GB/T 29397-2012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 29397—2012

　　香蕉枯萎病菌 4 号小种检疫检测与鉴定

　　Detection and identification ofFusarium oxysporum

　　f. sp. Cubense(E. F. Smith) Snyder& Hansen Race4

　　2012-12-31发布 2013-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 29397—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 :全国农业技术推广服务中心 、广东省植物检疫站 、华南农业大学 。

　　本标准主要起草人 :王玉玺 、王琳 、吴立峰 、姜子德 、李敏慧 、任小平 、李小妮 、吴仕豪 。

　　Ⅰ

　　GB/T 29397—2012

　　香蕉枯萎病菌 4 号小种检疫检测与鉴定

　　1 范围

　　本标准规定了香蕉枯萎病菌 4号小种[Fusarium oxysporum f. sp. Cubense(E. F. Smith)Snyder & Hansen Race4]的现场检验和实验室检测鉴定以香蕉枯萎病菌 4号小种的为害症状 、病原菌形态 、致病性测定结果 、Komada改良培养基上的菌落性状和寄主范围为依据 , 明确了现场查验 、实验室鉴定 、菌种保存的方法 。

　　本标准适用于香蕉(包括香蕉 、大蕉 、粉蕉等香蕉枯萎病菌 4号小种易感品种)生长期间的香蕉枯萎病菌 4号小种的检测 。

　　2 原理

　　根据香蕉枯萎病菌 4号小种的为害症状 ,取病健部交界组织分离培养病原菌 ,根据病原菌形态 、致病性测定结果 、疑似病菌在 Komada改良培养基上的菌落性状进行判定 。

　　3 仪器、用具及药品

　　3. 1 仪器、用具

　　仪器 :超净工作台 、培养箱 、光学显微镜 、高压灭菌 、照相机等 。

　　用具 :铲 、枝剪 、砍刀 、纸袋 、油性笔 、记录本 、标签纸 、小刀片 、培养皿 、载玻片 、盖玻片 、镊子 、挑针 、酒精灯等 。

　　3. 2 药品

　　0. 1%升汞 、70%乙醇 、无水乙醇 、灭菌水 、去离子水 、40%甘油 、磷酸氢二钾 、氯化钾 、7 水硫酸镁 、乙二胺四乙酸铁钠 、L-天门冬酰胺 、半乳糖 、琼脂粉 、75%五氯硝苯可湿性粉剂 、牛胆粉 、硼砂 、硫酸链霉素 、 10%磷酸等 。

　　4 现场查验

　　4. 1 现场调查

　　4. 1. 1 调查范围

　　香蕉种植地及香蕉试管苗二级苗生产和销售场地 。

　　4. 1. 2 调查方法

　　对香蕉枯萎病菌 4号小种的寄主植物进行踏查 ,观察其生长状况 ; 向香蕉种植者和管理人员询问 ,确定疑似香蕉枯萎病菌 4号小种为害的田块 ,对疑似田块进行现场检验 。

　　4. 1. 3 症状识别

　　对地上部表现症状的植株 ,剖开其根部和假茎部维管束组织 ,观察是否发生颜色变化 。

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　　对地上部无明显症状的植株 , 随机抽取部分植株 ,观察其根部及假茎部位维管束组织是否发生颜色变化 。

　　症状表现参见附录 A。

　　4. 2 样本的采集

　　采样前需对取样现场及病害症状拍照 。

　　疑似病株的取 样 应 选 取 症 状 典 型 、中 等 发 病 程 度 的 植 株 , 取 样 部 位 包 括 蕉 头 病 健 部 交 界 组 织(8cm×8 cm) 、根 、假茎(长 20 cm) 、叶柄 ;对二级苗应取整个植株 ,所有样品采用坚韧纸质材料包裹 ,切勿采用塑料薄膜包裹 。样品应附上采集时间 、地点 、品种的记录和田间照片 。采样后填写附录 B。

　　5 实验室检测鉴定

　　5. 1 病原菌的分离与培养

　　取病健部交界组织 ,切成小块(2 mm×3 mm) ,将小块组织先放于 70%乙醇溶液中浸 5 s、再转入0. 1%升汞溶液中浸泡 1 min~ 2 min进行消毒处理 ,然后用灭菌水漂洗 3 次 ;将消毒处理和漂洗后的小块组织置于 PDA或 PSA平板上恒温(25℃)培养 ,菌落白色絮状 ,基质淡紫或淡紫红色 ;培养 5 d~ 7 d可产生大量小型分生孢子 ,培养 10 d~ 15 d 可产生少量大型分生孢子 , 培养 30 d 后有厚垣孢子形成 。结果符合附录 A形态描述的 ,可继续按 5. 2 的方法进行病原菌致病性测定 。

　　5. 2 病原菌致病性测定

　　采用伤根浸菌接种法 。将 4~ 5 叶期健康组培香蕉苗(巴西蕉或广东香蕉 2 号) 自沙床中拔出 ,然后用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子 ,再分别浸在配制好的各分离菌株孢子悬浮液中(孢子浓度不低于 1×105个/mL) , 以清水做对照 ,30 min后移栽到盛有灭菌细沙的营养杯 ,置于温室(25 ℃ ~ 32 ℃) ,15 d~ 20 d后观察结果 。罹病蕉苗如表现出附录 A 的症状 。对病株进行组织分离 ,应得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌 。按照柯赫氏法则 ,可初步确定该病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型 4号小种 。

　　5. 3 在 Komada改良培养基上的菌落性状

　　5. 3. 1 Komada改良培养基的配制

　　融化 900 mL基 本 培 养 基[磷 酸 氢 二 钾 , 1 g;氯 化 钾 , 0. 5 g;硫 酸 镁 , 0. 5 g; 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 钠 , 0. 01 g;L-天门冬酰胺 ,2 g;半乳糖 ,10 g;琼脂粉 , 16 g;去离子水定容至 900 mL,高压灭菌] ,在无菌操作下与 100 mL 的盐溶液(5%五氯硝苯可湿性粉剂 ,0. 9 g;牛胆粉 ,0. 45 g;硼砂 , 0. 5 g;硫酸链霉素 , 0. 3 g;用 10%磷酸调 pH值到 3. 8±0. 2)混合 ,倒平板 。

　　5. 3. 2 Komada改良培养基上菌落特征

　　将经 5. 1测定的疑似病菌的单孢分离菌株接于 Komada改良培养基平板上 ,25℃ 、40W 普通 日光灯相距约 30 cm 照射下培养 10d后观察菌落性状 ,4号小种的菌落边缘为裂齿状 ,而 1 号小种及其他的

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　　镰刀菌的菌落边缘则平滑 ,如图 1。

　　图 1 1 号和 4 号小种在 Komada改良培养基上的菌落形态(左图为 4 号小种 ,右图为 1 号小种。)

　　6 结果判定

　　根据病原菌的形态学 、致病性测定 ,及疑似病菌在 Komada改良培养基上菌落边缘出现齿状的特征 ,按照柯赫氏法则可确定该病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型 4号小种 。

　　将实验室检测鉴定结果填入《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录 C) 。

　　7 菌种的保存

　　对判定为香蕉枯萎病菌 4号小种的菌株进行标注 ,包括菌株来源 、寄主的品系 、采集时间 、采集人和鉴定人 ,并将菌株移至 40%甘油管保存在 -80℃冰箱 ; 或将菌株培养在试管斜面上 ,长满后存于 4 ℃冰箱 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　香蕉枯萎病菌基本信息

　　A. 1 分类

　　香蕉枯萎病菌 Fusarium oxysporun f. sp. Cubense (E. F. Smith) Snyder & Hansen隶属半知菌门Deuteromycotina、丝孢纲 Hyphomycetes、瘤座菌 目 Tuberculariales,镰刀菌属 Fusarium,尖 孢 镰 刀 菌古巴专化型 Fusarium oxysporium f. sp. Cubense。至今共发现有 4个生理小种 ,其中 4 号小种是 1967年首先在我国台湾省报道的一个小种 ,能侵染 “大蜜啥 ”、矮香蕉 Dwarf Cavendish(AAA) 、台湾拉屯旦Taiwan Latundan(AAB) 、Pisang Lilin( AA) 、棱 香 蕉 和 野 蕉 (BB) , 尤 其 能 侵 染 较 抗 病 的 香 牙 蕉Cavendish(AAA) ,毁灭性最大 。

　　A. 2 为害症状

　　A. 2. 1 外部症状

　　该病菌侵染香蕉根系和球茎 ,堵塞输导组织 ,使罹病植株表现黄叶症状 。植株感病早期无明显外部症状 ,染病一段时间后 ,病害先从下部较老的叶片开始发生 ,发病初期叶片边缘变黄并逐渐扩展至主脉 ,病叶叶柄在靠近叶鞘处容易折曲 、下垂 ,后期病叶凋萎后倒挂在假茎旁 ,直至全株枯死 ;有时假茎基部开裂 。若是假植的组培苗染病 ,其叶片褪绿 、无光泽 ,呈黄绿色或局部甚至整叶黄化 ;严重时整个假茎全部变为褐色 ,部分根变褐腐烂 。

　　A. 2. 2 内部症状

　　横切罹病香蕉植株的球茎部 ,可见维管束组织变成红褐色或暗褐色 。纵剖病株球茎 ,可看到红褐色至暗褐色病变的维管束成线条状 ,近茎基部颜色深 ,病变一直延伸到球茎部 ,根系变黑褐色而干枯 。若为假植组培苗 ,纵剖罹病小苗的假茎则可见褐色至红褐色的坏死斑点 。

　　A. 3 病原菌形态(引自 Nelson P. E, etal, 1983)

　　香蕉枯萎病菌可产生 3种形态的无性分生孢子— 大孢子 ,小孢子 ,厚垣孢子 。大孢子镰刀形或纺锤形 , 具 3 ~ 5 个 隔 膜 , 顶 端 细 胞 呈 尖 刀 状 或 钩 状 , 脚 细 胞 明 显 , 壁 薄 , ( 22 μm ~ 36 μm) × (4μm~ 5 μm) ;小孢子生 于 瓶 梗 状 的 产 孢 细 胞 上 , 圆 形 或 椭 圆 形 至 肾 形 , 具 0~ 1 个 隔 膜 , 壁 薄 , (5 μm~ 7 μm) × (2. 5 μm~ 3 μm) ,在人工培养基上很容易见到 。厚垣孢子圆形 ,壁厚 , 间生或顶生于菌丝上 ,多单生 ,9 μm×7 μm ,可在土壤中存活达 3 年 ~ 5 年(见图 A. 1) 。至今未发现有性态 。

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　　图 A. 1 香蕉枯萎病菌的显微形态图(引自 Ploetz R C. 2005a)

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　香蕉枯萎病菌 4 号小种调查取样记录表

　　表 B. 1 香蕉枯萎病菌 4 号小种调查取样记录表

　　编号 :

　　生产/经营者

　　地址及邮编

　　联系/负责人

　　联系电话

　　调查 日期

　　抽样地点

　　样品编号

　　植物名称(中文名和学名)

　　品种名称

　　植物生育期

　　调查代表株数或面积

　　植物来源

　　症状描述 :

　　发生与防控情况及原因 :

　　抽样方法 、部位和抽样比例

　　备注 :

　　抽样单位(盖章) :

　　抽样人(签名) :

　　年 月 日

　　生产/经营者

　　现场负责人

　　年 月 日

　　注 : 本表一式两份 ,抽样单位和受检单位各一份 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　植物有害生物样本鉴定报告

　　表 C. 1 植物有害生物样本鉴定报告

　　编号 :

　　植物名称

　　品种名称

　　植物生育期

　　样品数量

　　取样部位

　　样品来源

　　送检日期

　　送检人

　　送检单位

　　联系电话

　　检测鉴定方法 :

　　检测鉴定结果 :

　　备注 :

　　鉴定人(签名) :

　　审核人(签名) :

　　鉴定单位盖章 :

　　年 月 日

　　注 : 本单一式三份 ,检测单位 、受检单位和检疫机构各一份 。