GB/T 22958-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22958—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中角黄素

　　残留量的测定

　　液相色谱-紫外检测法

　　Determination ofcanthaxanthin residuesin fugu，eelandbaked eel—

　　HPLC-Uv method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22958—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B、附录 C 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 、中华人民共和国青海出入境检验检疫局和中华人民共和国福建出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：薄海波 、星玉秀 、余孔捷 、贾光群 、曹彦忠 、雒丽丽 、贾红卫 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22958—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中角黄素

　　残留量的测定

　　液相色谱-紫外检测法

　　1 范围

　　本标准规定了河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中角黄素(canthaxanthin)残留量的液相色谱-紫外检测方法和液相色谱-串联质谱确证方法 。

　　本标准适用于河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的测定和确证 。

　　本方法的检出限为 0 . 05 mg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　试样中的角黄素用乙腈提取，正己烷脱脂净化，高效液相色谱-紫外检测，外标法定量 。 高效液相色谱-串联质谱法确证 。

　　4 试剂和材料

　　除另有说明外，所用试剂均为分析纯 。

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 3 正己烷：色谱纯 。

　　4 . 4 乙腈饱和的正己烷：取少量乙腈(4 . 2) 加入正己烷(4 . 3) 中，充分混匀 。静止分层后，取用上层正己烷 。

　　4 . 5 甲酸：优级纯 。

　　4 . 6 无水硫酸钠：用前在 650 ℃灼烧 4 h ,置于干燥器中冷却后备用 。

　　4 . 7 焦性没食子酸 。

　　4 . 8 0 . 1%甲酸：移取 1 mL 甲酸(4 . 5) ,以水定容 1 L 。 当天配制 。

　　4 . 9 角黄素标准物质(CAS:514-78-3) ：纯度 ≥95% 。

　　4 . 10 标准储备溶液：准 确 称 取 角 黄 素 标 准 品 5 . 0 mg(精 确 到 0 . 1 mg) ,用 乙 腈 (4 . 2) 溶 解，转 移 至50 mL棕色容量瓶中并定容至刻度 。该溶液浓度为 100 μg/mL 。储备液贮存在- 18 ℃冰柜中 。

　　4 . 1 1 标准中间溶液：吸取 1 . 00 mL标准储备溶液(4 . 10) ,移入 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，该

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　　GB/T 22958—2008

　　溶液浓度为 10 μg/mL 。4 ℃冰箱中保存 。

　　4 . 12 标准工作溶液：吸取一定量标准中间溶液(4 . 11) ,用流动相稀释至所需浓度 。使用前配制 。

　　4 . 13 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器和设备

　　5 . 1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器 。

　　5 . 2 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI 源)。

　　5 . 3 分析天平：感量 0 . 1 mg 和 0 . 01 g各一台 。

　　5 . 4 旋涡混匀器 。

　　5 . 5 离心机：5 000 r/min 。

　　5 . 6 移液器：1 mL 。

　　5 . 7 聚丙烯离心管：50 mL 。

　　5 . 8 旋转蒸发仪 。

　　5 . 9 均质器 。

　　6 试样制备与保存

　　6 . 1 试样制备

　　抽取河豚鱼 、鳗鱼及烤鳗等样品约 500 g,取可食用部分，绞碎，充分混匀，分装入洁净的容器内，密闭并做好标记 。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染，且尽可能避光操作，尽量减少氧气接触机会并尽快完成 。在样品提取时严格控制操作温度，最高不超过 35 ℃ ,以防止角黄素含量发生变化 。

　　6 . 2 试样保存

　　试样于- 18 ℃以下冷冻保存 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取 5 g试样(精确至 0 . 01 g)于 50 mL 聚丙烯离心管中，加入 10 g无水硫酸钠，0 . 1 g 焦性没食子酸，加乙腈 2 × 20 mL,均质提取 1 min 。 以 3 000 r/min 离心 3 min 。合并提取液于另一个 50 mL 聚丙烯离心管中 。待净化 。

　　7 . 2 净化

　　在乙腈提取液中加入 20 mL 乙腈饱和的正己烷(4 . 3) ,涡旋混匀后振荡 3 min,以 2 000 r/min 离心2 min ,弃去上层正己烷，取下层乙腈 20 mL , 旋转蒸发近干，用 5 mL 乙腈定容，过 0 . 2 μm 滤 膜，待测定 。

　　7 . 3 测定条件

　　7 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：BEH C18 , 1 . 7 μm , 50 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：乙腈 +0 . 1%甲酸溶液(97+3) ;

　　c) 流速：0 . 30 mL/min ;

　　d) 柱温：30 ℃ ;

　　e) 进样量：5 . 0 μL ;

　　f) 检测波长：470 nm 。

　　7 . 3 . 2 色谱测定

　　根据试样中被测物质的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析 。标准工作液和待测样液中角黄素的响应值应在仪器线性响应范围内 。标准工作液与待测样液等体积进样 。在上述色谱

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　　GB/T 22958—2008

　　条件下，角黄素反 、顺式异构体的保留时间分别为 1 . 10 min 和 1 . 26 min 。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并用外标法定量 。角黄素标准溶液的液相色谱图参见附录 A中的图 A. 1 。角黄素标准物质的多反应监测( MRM) 色谱图参见附录 B 中的图 B. 1 。 角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 C 中的表 C. 1 。

　　7 . 4 确证

　　7 . 4 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：BEH C18 , 1 . 7 μm , 50 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：乙腈(4 . 2) +0 . 1%甲酸(4 . 8)(97+3) ;

　　c) 流速：0 . 40 mL/min ;

　　d) 柱温：35 ℃ ;

　　e) 进样量：5 . 0 μL 。

　　7 . 4 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾源 ESI ,正离子模式(ESI+) ;

　　b) 扫描方式：多反应监测( MRM) ;

　　c) 毛细管电压：3 . 5 kV ;

　　d) 锥孔电压：38 V ;

　　e) 离子源温度：120 ℃ ;

　　f) 去溶剂气温度：400 ℃ ;

　　g) 去溶剂气(氮气)流量：800 L/h ;

　　h) 锥孔气(氮气)流量(N2 ) : 50 L/h ;

　　i) 碰撞能量：20 V ;

　　j) 碰撞气流量：0 . 1 L/h ;

　　k) 检测离子对：定量：565 . 5/203 . 1;定性：565 . 5/203 . 1 , 565 . 5/133 . 1 。

　　7 . 4 . 3 液相色谱-串联质谱确证

　　将各被测组分分别选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 1 规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。

　　表 1 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20< K< 50

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 5 平行试验

　　按以上步骤对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 6 空白试验

　　除不称取试样外，均按上述步骤进行测定 。

　　8 结果计算

　　角黄素残留量的测定结果按式(1)计算 。

　　X = c …………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　3

　　c— 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　V— 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，试样中角黄素添加浓度范围及重复性方程见表 2 。

　　表 2 角黄素添加浓度及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　角黄素

　　0 . 05 ~ 2 . 0

　　lgr= 0 . 673 8 lgm-0 . 454 9

　　lgR= 0 . 638 7 lgm-0 . 528 9

　　注：m为两次测定结果的平均值 。

　　如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，试样中角黄素添加浓度范围及再现性方程见表 2 。

　　4

　　GB/T 22958—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质液相色谱图

　　角黄素标准物质液相色谱图见图 A. 1 。

　　1 — 角黄素反式体;

　　2 — 角黄素顺式体 。

　　图 A.1 角黄素标准物质液相色谱图

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　　GB/T 22958—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　标准物质的多反应监测(MRM)色谱图

　　角黄素标准物质的多反应监测( MRM)色谱图见图 B. 1 。

　　1 — 角黄素反式体;

　　2 — 角黄素顺式体 。

　　图 B.1 角黄素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图

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　　GB/T 22958—2008

　　附 录 犆

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表 C. 1 。

　　表 犆.1 角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据

　　样品基质

　　添加浓度/(mg/kg)

　　平均回收率/%

　　河豚鱼

　　0 . 05

　　0 . 10

　　1 . 00

　　2 . 00

　　87 . 6

　　92 . 3

　　85 . 8

　　95 . 5

　　鳗鱼

　　0 . 05

　　0 . 10

　　1 . 00

　　2 . 00

　　86 . 0

　　91 . 7

　　92 . 4

　　89 . 9

　　烤鳗

　　0 . 05

　　0 . 10

　　1 . 00

　　2 . 00

　　88 . 3

　　94 . 4

　　97 . 0

　　87 . 5