GB/T 22950-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22950—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中 12 种 β-兴奋剂

　　残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination of12 β-agonistsresiduesin fugu，eelandbaked eel—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22950—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 、中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室(福州大学)。

　　本标准主要起草人：杨方 、刘正才 、林永辉 、李耀平 、余孔捷 、黄杰 、陈健 、陈国南 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22950—2008

　　河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中 12 种 β-兴奋剂

　　残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中 12 种 β-兴奋剂残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于河豚鱼 、鳗鱼和烤鳗中 12 种 β-兴奋剂多残留的测定 。 12 种 β-兴奋剂药物包括溴布特罗(brombut erol) 、塞曼特罗(cimaterol) 、克仑特罗(clenbuterol) 、克仑潘特(clenpenterol) 、羟甲基氨克仑特罗(hydroxymethylclenbuterol) 、苯 氧 丙 酚 胺(iso xsuprine) 、马 布 特 罗 ( mabuterol) 、莱 克 多 巴 胺(ractopamin) 、利 托 君 (ritodrine) 、沙 丁 胺 醇 (salbut amol) 、特 布 他 林 ( terbut aline) 和 妥 布 特 罗( tulobuterol) 。

　　本标准中莱克多巴胺 、沙丁胺醇 、塞曼特罗 、克仑潘特和克仑特罗的方法检出限为 0 . 1 μg/kg,溴布特罗 、妥 布 特 罗 、马 布 特 罗 、特 布 他 林 、利 托 君 、苯 氧 丙 酚 胺 和 羟 甲 基 氨 克 仑 特 罗 的 方 法 检 出限 为0 . 5 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　样品经稀酸水解 、高氯酸沉淀蛋白后，残留的 β-兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取，混合型阳离子交换反相吸附固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱进行测定，内标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水 。

　　4 . 1 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 2 异丙醇 。

　　4 . 3 乙酸乙酯 。

　　4 . 4 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 5 甲酸 。

　　4 . 6 高氯酸 。

　　4 . 7 盐酸 。

　　4 . 8 氢氧化钠 。

　　1

　　GB/T 22950—2008

　　4 . 9 乙酸铵：色谱纯 。

　　4 . 10 氨水 。

　　4 . 1 1 氯化钠 。

　　4 . 12 10 mol/L氢氧化钠溶液：称取 40 g 氢氧化钠至 100 mL水中，混匀 。

　　4 . 13 0 . 1 mol/L 高氯酸溶液：移取 0 . 4 mL 高氯酸至 100 mL水中，混匀 。

　　4 . 14 0 . 1 mol/L盐酸溶液：移取 0 . 85 mL盐酸至 100 mL水中，混匀 。

　　4 . 15 5 mmol/L 乙酸铵溶液：称取 0 . 385 g 乙酸铵至约 800 mL水中，加入 2 mL 甲酸，定容至 1 000 mL ,混匀 。

　　4 . 16 甲醇-0 . 1%甲酸溶液：移取 0 . 1 mL 甲酸于约 50 mL水中，加入 10 mL 甲醇，以水定容 100 mL ,混匀 。

　　4 . 17 标准物质：溴布特罗 、塞曼特罗 、克仑特罗 、克仑潘特 、羟甲基氨克仑特罗 、苯氧丙酚胺 、马布特罗 、莱克多巴胺 、利托君 、沙丁胺醇 、特布他林和妥布特罗，纯度大于 98 . 0% 。

　　4 . 18 内标标准物质：盐酸克仑特罗-D9 、盐酸莱克多巴胺-D5 、沙丁胺醇-D3 ,纯度大于 98 . 0% 。

　　4 . 19 标准储备液(100 μg/mL) ：准确称取适量(精确到 0 . 1 mg) 的溴布特罗 、塞曼特罗 、克仑特罗 、克仑潘特 、羟甲基氨克仑特罗 、苯氧丙酚胺 、马布特罗 、莱克多巴胺 、利托君 、沙丁胺醇 、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配制成 100 μg/mL 的标准储备液，-20 ℃冰箱中保存 。

　　4 . 20 混合标准储备液(1 μg/mL) ：分别准确量取 1 . 0 mL 的标准储备液至 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20 ℃冰箱中保存 。

　　4 . 2 1 内标储备液(100 μg/mL) ：准确称取适量(精确到 0 . 1 mg)的克仑特罗-D9 、莱克多巴胺-D5 、沙丁胺醇-D3 对照品，用甲醇配制成 100 μg/mL 的标准储备液 。

　　4 . 22 内标工作液(10 ng/mL) ：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释定容成浓度为 10 ng/mL 的同位素内标工作液，-20 ℃下冰箱中保存 。

　　4 . 23 基质标准工 作 溶 液：以 空 白 基 质 溶 液 将 混 合 标 准 储 备 液 与 内 标 工 作 液 稀 释 至 适 当 浓 度，临 用现配 。

　　4 . 24 混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60 mg/3 mL , 使用前依次用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化，保持柱体湿润 。

　　4 . 25 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器和设备

　　5 . 1 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离(ESI)源 。

　　5 . 2 天平：感量 0 . 1 mg 和 0 . 01 g 。

　　5 . 3 组织捣碎机 。

　　5 . 4 高速冷冻离心机：转速可达 15 000 r/min,致冷可达 4 ℃ 。

　　5 . 5 离心机：4 000 r/min 。

　　5 . 6 旋涡振荡器 。

　　5 . 7 电热恒温振荡水槽 。

　　5 . 8 pH 计 。

　　5 . 9 旋转蒸发仪 。

　　5 . 10 固相萃取装置 。

　　5 . 1 1 氮吹仪 。

　　6 试样制备和保存

　　6 . 1 试样制备

　　河豚鱼 、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮 、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热后连同鱼肉 、鳗鱼制品取所有

　　2

　　GB/T 22950—2008

　　可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装入清洁容器内，并标明标记 。

　　制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。

　　6 . 2 试样保存

　　试样于- 18 ℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在 2 ℃ ~ 6 ℃贮存 72 h 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　准确称取 5 g(精确到 0 . 01 g) 测试样品于 50 mL 聚丙烯离心管内，加入 50 μL 10 ng/mL 的内标物，加入 20 mL 0 . 1 mol/L盐酸溶液(4 . 14) ,涡旋混匀，于 37 ℃下避光水浴振荡 16 h(过夜)，取出冷却至室温，加入 5 mL 0 . 1 mol/L 高氯酸溶液(4 . 13) ,涡 旋 混 匀，4 ℃下 15 000 r/min 离 心 10 min,分 取10 mL上清液转移至另一 50 mL 离 心 管 内 。 用 10 mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 (4 . 12) 调 节 pH 值 至 9 . 7 ± 0 . 3 ,加入约 2 g 氯化 钠 后，再 加 25 mL 异 丙 醇-乙 酸 乙 酯 (3+2) ,涡 动 提 取 2 min , 4 500 r/min 离 心5 min,取出上清液至另一 50 mL离心管中 。再在下层水相中加 15 mL 乙酸乙酯-异丙醇(7+3) ,涡动提取 1 min , 4 500 r/min 离心 5 min,合并有机相，40 ℃下旋转蒸发至近干，加入 5 mL 0 . 1 mol/L 盐酸溶液(4 . 14) ,涡动 1 min, 待净化 。

　　7 . 2 净化

　　将 7 . 1 所得溶液以约 1 mL/min 的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱(4 . 24) , 依次用 3 mL水 、3 mL 2%甲酸水溶液和 2 mL 甲醇淋洗，抽干，用 5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液于40 ℃下以 氮 气 吹 至 近 干，以 0 . 5 mL 甲 醇-0 . 1% 甲 酸 溶 液 (4 . 16) 溶 解，涡 动 混 匀，过 0 . 2 μm 滤 膜(4 . 25) , 供液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　7 . 3 空白基质溶液的制备

　　称取阴性样品 5 g(精确至 0 . 01 g) ,按 7 . 1 和 7 . 2 步骤操作 。

　　7 . 4 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 4 . 1 液相色谱条件

　　a) 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18 , 1 . 7 μm , 55 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：A 为 5 mmol/L 乙酸铵溶液(4 . 15) , B 为 0 . 1%甲酸乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表 1 ;

　　表 1 梯度洗脱程序

　　时间/min

　　A/%

　　B/%

　　0 . 0

　　85

　　15

　　1 . 0

　　85

　　15

　　2 . 0

　　30

　　70

　　2 . 5

　　30

　　70

　　3 . 0

　　85

　　15

　　5 . 0

　　85

　　15

　　c) 流速：0 . 25 mL/min ;

　　d) 柱温：30 ℃ ;

　　e) 进样量：10 μL 。

　　7 . 4 . 2 质谱条件

　　a) 离子源：电喷雾源(ESI) ,正离子模式;

　　b) 扫描方式：多反应监测( MRM) ;

　　c) 毛细管电压：1 . 5 kV ;

　　3

　　d) 源温度：120 ℃ ;

　　e) 去溶剂温度：450 ℃ ;

　　f) 锥孔气流(氮气)：45 L/h ;

　　g) 去溶剂气流(氮气)：700 L/h ;

　　h) 碰撞气压(氩气)：2 . 20 × 10 - 6 Pa ;

　　i) 驻留时间：0 . 20 s 。

　　7 . 4 . 3 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 4 . 3 . 1 定性测定

　　每种被测组分选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表 2 规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物 。

　　表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许的相对偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 4 . 3 . 2 定量测定

　　内标法定量：用混合标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中 12 种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内 。 12 种 β-兴奋剂药物的保留时间 、母离子和子离子见表 3 。 12 种 β-兴奋剂药物的标准物质的多反应监测( MRM) 色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 ,添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　表 3 12 种 β-兴奋剂类药物保留时间 、定性定量离子对及锥孔电压 、碰撞能量

　　化合物名称

　　保留时间/ min

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　锥孔电压/ V

　　碰撞能量/ eV

　　莱克多巴胺

　　2 . 00

　　302/164

　　302/164

　　25

　　15

　　302/284

　　12

　　沙丁胺醇

　　0 . 75

　　240/148

　　240/148

　　20

　　18

　　240/166

　　13

　　塞曼特罗

　　0 . 84

　　220/160

　　220/160

　　18

　　15

　　220/202

　　10

　　克仑潘特

　　2 . 25

　　291/203

　　291/203

　　20

　　15

　　291/273

　　10

　　克仑特罗

　　2 . 15

　　277/203

　　277/203

　　26

　　15

　　277/259

　　11

　　溴布特罗

　　2 . 20

　　367/293

　　367/293

　　18

　　18

　　367/349

　　13

　　妥布特罗

　　2 . 13

　　228/119

　　228/154

　　21

　　25

　　228/154

　　16

　　4

　　表 3(续)

　　化合物名称

　　保留时间/ min

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　锥孔电压/ V

　　碰撞能量/ eV

　　马布特罗

　　2 . 25

　　311/237

　　311/237

　　20

　　16

　　311/293

　　11

　　特布他林

　　0 . 78

　　226/125

　　226/152

　　20

　　22

　　226/152

　　16

　　利托君

　　1 . 25

　　288/121

　　288/270

　　20

　　20

　　288/270

　　12

　　苯氧丙酚胺

　　2 . 22

　　302/150

　　302/150

　　20

　　22

　　302/284

　　14

　　羟甲基氨克仑特罗

　　1 . 95

　　293/203

　　293/203

　　18

　　15

　　293/275

　　12

　　克仑特罗-D9

　　2 . 13

　　286/204

　　286/204

　　26

　　15

　　沙丁胺醇-D3

　　0 . 75

　　243/151

　　243/151

　　20

　　18

　　莱克多巴胺-D5

　　2 . 00

　　308/168

　　308/168

　　25

　　15

　　采用克仑特罗-D9 定量的化合物有：克仑 潘 特 、克 仑 特 罗 、溴 布 特 罗 、妥 布 特 罗 、马 布 特 罗 、苯 氧 丙酚胺 。

　　采用沙丁胺醇-D5 定量的化合物有：沙丁胺醇 、塞曼特罗 、特布他林 。

　　采用莱克多巴胺-D5 定量的化合物有：莱克多巴胺 、利托君 、羟甲基氨克仑特罗 。

　　7 . 5 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　8 结果计算

　　试样中兴奋剂类药物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：

　　X = c× × ………………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　c— 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　V— 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 试样溶液最终所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 的规定确定的，重复性和再现性的值以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表 4 。

　　5

　　表 4 12 种 β-兴奋剂类药物的含量范围及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　莱克多巴胺

　　0 . 1 ~ 1 . 0

　　lg r= 1 . 255 4 lg m-0 . 808 0

　　lg R= 1 . 032 4 lg m-0 . 498 4

　　沙丁胺醇

　　0 . 1 ~ 1 . 0

　　lg r= 1 . 276 7 lg m-0 . 494 6

　　lg R= 1 . 038 0 lg m-0 . 501 3

　　塞曼特罗

　　0 . 1 ~ 1 . 0

　　lg r= 1 . 114 8 lg m-0 . 780 4

　　lg R= 1 . 015 3 lg m-0 . 503 9

　　克仑潘特

　　0 . 1 ~ 1 . 0

　　lg r= 1 . 079 7 lg m-0 . 675 2

　　lg R= 0 . 892 6 lg m-0 . 574 2

　　克仑特罗

　　0 . 1 ~ 1 . 0

　　lg r= 1 . 006 2 lg m-0 . 769 7

　　lg R= 0 . 959 8 lg m-0 . 497 4

　　溴布特罗

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 1 . 036 0 lg m-0 . 576 2

　　lg R= 1 . 085 8 lg m-0 . 533 9

　　妥布特罗

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 1 . 137 8 lg m-0 . 491 5

　　lg R= 0 . 940 8 lg m-0 . 582 6

　　马布特罗

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 0 . 998 1 lg m-0 . 687 3

　　lg R= 1 . 020 5 lg m-0 . 518 2

　　特布他林

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 0 . 979 8 lg m-0 . 705 2

　　lg R= 1 . 038 7 lg m-0 . 481 0

　　利托君

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 0 . 965 4 lg m-0 . 712 9

　　lg R= 0 . 973 5 lg m-0 . 481 6

　　苯氧丙酚胺

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 1 . 122 8 lg m-0 . 814 2

　　lg R= 0 . 950 5 lg m-0 . 501 4

　　羟甲基氨克仑特罗

　　0 . 5 ~ 5 . 0

　　lg r= 1 . 017 0 lg m-0 . 718 2

　　lg R= 0 . 979 4 lg m-0 . 468 0

　　如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表 4 。

　　6

　　GB/T 22950—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质的多反应监测(MRM)色谱图

　　12 种 β-兴奋剂类药物标准物质的多反应监测( MRM)色谱图见图 A. 1 。

　　图 A.1 12 种 β-兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图

　　7

　　GB/T 22950—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　12 种 β-兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 12 种 β-兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　河豚鱼

　　鳗鱼

　　烤鳗

　　莱克多巴胺

　　0 . 1

　　90 . 4

　　81 . 0

　　84 . 8

　　0 . 2

　　88 . 9

　　81 . 5

　　84 . 1

　　0 . 5

　　89 . 9

　　82 . 5

　　86 . 0

　　1 . 0

　　94 . 7

　　84 . 3

　　87 . 2

　　沙丁胺醇

　　0 . 1

　　89 . 7

　　84 . 8

　　88 . 0

　　0 . 2

　　90 . 7

　　84 . 4

　　87 . 0

　　0 . 5

　　90 . 9

　　88 . 7

　　85 . 0

　　1 . 0

　　90 . 8

　　87 . 1

　　88 . 7

　　塞曼特罗

　　0 . 1

　　86 . 6

　　85 . 2

　　87 . 4

　　0 . 2

　　90 . 6

　　93 . 9

　　83 . 2

　　0 . 5

　　92 . 4

　　87 . 2

　　85 . 0

　　1 . 0

　　91 . 8

　　89 . 5

　　88 . 9