GB/T 22951-2008 河豚鱼、鳗鱼中十八种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22951—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼中十八种

　　磺胺类药物残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination of18 sulfonamidesresiduesin fugu and eel—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22951—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：贾光群 、曹彦忠 、张进杰 、石玉秋 、姚智慧 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22951—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼中十八种

　　磺胺类药物残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了河豚鱼 、鳗鱼中十八种磺胺类药物(见表 2)残留量液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于河豚鱼 、鳗鱼中十八种磺胺类药物残留量的测定 。

　　本标准的方法检出限均为 5 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　河豚鱼 、鳗鱼中磺胺类药物残留用乙腈提取，离心，上清液经无水硫酸钠脱水后，用氮气浓缩仪吹至近干，残渣用乙腈-0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液溶解，用正己烷脱脂，过 0 . 2 μm 滤膜后，样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 4 甲酸：色谱纯 。

　　4 . 5 正己烷：色谱纯 。

　　4 . 6 乙酸铵：优级纯 。

　　4 . 7 无水硫酸钠：经 650 ℃灼烧 4 h ,置于干燥器中备用 。

　　4 . 8 0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液：称取 0 . 77 g 乙酸铵(4 . 6)溶于 1 000 mL水中 。

　　4 . 9 定容液：乙 腈-0 . 01 mol/L 乙 酸 铵 溶 液 (3+22) 。量 取 12 mL 乙 腈 (4 . 3) 和 88 mL 乙 酸 铵 溶 液(4 . 8) 混合均匀 。

　　4 . 10 0 . 1%甲酸溶液：吸取 1 . 0 mL 甲酸(4 . 4) ,用水稀释至 1 000 mL 。

　　4 . 1 1 十 八 种 磺 胺 类 药 物 标 准 物 质：磺 胺 嘧 啶 (CAS: 68-35-9) 、磺 胺 噻 唑 (CAS: 72-14-0) 、磺 胺 吡 啶(CAS:144-83-2) 、磺胺甲 基 嘧 啶 (CAS: 127-79-7) 、磺 胺-6-甲 氧 嘧 啶 (CAS: 1220-83-3) 、磺 胺 甲噻 二 唑(CAS:144-82-1) 、磺胺二甲嘧啶(CAS:57-68-1) 、磺胺甲氧哒嗪(CAS:80-35-3) 、磺胺对甲氧嘧啶(CAS:

　　1

　　GB/T 22951—2008

　　651-06-9) 、磺胺氯哒嗪 (CAS:80-32-0) 、磺 胺 甲 基 异 噁唑 (CAS: 723-46-6) 、磺 胺 邻 二 甲 氧 嘧 啶 (CAS: 2447-57-6) 、磺 胺 二 甲 异 噁 唑 ( CAS: 127-69-5 ) 、磺 胺 苯 酰 ( CAS: 127-71-9 ) 、磺 胺 氯 吡 嗪(CAS:102-65-8) 、磺胺 苯 吡 唑 (CAS: 526-08-9) 、磺 胺 间二 甲 氧 嘧 啶 ( CAS: 1037-50-9) 、磺 胺 喹 噁啉

　　(CAS:59-40-5) 。纯度 ≥99% 。

　　4 . 12 0 . 1 mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的每种磺胺类药物标准物质(4 . 11) ,用甲醇(4 . 2) 分别配成 0 . 1 mg/mL 的标准储备溶液，该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 13 5 . 0 μg/mL磺胺类药物混合标准工作溶液：分别吸取各标准储备溶液(4 . 12)0 . 5 mL移至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成 5 . 0 μg/mL混合标准工作溶液 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 14 磺胺内标物质：磺胺甲基异 噁唑-D4 、磺胺嘧啶-D4 、磺胺噻唑-D4 。纯度 ≥99% 。

　　4 . 15 5 . 0 μg/mL磺胺甲基异 噁唑-D4 、磺胺嘧啶-D4 、磺胺噻唑-D4 内标标准储备溶液：称取适量磺胺甲基异 噁唑-D4 , 磺胺嘧啶-D4 , 磺胺噻唑-D4 标准物质(4 . 14) ,用甲醇分别配成 0 . 1 mg/mL 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 16 磺胺类药物混合内标工作溶液：分别吸取磺胺甲基异 噁唑-D4 , 磺胺嘧啶-D4 , 磺胺噻唑-D4 储备溶液(4 . 15)0 . 5 mL移至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成浓度为 5 μg/mL 混合内标工作溶液 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 17 基质标准工作溶液：吸取不同体积混合标准工作溶液(4 . 12) 和 4 μL 混合内标工作溶液(4 . 16) ,用空白样品提取液配成 5 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、20 . 0 ng/mL、50 . 0 ng/mL、100 . 0 ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液 。 当天配制 。

　　4 . 18 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源 。

　　5 . 2 分析天平：感量 0 . 1 mg, 0 . 01 g 。

　　5 . 3 离心管：50 mL 。

　　5 . 4 均质器 。

　　5 . 5 液体混匀器 。

　　5 . 6 离心机 。

　　5 . 7 氮气浓缩仪 。

　　5 . 8 浓缩管：10 mL 。

　　6 试样的制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　从全部样品中取出有代表性样品约 1 kg,充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内 。 密封，作为试样，标明标记 。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。

　　6 . 2 试样保存

　　将试样于 -18℃冷冻保存 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 样品制备

　　称取 10 g试样，精确至 0 . 01 g 。置于 50 mL离心管(5 . 3)中，加入 20 μL 内标工作溶液(4 . 16) ,然后加入 20 g无水硫酸钠(4 . 7)和 25 mL 乙腈(4 . 3) ,均质 2 min , 以 3 000 r/min 离心 3 min 。上清液转移至 50 mL容量瓶中，残渣再加入 20 mL 乙腈，重复上述操作一次 。合并提取液，用乙腈定容至刻度后，混匀 。 吸取 10 mL 至浓缩管(5 . 8)中，在 45 ℃水浴中氮气吹至近干 。 准确加入 1 mL 定容液(4 . 9)

　　2

　　GB/T 22951—2008

　　和 1 mL 正己烷(4 . 5) 溶解残渣，涡旋 1 min , 以 3 000 r/min 离心 3 min,吸取上层正己烷弃去，再加入1 mL 正己烷，重复上述步骤，直至下层水相变成透明液体 。取下层清液，过 0 . 2 μm 滤膜(4 . 18) 后，用液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　按上述操作步骤制备样品空白提取液 。

　　7 . 2 测定条件

　　7 . 2 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Atlantis , 3 μm , 150 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：A：乙腈，B: 0 . 1%甲酸溶液，C： 甲醇 。梯度洗脱条件见表 1 ;

　　c) 流速：0 . 2 mL/min ;

　　d) 柱温：35 ℃ ;

　　e) 进样量：20 μL 。

　　表 1 流动相梯度条件

　　时间/min

　　A/%

　　B/%

　　C/%

　　0 . 00

　　10 . 0

　　80 . 0

　　10 . 0

　　3 . 00

　　20 . 0

　　70 . 0

　　10 . 0

　　8 . 00

　　35 . 0

　　55 . 0

　　10 . 0

　　12 . 00

　　70 . 0

　　20 . 0

　　10 . 0

　　12 . 01

　　10 . 0

　　80 . 0

　　10 . 0

　　17 . 00

　　10 . 0

　　80 . 0

　　10 . 0

　　7 . 2 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测;

　　d) 电喷雾电压：5 500 V ;

　　e) 雾化气压力：0 . 076 MPa ;

　　f) 气帘气压力：0 . 069 MPa ;

　　g) 辅助气流速：6 L/min ;

　　h) 离子源温度：350 ℃ ;

　　i) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压见表 2 。

　　表 2 十八种磺胺类药物的定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对

　　(m/≈)

　　定量离子对

　　(m/≈)

　　碰撞气能量/V

　　去簇电压/V

　　磺胺嘧啶

　　sulfadiazine

　　251/156

　　251/185

　　251/156

　　23

　　27

　　55

　　50

　　磺胺噻唑

　　sulfathiazole

　　256/156

　　256/107

　　256/156

　　22

　　32

　　55

　　47

　　磺胺吡啶

　　sulfapyridine

　　250/156

　　250/184

　　250/156

　　25

　　25

　　50

　　60

　　磺胺甲基嘧啶

　　sulfamethoxypyridazine

　　265/156

　　265/172

　　265/156

　　25

　　24

　　50

　　60

　　磺胺-6-甲氧嘧啶

　　sulfamonomethoxine

　　281/156

　　281/215

　　281/156

　　25

　　25

　　65

　　50

　　3

　　GB/T 22951—2008

　　表 2(续)

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对

　　(m/≈)

　　定量离子对

　　(m/≈)

　　碰撞气能量/V

　　去簇电压/V

　　磺胺甲噻二唑

　　sulfamethizole

　　271/156

　　271/107

　　271/156

　　20

　　32

　　50

　　50

　　磺胺二甲嘧啶

　　sulfamethazine

　　279/156

　　279/204

　　279/156

　　22

　　20

　　55

　　60

　　磺胺甲氧哒嗪

　　sulfamethoxypyridazine

　　281/156

　　281/215

　　281/156

　　25

　　25

　　65

　　50

　　磺胺对甲氧嘧啶

　　sulfameter

　　281/156

　　281/215

　　281/156

　　25

　　25

　　65

　　50

　　磺胺氯哒嗪

　　sulfachloropyridazine

　　285/156

　　285/108

　　285/156

　　23

　　35

　　50

　　50

　　磺胺甲基异 噁唑

　　sulfamethoxazole

　　254/156

　　254/147

　　254/156

　　23

　　22

　　50

　　45

　　磺胺邻二甲氧嘧啶

　　sulfadoxine

　　311/156

　　311/108

　　311/156

　　31

　　35

　　70

　　55

　　磺胺二甲异 噁唑

　　sulfisoxazole

　　268/156

　　268/113

　　268/156

　　20

　　23

　　45

　　45

　　磺胺苯酰

　　sulfabenzamide

　　277/156

　　277/108

　　277/156

　　20

　　35

　　85

　　85

　　磺胺氯吡嗪

　　sulfachloropyrazine

　　285/156

　　285/108

　　285/156

　　24

　　37

　　53

　　53

　　磺胺苯吡唑

　　sulfaphenazole

　　315/156

　　315/160

　　315/156

　　32

　　35

　　55

　　55

　　磺胺间二甲氧嘧啶

　　sulfadimethoxine

　　311/156

　　311/218

　　311/156

　　31

　　27

　　70

　　70

　　磺胺喹 噁啉

　　sulfaquinoxaline

　　301/156

　　301/208

　　301/156

　　25

　　28

　　42

　　42

　　7 . 3 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 3 . 1 定性测定

　　将各被测组分分别选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 3 规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。

　　表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 3 . 2 定量测定

　　用基质混合标准工作溶液(4 . 17)分别进样，以各标准峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以各标准工作溶液浓度与内标溶液浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中十八种磺胺类药物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。在上述色谱条件和质谱条件下，十八种磺胺类药物的参考保留时间见表 4 。 十八种磺胺类药物的标准多反应监测( MRM) 色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 。

　　4

　　GB/T 22951—2008

　　本方法中十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　表 4 十八种磺胺类药物参考保留时间

　　化合物名称

　　保留时间/min

　　化合物名称

　　保留时间/min

　　磺胺嘧啶

　　4 . 45

　　磺胺氯哒嗪

　　8 . 91

　　磺胺噻唑

　　4 . 77

　　磺胺甲基异 噁唑

　　9 . 29

　　磺胺吡啶

　　5 . 39

　　磺胺邻二甲氧嘧啶

　　9 . 29

　　磺胺甲基嘧啶

　　6 . 20

　　磺胺二甲异 噁唑

　　9 . 72

　　磺胺-6-甲氧嘧啶

　　7 . 75

　　磺胺苯酰

　　10 . 50

　　磺胺甲噻二唑

　　7 . 76

　　磺胺氯吡嗪

　　10 . 85

　　磺胺二甲嘧啶

　　7 . 83

　　磺胺苯吡唑

　　11 . 11

　　磺胺甲氧哒嗪

　　8 . 01

　　磺胺间二甲氧嘧啶

　　11 . 12

　　磺胺对甲氧嘧啶

　　8 . 75

　　磺胺喹 噁啉

　　11 . 22

　　7 . 4 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 5 空白试验

　　除不称取样品外，均按上述步骤进行 。

　　8 结果计算

　　河豚鱼 、鳗鱼中十八种磺胺类药物残留量的测定结果按式(1)计算：

　　X = c

　　式中：

　　X— 试样中被测物残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　cs — 基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　A— 试样溶液中被测物的色谱峰面积;

　　As — 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积;

　　ci — 试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　csi — 基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　Asi — 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积;

　　Ai — 试样溶液中内标物的色谱峰面积;

　　V— 样液最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 的规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，河豚鱼 、鳗鱼中十八种磺胺类药物添加浓度范围及重复性方程见表 5 。

　　5

　　GB/T 22951—2008

　　表 5 添加浓度范围及重复性和再限性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　磺胺嘧啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 913 4 lg m- 1 . 248 6

　　lg R= 0 . 757 6 lg m-0 . 664 7

　　磺胺噻唑

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 498 7 lg m-0 . 791 6

　　lg R= 0 . 760 4 lg m-0 . 541 5

　　磺胺吡啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 080 1 lg m- 1 . 464 1

　　lg R= 1 . 023 7 lg m-0 . 918 1

　　磺胺甲基嘧啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 733 7 lg m- 1 . 178 6

　　lg R= 0 . 722 3 lg m-0 . 366 4

　　磺胺-6-甲氧嘧啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 878 5 lg m-0 . 998 6

　　lg R= 0 . 600 6 lg m-0 . 377 9

　　磺胺甲噻二唑

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 059 8 lg m- 1 . 341 1

　　lg R= 0 . 851 6 lg m-0 . 596 6

　　磺胺二甲嘧啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 824 7 lg m- 1 . 190 6

　　lg R= 1 . 077 8 lg m- 1 . 110 2

　　磺胺甲氧哒嗪

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 244 1 lg m- 1 . 781 6

　　lg R= 0 . 755 8 lg m-0 . 521 5

　　磺胺对甲氧嘧啶

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 835 6 lg m- 1 . 151 1

　　lg R= 0 . 947 3 lg m- 1 . 011 2

　　磺胺氯哒嗪

　　5 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 495 2 lg m-0 . 754 0