GB/T 29396-2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29396—2012

　　水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法

　　Detection andidentification ofBurkholderiaglumae (Kurita&Tabei) Urakamietal.

　　2012-12-31发布 2013-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29396—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :朱金国 、莫瑾 、朱水芳 、赵文军 、李芳荣 、李一农 、彭梓 、钟文英 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29396—2012

　　水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderiaglumae) 的检疫鉴定以植物的形态学特征 、生理生化特性 、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据 , 明确了田间观察 、分离鉴定 、样品保存的方法 。

　　本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻细菌性谷枯病菌的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB 15569—1995 农业植物调运检疫规程

　　国际种子检验规程(ISTA)

　　3 水稻细菌性谷枯病菌基本信息

　　中文名 :水稻细菌性谷枯病菌(颖壳伯克氏菌 ;颖壳假单胞菌) 。

　　学名 :Burkholderiaglumae(Kurita&Tabei) Urakamieta1. 。

　　异名 :Pseudomonasglumae Kurita&Tabei。

　　病害英文名 :Bacterialgrain rotof rice。

　　属细菌界 Bacteria、变形菌门 Proteobacteria、乙型变形菌纲 Betaproteobacteria、伯克氏菌 目 Burk- holderiales、伯克氏菌科 Burkhoideriaceae、伯克霍尔德氏菌属 Burkholderia。

　　种子带菌是远距离传播的主要途径 。

　　水稻细菌性谷枯病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据水稻植株的形态学特征进行田间观察 ,并采用分离培养 、分子生物学和酶联免疫学筛选 、生理生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻细菌性谷枯病菌进行判定 。

　　5 设备和材料

　　5. 1 冷冻高速离心机 :转速 ≤15 000 r/min。

　　5. 2 PCR扩增仪 。

　　5. 3 恒温培养箱 :28 ℃ ±1 ℃ 。

　　5. 4 显微镜 :物镜头 10× ~ 100× 。

　　5. 5 天平 :精度 0. 001 g。

　　5. 6 高压灭菌器 。

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　　5. 7 冰箱 :0 ℃ ~4 ℃ 。

　　5. 8 均质器 :转速 4 000 r/min~ 8 000 r/min。

　　5. 9 可调移液器 :10μL~ 100 μL,100 μL~ 1 000 μL。

　　5. 10 器具 :灭菌的镊子 、剪刀 、称量勺 。

　　5. 11 吸管 :1 mL、10 mL。

　　5. 12 灭菌平皿 :直径 90 mm ,玻璃或一次性塑料平皿 。

　　5. 13 三角瓶 :100 mL。

　　6 培养基和试剂

　　6. 1 S-PG培养基 :见 B. 1。

　　6. 2 CCNT培养基 :见 B. 2。

　　6. 3 SPA培养基 :见 B. 3。

　　6. 4 0. 001%吐温 20-磷酸盐缓冲液 :见 B. 4。

　　6. 5 革兰氏染色试剂 :见 B. 5。

　　6. 6 鞭毛染色试剂 :见 B. 6。

　　6. 7 明胶液化培养基 :见 B. 7。

　　6. 8 氧化酶试剂 :见 B. 8。

　　6. 9 硝酸盐培养基 :见 B. 9。

　　6. 10 过氧化氢酶试验试剂 :见 B. 10。

　　6. 11 O-F葡萄糖利用培养基 :见 B. 11。

　　6. 12 葡萄糖酸盐培养基 :见 B. 12。

　　6. 13 精氨酸双水解酶试验用培养基(AD) :见 B. 13。

　　6. 14 淀粉水解培养基 :见 B. 14。

　　6. 15 糖利用培养基 :见 B. 15。

　　7 田间检验

　　水稻细菌性谷枯病在水稻抽穗期至灌浆期的谷粒和植株上均可显现明显症状 ,通过田间观察可直接对水稻受害情况进行判断 ,该病害田间症状及相关资料参见附录 A。对田间检验有病害发生的植株 ,按以下操作进行抽样及实验室检验 。

　　8 抽样

　　水稻种子抽样可参照 ISTA《国际种子检验规程》或者 GB 15569—1995 中 6. 1方法进行 。

　　9 样品处理及分离培养

　　9. 1 水稻种子

　　大量种子样品先用蒸馏水冲洗后 ,称取 10g或 400粒种子放入 90mL 0. 001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)中低温(5 ℃ ~ 15 ℃)浸泡 4 h~ 6 h,用均质器打碎 ,制备样品提取液 。如果是检测少量的种子样品,取 20粒种子加入 10mL灭菌的 0. 001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH 7. 0) ,用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子充分碾磨 ,制成提取液 。

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　　将样品提取液置于 22 ℃ ~ 25 ℃环境中 4 h~ 6 h后 ,旋涡混匀悬浮液 5 min,悬浮液进行十倍梯度稀释 ,稀释后的 10× ,和 100× 以及 1 000×三个稀释度的悬浮液取 0. 3 mL,分别放入到 3 个 S-PG 和CCNT 的平皿中(每个平皿加 0. 1 mL) 。用 L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面 。

　　9. 2 植物组织材料

　　9. 2. 1 无症状组织

　　将 10 g左右样品直接放入 90 mL 0. 001%吐温-磷酸盐缓冲液中 ,均质 1 min制备成样品提取液 。按 6. 1方法进行稀释与涂布 。

　　9. 2. 2 未显症状的可疑组织

　　用灭菌的剪 刀 剪 成 2 mm × 7 mm 大 小 的 小 块 , 放 入 S-PG 和 CCNT 平 板 中 , 滴 入 2~ 3 滴 (约0. 2 mL)的生理盐水 ,放置 5 min~ 10 min,让细菌从这些组织中渗出 。

　　9. 2. 3 有明显症状的叶片

　　从叶片损伤部位的前端切下 2 mm×7 mm 片段 。将其放入 70%的乙醇中 15 s~ 30 s,消毒叶片组织 。在试管中用灭菌蒸馏水清洗叶片 2~ 3 次后放入 S-PG 和 CCNT平板上 。

　　10 培养分离

　　接种后的平皿 28 ℃ ±1 ℃培养 3 d后观察生长菌落形态 , 细菌性谷枯病菌在 S-PG 上呈现两种生长形态 ,一种菌落为红褐色 、圆形 、光滑 、隆起 ;另一种菌落为淡紫色 、圆形 、光滑 、隆起 。细菌性谷枯病菌在 CCNT上产生带有黄色扩散性色素的白色菌落 。

　　用接种环从平板中挑选 5个以上生长典型或疑似菌落 ,接种到改良 SPA 蛋白胨培养基培养纯化 ,以进行进一步生化鉴定试验 ,也可以采用 BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定 。对疑似菌落也可以采用PCR方法进行初筛 ,或者采用水稻细菌性谷枯病菌的 ELISA试剂盒进行初步筛选(具体检测方法参照试剂盒说明手册) , 阳性结果再继续通过生化鉴定做进一步证实 。

　　11 PCR筛选试验

　　从分离培养的细菌菌株中提取 DNA作为模板 ,进行 PCR 检测和电泳分析 。用水稻细菌性谷枯病标准菌株基因组 DNA作为阳性对照 ,用不含有水稻细菌性谷枯菌株的植物组织材料或其他植物病原菌基因组 DNA 为阴性对照 ,用双蒸水作空白对照 ,进行 PCR扩增 。将扩增产物进行琼脂糖电泳分析 。

　　将分离得到的可疑菌落接种 SPA斜面 . 培养 24h~48h后用无菌水洗下斜面上生长的菌苔 ,制成菌悬液 。使用制备好的菌悬液进行分子生物学鉴定 ,具体操作过程见附录 C。若测试菌株的 PCR产物与阳性对照分子量一致 ,继续进行生化鉴定试验 。

　　12 生理生化鉴定

　　12. 1 初步鉴定

　　挑取分离培养得到的符合特征的典型或可疑菌落分别进行氧化酶试验 、过氧化氢酶试验 、革兰氏染色和鞭毛染色 观 察 。 氧 化 酶 阴 性 , 过 氧 化 氢 酶 阳 性 , 革 兰 氏 染 色 阴 性 , 极 生 一 至 多 条 鞭 毛 , 大 小 为(0. 5μm~0. 7 μm) × (1. 5 μm~ 2. 5 μm) ,符合以上试验结果的菌落需进行以下生化鉴定实验(水稻细

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　　菌性谷枯病菌生化鉴定原理及相关资料参见附录 A) 。

　　12. 2 硝酸盐还原试验

　　28 ℃ ±1 ℃培养 48h后的菌悬液中加入硝酸盐还原试剂 ,观察颜色反应 , 细菌性谷枯病菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐 ,颜色变红 。

　　12. 3 明胶液化

　　挑取纯化后菌落穿刺接种琼脂培养物后 ,28 ℃ ±1℃培养 48h后 ,观察结果 ,细菌性谷枯病菌能水解明胶 。

　　12. 4 O-F试验

　　以接种针挑取小量纯培养物做穿刺接种 , 同时接种两管 O-F葡萄糖利用培养基 ,其中一支接种后滴加灭菌石蜡于表面 ,于 28 ℃ ±1 ℃培养 48 h 后 ,判定结果 。水稻细菌性谷枯病菌属于氧化型 ,在开口管中产酸培养基变黄色 ,在封口管中不产酸培养基不变色 。

　　12. 5 产荧光素试验

　　挑取菌落划线于金氏 B培养基 ,28℃ ±1℃培养 72h后 ,在紫外灯下观察 ,细菌性谷枯病菌为不产荧光的阴性反应 。

　　12. 6 精氨酸双水解酶试验

　　挑取菌落划线接种到精氨酸实验用培养基中 ,28 ℃ ±1℃培养 48h后观察培养基颜色变化 。细菌性谷枯病菌呈阴性反应 ,培养基变成黄色 。

　　12. 7 葡萄糖酸盐氧化试验

　　较大量地接 种 菌 落 于 葡 萄 糖 酸 盐 培 养 基 中 , 于 28 ℃ ± 1 ℃培 养 48 h, 加 Benedict氏 定 性 试 剂1 mL,充分摇匀 ,置沸水中加热 10min,待 15min~ 30min, 出现黄色 ~茶色 ~橙红色沉淀为阳性反应 ,仍保持蓝或蓝绿色为阴性 。水稻细菌性谷枯病菌为阴性反应 。

　　12. 8 淀粉水解试验

　　挑取菌落点接种于淀粉琼脂平板 ,于 28 ℃ ±1 ℃培养 48h后 ,滴浸试剂于培养物表面 。 即刻观察结果 。 阳性反应为琼脂培养基呈深蓝色 、菌落或培养物周围出现无色透明环 , 阴性反应则整个平板呈深蓝色 ,菌落或培养物周围无透明环 。水稻细菌性谷枯病菌可水解淀粉 ,呈阳性反应 。

　　12. 9 海藻糖利用试验

　　挑取纯培养菌落穿刺接种于海藻糖半固体培养基 ,置 28 ℃ ± 1 ℃培养 1 d~ 2 d, 观察培养基有无颜色变化 。细菌性谷枯病菌可利用海藻糖 ,培养基颜色由橄榄绿色变成黄色 。

　　12. 10 纤维糖利用试验

　　实验步骤同 12. 9海藻糖利用试验 。细菌性谷枯病菌可利用纤维糖 ,培养基变成黄色 。

　　13 BIOLOG鉴定试验

　　实验方法参照 BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定 。

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　　14 致病性测定

　　如有需要 ,可进一步进行致病性测试 。

　　供试水稻植株采用易感品种 。用灭菌棉签蘸取在 SPA 培养基上培养 48 h 的菌落 ,转接于灭菌水中制备成 107 CFU/mL~ 108 CFU/mL 的菌悬液 ,接种 0. 5 mL于分蘖期前的禾苗 ,接种 3~ 5 株 , 同时接种阳性菌液和灭菌水做为阳性和阴性对照 , 2 周后观察禾苗生长情况 ,典型病征为叶鞘变褐色 , 叶片发白 ,芽鞘卷曲 ;或接种 1. 0 mL于孕穗期的水稻 ,接种 3~ 5 株 , 同时接种阳性菌液和灭菌水做为阳性和阴性对照 ,3~4周后观察生长情况 ,水稻齐穗后乳熟期的绿色穗直立 ,染病谷粒初现苍白色似缺水状萎凋 ,渐变为灰白色至浅黄褐色 ,病粒内外颖变色 , 内外颖的先端或基部变成紫褐色 ,护颖也呈紫褐色 。谷粒枯死 ,稻穗呈直立状而不弯曲 ,多为不稔 ,若能结实多萎缩畸形 ,谷粒一部分或全部变为灰白色或黄褐色至浓褐色 ,病部与健部界线明显 。病粒多时 ,穗头上翘而不下垂 。

　　15 结果报告

　　样品中未分离到典型菌落及疑似菌落 ,PCR结果阴性或 ELISA 检测阴性的 ,相关生化鉴定不符合水稻细菌性谷枯病菌的生理及生化特征 ,报告为 :未检出细菌性谷枯病菌 。

　　从样品中分离到典型及疑似菌落 ,PCR检测阳性或 ELISA检测结果阳性 ,并通过生化鉴定符合水稻细菌性谷枯病菌生理及生化特征的 , 或 BIOLOG 实验结果为阳性的 ,报告为 : 检出水 稻 细 菌 性 谷 枯病菌 。

　　必要时可进行致病性测定 。

　　16 样品及分离物的保存

　　保存样品由鉴定人标识确认 、样品管理员登记 ,进行防虫处理后 , 阴性样品于阴凉干燥 、防虫防鼠处妥善保存 6个月 。对检出水稻细菌性谷枯病菌的样本和分离菌株应在生物安全措施下至少保存 1 年 ,有特殊需求保存期可适当延长 。保存期满 ,经灭活后妥善处理 。

　　分离菌 株 接 种 于 SPA 斜 面 上 培 养 , 4 ℃下 可 保 存 几 周 。 菌 株 在 10% ~ 20%甘 油 中 或 冻 干 , 在-80 ℃条件下可长期保存 。

　　17 处理及生物安全措施

　　对检出水稻细菌性谷枯病菌的样品及其分离菌株 、检测过程中的废弃物 ,需经有效的除害处理方式处理 , 以防止对环境的扩散 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　水稻细菌性谷枯病菌其他信息

　　A. 1 分布

　　亚洲 : 日本 、韩国 、印度尼西亚 、泰国 、马来西亚 、菲律宾 、斯里兰卡 、越南 、中国台湾 ;拉丁美洲 :哥伦比亚 。

　　A. 2 寄主范围

　　水稻 (Oryza sativa L) 、须 芒 草 (Andropogon gayanus Kunth) 、野 古 草 [(Arundinella hirta (Thunb. )C. Tanaka)] 、毛颖草(Beckmanniasyzigachne var. hirsutiflora. ) 、薏苡(Coix lacroyma-jobi L. var. ma-yuen(Roman. )Stapf) 、弯叶画眉草(Eragrostiscurvula(shrad. ) Nees) 、多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam) 、洋 野 黍(Panicum dichotomiflorum) 、大 黍(Panicum maximum Jacq) 、毛 花 雀 稗(Paspalum dilatatum Poir) 、狼尾草(Pennisetumalopecuroides) 、梯牧草(Phleum pratense Linn. ) 、芦苇(Phragmitesaustralis) 、狗尾草[Setariaviridis(L. )Beauv] 、燕麦(Avena sativa L) 和 黑 麦(Secale cereale L)等 。

　　A. 3 症状

　　抽穗期病穗田间呈块状分布 , 稻粒呈褐色 ,谷粒病健部有一明显的棕色界限 。病种在育苗箱中培养 ,常成块状腐败 、枯死 ,轻的僵苗不发 . 叶鞘变褐色 , 叶片发白 ,芽鞘卷曲 ,故称苗腐 、苗枯 。

　　水稻齐穗后乳熟期的绿色穗直立 ,染病谷粒初现苍白色似缺水状萎凋 ,渐变为灰白色至浅黄褐色 ,病粒内外颖变色 , 内外颖的先端或基部变成紫褐色 ,护颖也呈紫褐色 。 每个受害穗染病谷粒 10~ 20粒左右 ,发病重的一半以上谷粒枯死 ,受害严重的稻穗呈直立状而不弯曲 , 多为不稔 ,若能结实多萎缩畸形 ,谷粒一部分或全部变为灰白色或黄褐色至浓褐色 ,病部与健部界线明显 。病粒多时 ,灌浆期穗头上翘而不下垂 。瘪粒增加,品质下降 ;重的开花后稻粒变褐 、枯死 ,减产很多 。

　　A. 4 生理生化特性

　　水稻细菌性谷枯病菌(B. glumae) 为 阴 性 杆 菌 , 大 小(0. 5 μm~ 0. 7 μm) × (1. 5 μm~ 2. 5 μm) , 1~ 7根极鞭 ,好气性 ,有荚膜 ,不形成芽孢 。 在 NA 培养基上菌落生长慢 , 圆形 、隆起 、光滑 、灰白色 ; 在PDA培养基上菌落小 ,黄乳白色 ;在 KB培养基上不产生荧光 。 明胶液化 , 吐温-80水解 , 牛乳凝固 ,石蕊还原 ,硝酸还原 ,过氧化氢酶和卵磷脂酶阳性 ;但不水解熊果苷和七叶苷 ,不产生吲哚及硫化氢 ,淀粉水解在不同菌系间有变化 ,氧化酶 、酪氨酸酶 、精氨酸双水解酶 、苯丙氨酸脱氨酶都是阴性反应 。从阿拉伯糖 、果糖 、半乳糖 、葡萄糖 、甘油 、甘露醇 、甘露糖 、山梨醇和木糖产酸 ,利用乳糖和棉籽糖产酸的能力在不同菌系间有变化 ,从糊精 、菊粉 、麦芽糖 、鼠李糖 、水杨苷和蔗糖不产酸 。 4%NaCl或 5 μm 氯霉素能抑制生长 , 生 长 最 适 pH 6. 0~ 7. 5, 最 适 生 长 温 度 为 28 ℃ , 最 高 生 长 温 度 在 40 ℃ , 最 低 温 度 为8 ℃ ~ 12 ℃ ,致死温度50 ℃ ~ 52 ℃ 。

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　　A. 5 发病条件

　　播种带菌病谷粒 ,遇有适宜的发病条件 , 即抽穗期高温多 日照 , 降雨量小易发病 。病菌可通过气孔和伤口侵入 ,病菌在植株体内繁殖 ,在细胞间扩散 ,引起叶鞘薄壁组织的分解 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　培养基及试验方法

　　B. 1 S-PG选择性培养基

　　B. 1. 1 成分

　　K2 HPO3 1. 3 g

　　Na2 HPO3 1. 2 g

　　(NH4 ) 2SO4 5. 0 g

　　MgSO4 · 7H2 O 0. 25 g

　　NaMoO4 · 2H2 O 24 mg

　　EDTA-Fe 10 mg

　　D-山梨醇 10 g

　　甲基紫 1 mg

　　苯酚红 20 mg

　　琼脂 18~ 20 g

　　蒸馏水 1 000. 0 mL

　　L-胱氨酸(1mg/100mL) 1 mL

　　非奈西林(5g/100mL) 1 mL

　　氨苄青霉素(1g/100mL) 1 mL

　　氯化十六烷基三甲铵(1g/100mL) 1 mL

　　B. 1. 2 配制方法

　　将除 L-胱氨酸 、非奈西 林 、氨 苄 青 霉 素 、氯 化 十 六 烷 基 三 甲 胺 以 外 的 成 分 充 分 溶 解 , 121 ℃灭 菌15 min。使用前再添加已过滤除菌的四种溶液 。

　　B. 2 CCNT选择性培养基

　　B. 2. 1 成分

　　酵母浸膏

　　2 g

　　高聚蛋白胨

　　1 g

　　肌醇

　　4 g

　　氯化十六烷基三甲铵

　　10 mg

　　氯霉素

　　10 mg

　　新生霉素

　　1 mg

　　百菌清

　　100 mg

　　琼脂

　　18 g

　　蒸馏水

　　1 000 0 mL

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　　B. 2. 2 配制方法

　　将除新生霉素以外的其余成分充分溶解 ,调 pH值至 4. 8, 121 ℃灭菌 15 min。使用前添加已过滤除菌的新生霉素溶液 。

　　B. 3 SPA培养基

　　B. 3. 1 成分

　　蛋白胨 5. 0 g

　　蔗糖 20. 0 g

　　K2 HPO4 0. 5 g

　　MgSO4 · 7H2 O 0. 25 g

　　琼脂 17. 0g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B. 3. 2 配制方法

　　pH 7. 2~ 7. 4,121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B. 4 0. 001%吐温 20-磷酸盐缓冲液

　　B. 4. 1 成分

　　KH2PO4 0. 2 g

　　Na2 HPO4 · 12H2 O 2. 9 g

　　NaCl 8. 0 g

　　KCl 0. 2 g

　　吐温-20 0. 01 mL

　　水 1 000 mL

　　pH 7. 4

　　B. 4. 2 制法

　　溶解各成分 ,调节 pH值 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B. 5 革兰氏染色法

　　B. 5. 1 结晶紫染色液

　　结晶紫 1 g

　　95%乙醇 20 mL

　　1%草酸铵水溶液 80 mL

　　将结晶紫溶解于乙醇中 ,然后与草酸铵溶液混合 。

　　B. 5. 2 革兰氏碘液

　　碘 1 g

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　　碘化钾 2 g

　　蒸馏水 300 mL

　　将碘与碘化钾先进行混合 ,加入蒸馏水少许 ,充分振摇 ,待完全溶解后 ,再加蒸馏水至 300 mL。

　　B. 5. 3 沙黄复染液

　　沙黄 0. 25 g

　　95%乙醇 10 mL

　　蒸馏水 90 mL

　　将沙黄溶解于乙醇中 ,然后用蒸馏水稀释 。

　　B. 5. 4 染色法

　　B. 5. 4. 1 将涂片在火焰上固定 ,滴加结晶紫染色液 ,染 1 min,水洗 。

　　B. 5. 4. 2 滴加革兰式染液 ,作用 1 min,水洗 。

　　B. 5. 4. 3 滴加 95%乙醇脱色 ,约 30 s;或将乙醇滴满整个涂片 ,立即倾去 ,再用乙醇滴满整个涂片 ,脱色 10 s。

　　B. 6 鞭毛染色法

　　B. 6. 1 染色液的配制

　　B. 6. 1. 1 甲液 :称单宁酸 5 g氯化高铁(FeCl3 )1. 5 g,溶于 100mL蒸馏水中 ,待溶解后加入 1%的氢氧化钠溶液 1 mL和 15%的甲醛溶液 2 mL。

　　B. 6. 1. 2 乙液 :称 2 g硝酸银溶于 100 mL蒸馏水中 。在 90 mL 乙液中滴加浓氢氧化铵溶液 , 到出现沉淀后 ,再滴加使其变为澄清 ,然后用其余 10 mL 乙液小心滴加至澄清液中 , 至出现轻微雾状为止(此为关键性操作 ,应特别小心) 。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时 ,要边滴边充分摇荡 ,染液在染色当天配制 。

　　B. 6. 2 染色法

　　在风干的载玻片上滴加甲液 ,4 min~ 6 min后 ,用蒸馏水轻轻冲洗 。再加乙液 ,缓缓加热至冒汽 ,维持约 30 s(加热时注意勿使出现干燥面) 。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色 ,停止加热,用水冲净 ,干后镜检 ,菌体及鞭毛为深褐色到黑色 。

　　B. 7 营养明胶

　　B. 7. 1 成分

　　蛋白胨

　　5 g

　　牛肉膏

　　3 g

　　明胶

　　120 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　pH 6. 8~ 7. 0

　　B. 7. 2 制法

　　加热溶解 、校正 pH 7. 4~ 7. 6,分装小管 ,121 ℃高压灭菌 10 min,取出后迅速冷却 ,使其凝固 。 复查最终 pH应为 6. 8~ 7. 0。

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　　B. 7. 3 试验方法

　　用琼脂培养物穿刺接种 ,每天取出 ,置冰箱内 30 min后再观察结果 ,记录液化时间 。

　　B. 8 氧化酶试验

　　B. 8. 1 试剂

　　B. 8. 1. 1 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液 :少量新鲜配制 ,于冰箱内避光保存 。

　　B. 8. 1. 2 1%α-萘酚-乙醇溶液 。

　　B. 8. 2 试验方法

　　B. 8. 2. 1 取白色洁净滤纸沾取菌落 。加盐酸二甲基对本二胺溶液一滴 , 阳性者呈现粉红色 ,并逐渐加深 ;再加 α-萘酚溶液一滴 , 阳性者于 30 s 内呈现鲜蓝色 。 阴性于 2 min内不变色 。

　　B. 8. 2. 2 以毛细吸管吸取试剂 ,直接滴加于菌落上 ,其显色反应与以上相同 。

　　B. 9 硝酸盐培养基

　　B. 9. 1 培养基

　　KNO3

　　0. 2 g

　　蛋白胨

　　5 g

　　蒸馏水pH 7 4

　　1 000 mL

　　B. 9. 2 制法

　　溶解 ,校正 pH ,分装试管 ,每管约 5 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B. 9. 3 硝酸盐还原试剂

　　B. 9. 3. 1 甲液 :将对氨基苯磺酸 0. 8 g溶解于 2. 5 mol/L乙酸溶液 100 mL 中 。

　　B. 9. 3. 2 乙液 :将甲萘胺 0. 5 g溶解于 2. 5 mol/L乙酸溶液 100 mL 中 。

　　B. 9. 4 试验方法

　　接种后在 28 ℃ ±1 ℃培养 48h,加入甲液和乙液各一滴 ,观察结果 。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色 。

　　B. 10 过氧化氢酶试验

　　B. 10. 1 试剂

　　3%过氧化氢溶液 : 临用时配制 。

　　B. 10. 2 试验方法

　　挑取固体培养基上菌落一接种环 ,置于洁净试管内 ,滴加 3%过氧化氢溶液 2 mL,观察结果 。

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　　B. 10. 3 结果

　　于 30 s 内发生气泡者为阳性 ,不发生气泡者为阴性 。

　　B. 11 O-F葡萄糖利用培养基及配制

　　B. 11. 1 培养基

　　蛋白胨 2. 7 g

　　NaCl 5. 0 g

　　0. 2%溴麝香酚蓝 0. 03 g

　　琼脂 3 g

　　KH2PO4 0. 3 g

　　葡萄糖 10. 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B. 11. 2 配制

　　以上成分除糖外 ,溶解调 pH 7. 2,121 ℃高温灭菌 20 min后备用 。

　　B. 11. 3 结果

　　见表 B. 1。

　　表 B. 1

　　反应类型

　　封口的培养基

　　开口的培养基

　　发酵型(F)

　　产酸

　　产酸

　　氧化型(O)

　　不变

　　产酸

　　产碱型(A)

　　不变

　　不变

　　B. 12 葡萄糖酸盐氧化试验

　　B. 12. 1 培养基

　　蛋白胨

　　1. 5 g

　　酵母浸膏

　　1. 0 g

　　K2 HPO4

　　1. 0 g

　　葡萄糖酸钾

　　40. 0 g

　　水

　　1 000 mL

　　将各成分溶化于 1 L水中 ,调至 pH 7. 0,分装小试管 ,每管 2 mL,于 116 ℃灭菌 15 min。

　　B. 12. 2 试剂

　　Benedict氏定性试剂

　　(1)柠檬酸钠 1. 73 g

　　Na2CO3 10. 0 g

　　12

　　GB/T 29396—2012

　　蒸馏水 60. 0mL

　　(2)CuSO4 · 5H2 O 1. 73 g

　　蒸馏水 20 mL

　　将溶液(1)缓慢加入于溶液(2)中 , 随加随即时振摇 ,使充分混匀 。最后加水补足至 100 mL。

　　B. 13 精氨酸双水解酶试验用培养基(AD)

　　B. 13. 1 培养基

　　酵母浸膏 3. 0 g

　　葡萄糖 1. 0 g

　　NaCl 30. 0 g

　　精氨酸 5. 0 g

　　溴甲酚紫 0. 016 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B. 13. 2 配制方法

　　除溴甲酚 紫 外 , 将 各 成 分 加 入 蒸 馏 水 中 , 搅 拌 均 匀 , 静 置 约 10 min, 加 热 至 完 全 溶 解 , 调 制pH 6. 7±0. 1。分装于 10 mm×100 mm 试管 ,每管 1 mL。 121 ℃高压灭菌 10 min。灭菌后应立即取出放凉 ,接种培养后 ,培养基颜色变为深紫色的为阳性反应 ,变为黄色的 ,为阴性反应 。

　　B. 14 淀粉水解实验

　　B. 14. 1 培养基

　　蛋白胨 5. 0 g

　　牛肉浸膏 3. 0 g

　　NaCl 5. 0 g

　　琼脂 15. 0 g

　　可溶性淀粉 3. 0 g

　　水 1 000 mL

　　B. 14. 2 配制方法

　　将前 4种成分加热溶化于 500mL水中 ,另将淀粉溶于 250mL水中 ,将两液混合 、补加水至 1 L、调至 pH 7. 0,于 115 ℃灭菌 15 min。

　　B. 14. 3 试剂

　　称取碘片 1. 0 g 和碘 化 钾 2. 0 g,放 烧 瓶 中 , 加 少 量 水 、以 玻 棒 研 磨 , 使 碘 片 完 全 溶 解 , 再 加 水 至300 mL,移装棕色试剂瓶中 ,保存于冰箱 ,避免光线照射 。

　　B. 15 糖利用试验

　　B. 15. 1 培养基

　　牛肉浸膏 3. 0 g

　　13

　　GB/T 29396—2012

　　蛋白胨

　　10. 0 g

　　NaCl

　　5. 0 g

　　溴百里酚蓝(0. 2%)

　　4. 0 mL

　　糖类

　　10. 0 g

　　琼脂

　　4. 0~ 6. 0 g

　　水

　　1 000 mL

　　B. 15. 2 配制方法

　　加水溶解 ,调至 pH 7. 0±0. 2后 ,再加入溴百里酚蓝和糖 ,分装成小试管 ,于 121 ℃灭菌 15 min。

　　14

　　GB/T 29396—2012

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　水稻细菌性谷枯病菌的 PCR检测方法

　　C. 1 试剂及配方

　　C. 1. 1 DNA抽提液配方

　　1 00 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0 100 mmol/L EDTA

　　250 mmol/L NaCl 100 μg/mL蛋白酶 K

　　C. 1. 2 CTAB沉淀液配方

　　1%CTAB(质量浓度)(十八烷基三乙基溴化铵)

　　50 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0

　　10 mmol/L EDTA,pH 8. 0

　　C. 1. 3 TE 缓冲液配方

　　10 mmol/LTris-HCl,pH 8. 0

　　1 mmol/LEDTA,pH 8. 0

　　C. 1. 4 TAE 电泳缓冲液(pH 8. 5)配方(50× )

　　Tris 242 g 冰乙酸 57. 1 mL

　　Na2EDTA · 2H2 O 37. 5 g 蒸馏水 1 000 mL

　　C. 1. 5 10× 电泳上样缓冲液(pH 8. 5)配方

　　20%(质量浓度)Ficoll400 1. 9%(质量浓度)SDS

　　

　　0. 1 mol/LNa2EDTA(pH 8. 0)

　　0. 25%(质量浓度)溴酚蓝

　　C. 2 细菌 DNA 的提取

　　将制备好的菌悬液移至一干净灭菌的离心管中 ,12000 r/min离心 15min,弃上清液 。在沉淀中加入 TE缓冲液 5 mL,10%SDS溶液 300μL。20mg/mL蛋白酶 K30μL,混匀 ,37℃水浴孵育 1 h。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24 ∶ 1) , 混匀 。 10 000 r/min离心 5 min,将上清液移至一个新离心管中 。加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) ,混匀 , 10 000 r/min离心 5 min,将上清液移至一新离心管 。加入 0. 6倍体积的异丙醇 ,轻轻混匀 ,10 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ,管中加入 70%乙醇洗涤沉淀 , 晾干 ,加入 50 μLTE缓冲液溶解 DNA沉淀 , -20 ℃长期保存 。

　　注 : 此步骤可省略 。可直接用培养的菌株稀释成 ≥105 CFU/mL 的菌悬液做模板进行定性 PCR检测 。

　　C. 3 定性 PCR检测

　　C. 3. 1 引物信息

　　根据水稻细菌性谷枯病菌的 16S-23SrDNA间隔区序列(ITS)以及编码 DNA促旋酶 β亚基的 gyrB

　　GB/T29396—2012

　　GB T 29396 2012

　　— /

　　基因 ,分别设计了 BGF1-R1、BGF3-R3两对引物 ,操作时可任选其中一对 。

　　C. 3. 2 PCR反应体系

　　C. 3. 2. 1 检测水稻细菌性谷枯病菌采用的 PCR 引物序列见表 C. 1。

　　表 C. 1 检测水稻细菌性谷枯病菌的 PCR 引物

　　引物名称

　　引物序列

　　PCR产物大小bp

　　BGF1

　　正向引物 :5’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’

　　395

　　BGR1

　　反向引物 :5’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’

　　BGF3

　　正向引物 :5’-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3’

　　317

　　BGR3

　　反向引物 :5’-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3’

　　C. 3. 2. 2 检测水稻细菌性谷枯病菌采用的 PCR反应体系见表 C. 2。

　　表 C. 2 检测水稻细菌性谷枯病菌的 PCR反应体系

　　组 成

　　加样体积μL

　　10×PCR缓冲液(M2+ ffre)

　　2

　　氯化镁(25 mmol/μL)

　　1. 6

　　dNTP(10 mmol/μL)

　　0. 4

　　TaqDNA聚合酶(1U/μL)

　　0. 7

　　正向引物(10 pmol/μL)

　　1. 5

　　反向引物(10 pmol/μL)

　　1. 5

　　模板 DNA(1ng/μL~ 10 ng/μL)

　　5

　　双蒸水

　　7. 3

　　总体积

　　20

　　C. 3. 3 PCR反应循环参数

　　96 ℃预变性 5 min;96℃ ,30s;55℃ ,30s;72℃ ,30 s,进行 30个循环;72℃延伸 5 min;4℃保存 。

　　C. 3. 4 PCR扩增产物的检测

　　用 TAE 电泳缓冲液制备 2%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR产物 ,将混有上样缓冲液的 PCR扩增产物加至样品孔中 ,用 DNA Maker做相对分子质量的标记 ,进行电泳分析 , 电泳结束后 ,在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带 ,拍摄并记录实验结果 。