ,带病的种苗和病残体可作远距离的传播 。

　　5

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　　附 录 B (规范性附录)培养基的配制

　　B. 1 淋病奈瑟菌培养基(NGA)

　　淋病奈瑟菌培养基的配方见表 B. 1。

　　表 B. 1 淋病奈瑟菌培养基的配方

　　成 分

　　配 方 比 例

　　酵母提取物

　　3. 0 g

　　蛋白胨

　　5. 0 g

　　葡萄糖

　　2. 5 g

　　琼脂

　　16. 0 g

　　蒸馏水

　　1. 0 L

　　按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物 、蛋白胨 、葡萄糖放入烧杯中 。蛋白胨很易吸潮 ,在称取时动作要迅速 。在烧杯中加入约 800 mL蒸馏水 ,用搅拌器搅拌 ,待药品完全溶解后 ,将称好的琼脂放入已溶解的药品溶液中 ,再加热溶化 ,在琼脂溶化的过程中 ,需不断搅拌 , 以防琼脂糊底 。最后补足水分至 1 000 mL,再分装 ,103. 43 kPa(121 ℃)灭菌 15 min。

　　B.2 营养琼脂培养基

　　营养琼脂培养基的配方见表 B. 2。

　　表 B.2 营养琼脂培养基的配方

　　成 分

　　配 方 比 例

　　营养琼脂

　　41 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　称取 41 g 营养琼脂干燥粉末加入 1 000 mL冷蒸馏水中混合放置 10 min, 隔石棉铁丝网微火煮沸使其完全溶解 ,分装 ,103. 43 kPa(121 ℃)灭菌 15 min。

　　B.3 牛肉膏胨培养基

　　牛肉膏胨培养基的配方见表 B. 3。

　　6

　　GB/T 29581—2013

　　表 B.3 牛肉膏胨培养基的配方

　　成 分

　　配 方 比 例

　　牛肉膏

　　3. 0 g

　　蛋白胨

　　10. 0 g

　　氯化钠

　　5. 0 g

　　琼脂(配制固体培养基时加入)

　　20. 0 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　pH 值 :7. 0~ 7. 2

　　准确称取各种成分 ,一些不易称量的成分如牛肉膏 ,可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量 ,然后连同硫酸纸一起放入烧杯中 , 向烧杯内加入所需的水量 ,将牛肉膏用水洗下后 ,取出硫酸纸弃去 ,加热搅拌全溶后稍放冷 。用酸度计或精密 pH试纸测定其 pH值 ,并用 10% 氢氧化钠溶液调至所需 pH值 ,必要时用滤纸或脱脂棉过滤 ,一般比要求的 pH 高出 0. 2, 因 为 高 压 蒸 汽 灭 菌 后, pH 常 降 低 。 分 装 , 103. 43 kPa (121 ℃)灭菌 15 min。

　　B.4 牛肉膏胨酵母葡萄糖培养基

　　牛肉膏胨酵母葡萄糖培养基的配方见表 B. 4。

　　表 B.4 牛肉膏胨酵母葡萄糖培养基的配方

　　成 分

　　配 方 比 例

　　牛肉膏

　　1. 5 g

　　蛋白胨

　　5. 0 g

　　氯化钠

　　3. 5 g

　　磷酸氢二钾

　　3. 68 g

　　磷酸二氢钾

　　1. 32 g

　　琼脂(配制固体培养基时加入)

　　20. 0 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　pH 值 :7. 0~ 7. 2

　　配制方法同 B. 3。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　胡椒叶斑病生理生化特性

　　C. 1 生理生化特性

　　胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodis pv. betlicola) 耐盐度 2% ,初始生长 pH 值为 5. 6~ 8. 5。可以在 5 ℃ ~ 37 ℃ ±1℃生长 ,不能在 41 ℃ ±1℃生长 。触酶反应呈阳性 ,氧化酶阴性 。产氨 ,产硫化氢 ,不产吲哚 ,水解淀粉 , 明胶液化 ,不还原硝酸盐 , M. R. 和 V. P. 反应阴性 , 石蕊牛奶产碱和胨化(详见表 C. 1) 。

　　表 C. 1 胡椒叶斑病菌(X. axonopodispv.betlicola)生理生化特性

　　初始生长 pH值

　　鉴别性生长温度

　　耐盐度/%

　　触酶

　　氧化酶

　　氨

　　硫化氢

　　吲哚

　　淀粉水解

　　液化明胶平板

　　硝酸

　　盐还

　　原

　　M. R.

　　V. P.

　　石蕊牛奶

　　最高

　　最低

　　5℃

　　37 ℃ ±

　　1 ℃

　　41 ℃ ±

　　1 ℃

　　5. 6

　　8. 5

　　W

　　+

　　-

　　2

　　+

　　-

　　+

　　+

　　-

　　+

　　+

　　-

　　-

　　-

　　b. p.

　　注 : b. 表示产碱 ,p. 表示胨化 , +表示正反应 , -表示负反应 ,W 表示弱反应 。

　　C.2 碳、氮源利用情况

　　该菌能利用琥珀酸盐 、苹果酸 、乳酸盐 、柠檬酸盐作唯一碳源 ,并呈碱性反应 。不能利用草酸盐 、酒石酸盐 、β-羟基丁酸盐和精氨酸作唯一碳源(详见表 C. 2) 。

　　表 C.2 对有机酸和氨基酸作为唯一碳源的利用特性

　　草酸钠

　　β-羟基丁酸钠

　　琥珀酸钠

　　苹果酸

　　乳酸钠

　　柠檬酸钠

　　酒石酸钠

　　DL-精氨酸

　　-

　　-

　　+

　　+

　　+

　　+

　　-

　　-

　　注 : +表示生长 , -表示不生长 。

　　C.3 碳水化合物发酵

　　该菌葡萄糖氧化产酸不产气 ,果糖 、木糖 、半乳糖 、乳糖 、麦芽糖 、甘露醇 、海藻糖和甘油产酸不产气 。

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　　GB/T 29581—2013

　　水杨苷不产酸不产气 ,但能生长 。蔗糖 、山梨糖 、鼠李糖 、棉子糖 、肌醇不产酸不产气(详见表 C. 3) 。

　　表 C.3 碳水化合物发酵特性

　　葡萄糖

　　果糖

　　木糖

　　半乳糖

　　乳糖

　　麦芽糖

　　蔗糖

　　甘露糖

　　山梨糖

　　海藻糖

　　鼠李糖

　　棉子糖

　　肌醇

　　甘油

　　水杨苷

　　A

　　A

　　A

　　A

　　A

　　A

　　A

　　A

　　-

　　A

　　-

　　-

　　-

　　A

　　+和 -

　　注 : A表示产酸 , -表示不产酸不产气 , +表示生长 。

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