GB/T 22946-2008 蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22946—2008

　　蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素 、

　　红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、

　　克林霉素 、吉他霉素 、交沙霉素

　　残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　Determination oflincomycin，erythromycin，tilmicosin，tylosin，spiramycin，

　　clindamycin，kitasamycin andjosamycin residuesin royaljelly and

　　lyophilized royaljellypowder—LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22946—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：王飞 、王海洋 、曹彦忠 、贾光群 、张进杰 、石玉秋 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22946—2008

　　蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素 、

　　红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、

　　克林霉素 、吉他霉素 、交沙霉素

　　残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、克林霉素 、吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、克林霉素 、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定 。

　　本标准的方法检出限：蜂王浆中的林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、克林霉素 、吉他霉素 、交沙霉素均为 2 . 0 μg/kg;蜂王浆冻干粉中的林可霉素 、红霉素 、泰乐菌素 、克林霉素 、交沙霉素均为 2 . 0 μg/kg,替米考星 、螺旋霉素 、吉他霉素均为 5 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法( GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、螺旋霉素 、克林霉素 、吉他霉素和交沙霉素的残留用 Tris 提取液提取，提取液经 Oasis HLB 固相萃取柱1) 净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-串联质谱法测定 。外标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　除另有说明外，所用试剂均为分析纯 。

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙酸铵 。

　　4 . 4 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 5 盐酸 。

　　1) Oasis HLB 固相萃取柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。

　　1

　　GB/T 22946—2008

　　4 . 6 三羟甲基氨基甲烷(Tris) : C4 H 11 NO3 。

　　4 . 7 氯化钙(CaCl2 ·2H2 O) 。

　　4 . 8 甲醇溶液(2+3) ：量取 400 mL 甲醇(4 . 2)与 600 mL水混合 。

　　4 . 9 0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液：0 . 77 g 乙酸铵(4 . 3)溶解于水中，定容于 1 000 mL容量瓶中 。

　　4 . 10 定容液：0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液(4 . 9) +乙腈(4 . 4)(17+3) 。

　　4 . 1 1 Tris 提取液：称取 12 . 0 g 三羟甲基氨基甲烷(4 . 6) 和 7 . 35 g 氯化钙(4 . 7) 溶解于水中，用盐酸(4 . 5)调节 pH 值为 9 ,定容至 1 000 mL 。

　　4 . 12 标准物质：林可霉素(CAS:7179-49-9) 、红霉素(CAS:59319-72-1) 、替米考星(CAS:108050-54-0) 、泰乐菌素 ( CAS: 74610-55-2) 、螺 旋 霉 素 ( CAS: 8025-81-8) 、克 林 霉 素 ( CAS: 21462-39-5) 、吉 他 霉 素(CAS:1392-21-8)和交沙霉素(CAS:16846-24-5)纯度 ≥95% 。

　　4 . 13 标 准 储 备 溶 液 Ⅰ : 1 . 0 mg/mL 。 分 别 准 确 称 取 每 种 标 准 物 质 (4 . 12) 适 量，分 别 放 入 相 对 应 的10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀 。4 ℃保存 。

　　4 . 14 标准储备溶液 Ⅱ : 10 . 0 μg/mL 。分别吸取 0 . 1 mL 各标准储备溶液(4 . 13) ,分别放入相对应的10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度 。4 ℃保存 。

　　4 . 15 标准工作溶液：2 . 0 μg/mL 。分别吸取 2 . 0 mL标准储备溶液(4 . 14) ,分别放入相对应的 10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度 。

　　4 . 16 Oasis HLB 固相萃取柱或相当者：500 mg , 6 mL 。使用前，依次用 10 mL 甲醇和 10 mL水活化，在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润 。

　　4 . 17 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源 。

　　5 . 2 天平：感量 0 . 01 g, 0 . 000 1 g 。

　　5 . 3 固相萃取装置 。

　　5 . 4 氮气浓缩仪 。

　　5 . 5 具塞聚丙烯离心管：50 mL 。

　　5 . 6 离心机 。

　　5 . 7 超声波清洗仪 。

　　5 . 8 pH 计 。

　　5 . 9 振荡器 。

　　6 试样制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　从全部样品中取出有代表性样品约 200 g,充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内 。密封后作为试样，标明标记 。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。

　　6 . 2 试样的保存

　　将蜂王浆试样于- 18 ℃保存 。蜂王浆冻干粉试样密封保存，防止吸潮 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取 2 g蜂王浆试样(蜂 王 浆 冻 干 粉 取 1 g) ,精 确 至 0 . 01 g,置 于 50 mL 离 心 管 ( 5 . 5) 中，加 入10 . 0 mLTris 提取液(4 . 11) ,于振荡器上剧烈振荡 10 min 。 以 18 000 g 离心力离心 10 min,取上清液以小于 1 . 0 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 固相萃取柱(4 . 16) 。再加入 10 . 0 mL Tris 提取液(4 . 11) ,

　　2

　　GB/T 22946—2008

　　于振荡器上剧烈振荡 10 min 。 以 18 000 g 离心力离心 10 min,取上清液以小于 1 . 0 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 固相萃取柱 。

　　7 . 2 净化

　　待样液全部流出后，依次用 10 mL水和 10 mL 甲醇溶液(4 . 8) 洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取柱用真空泵减压抽干 1 h 。再用 10 mL 甲醇(4 . 2)洗脱于 15 mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于 50 ℃水浴中吹至近干，准确加入 1 . 0 mL定容液(4 . 10)后，于超声波清洗仪中溶解残渣 。过 0 . 2 μm 滤膜(4 . 17)后，供液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　7 . 3 基质标准混合工作溶液的制备

　　7 . 3 . 1 蜂王浆用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取 1 . 0 μL、2 . 0 μL、5 . 0 μL、25 μL 的林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素标准工作溶液(4 . 15) , 依次加入相对应的阴性样品中，按 7 . 1 、7 . 2 步骤制备林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素分别为 2 . 0 ng/mL 、5 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、50 . 0 ng/mL 四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液 。

　　7 . 3 . 2 蜂王浆冻干粉用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取 1 . 0 μL、2 . 0 μL、5 . 0 μL、25μL 林可霉素 、红霉素 、克林霉素 、泰乐菌素 、交沙霉素标准工作溶液(4 . 15)和 2 . 5 μL、5 . 0 μL、10 . 0 μL、25μL 的替米考星 、螺旋霉素 、吉他霉素标准工作溶液(4 . 15) , 依次加入相对应的阴性样品中，按 7 . 1 、7 . 2 步骤制备林可霉素 、红 霉 素 、克 林 霉 素 、泰 乐 菌 素 、交 沙 霉 素 分 别 为 2 . 0 ng/mL、4 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、 50. 0 ng/mL和替米考星、螺旋霉素、吉他霉素分别为 5 . 0 ng/mL、10. 0 ng/mL、20. 0 ng/mL 50. 0 ng/mL 四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液 。

　　7 . 4 测定条件

　　7 . 4 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Atlantis C18 , 3 μm , 150 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：A：乙腈，B: 0 . 1%甲酸水溶液，C：甲醇 。梯度洗脱条件见表 1 ;

　　c) 流速：0 . 2 mL/min ;

　　d) 柱温：30 ℃ ;

　　e) 进样量：20 μL 。

　　表 1 梯度洗脱条件

　　时间/min

　　A/%

　　B/%

　　C/%

　　0 . 00

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　5 . 00

　　5 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　9 . 00

　　5 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　9 . 10

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　17 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　7 . 4 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测;

　　d) 电喷雾电压：5 500 V ;

　　e) 雾化气压力：0 . 24 MPa ;

　　f) 辅助气流速：0 . 4 L/min ;

　　g) 离子源温度：550 ℃ ;

　　h) 碰撞室出 口 电压：2 . 0 V ;

　　3

　　GB/T 22946—2008

　　i) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压：见表 2 。

　　表 2 林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素

　　定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　碰撞气能量/V

　　去簇电压/V

　　林可霉素

　　lincomycin

　　407/126

　　407/359

　　407/126

　　37

　　24

　　50

　　50

　　红霉素

　　erythromycin

　　734/158

　　734/576

　　734/158

　　42

　　28

　　50

　　50

　　替米考星

　　tilmicosin

　　869/174

　　869/132

　　869/174

　　62

　　70

　　90

　　90

　　泰乐菌素

　　tylosin

　　916/174

　　916/145

　　916/174

　　54

　　55

　　80

　　80

　　克林霉素

　　clindamycin

　　425/126

　　425/377

　　425/126

　　45

　　28

　　53

　　53

　　螺旋霉素

　　spiramycin

　　843/142

　　843/174

　　843/142

　　48

　　50

　　60

　　60

　　吉他霉素

　　kitasamycin

　　772/215

　　772/109

　　772/215

　　43

　　42

　　70

　　70

　　交沙霉素

　　josamycin

　　828/174

　　828/109

　　828/174

　　45

　　45

　　80

　　80

　　7 . 5 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 5 . 1 定性测定

　　被测组分选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度进行比较，若偏差不超过表 3 规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物 。

　　表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以 %表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 5 . 2 定量测定

　　在仪器最佳工作条件下，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线 。用基质标准工作溶液的工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素的响应值在仪器测定的线性范围内 。

　　在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素的参考保留时间见表 4 。

　　4

　　GB/T 22946—2008

　　表 4 林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素

　　参考保留时间

　　化合物名称

　　保留时间/min

　　林可霉素

　　6 . 96

　　红霉素

　　8 . 06

　　替米考星

　　8 . 36

　　泰乐菌素

　　8 . 48

　　克林霉素

　　8 . 51

　　螺旋霉素

　　8 . 67

　　吉他霉素

　　8 . 83

　　交沙霉素

　　9 . 14

　　林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反应监测( MRM)色 谱 图 参 见 附 录 A 中 的 图 A. 1 、图 A. 2 、图 A. 3 、图 A. 4 、图 A. 5 、图 A. 6 、图 A. 7 、图 A. 8 。

　　林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　7 . 6 平行试验

　　按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 7 空白试验

　　不称取样品，其余均按步骤 7 . 1 和 7 . 2 进行 。

　　8 结果计算

　　林可霉素 、红霉素 、替米 考 星 、泰 乐 菌 素 、克 林 霉 素 、螺 旋 霉 素 、吉 他 霉 素 和 交 沙 霉 素 的 残 留 量 按式(1)计算：

　　X = c …………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

　　c— 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　V— 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 的规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性方程见表 5 。

　　5

　　表 5 林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素

　　添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性 R

　　林可霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 939 2 lg m- 1 . 030 4

　　lg R= 0 . 874 1 lg m-0 . 518 2

　　红霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 797 4 lg m-0 . 981 1

　　lg R= 1 . 050 6 lg m-0 . 577 5

　　替米考星

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 031 8 lg m-0 . 985 9

　　lg R= 0 . 985 3 lg m-0 . 556 1

　　泰乐菌素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 056 9 lg m-0 . 999 3

　　lg R= 0 . 851 3 lg m-0 . 561 6

　　克林霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 079 8 lg m- 1 . 149 5

　　lg R= 0 . 885 4 lg m-0 . 414 6

　　螺旋霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 912 5 lg m-0 . 975 1

　　lg R= 1 . 043 2 lg m-0 . 591 7

　　吉他霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 100 1 lg m- 1 . 025 0

　　lg R= 1 . 145 3 lg m-0 . 766 5

　　交沙霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 438 9 lg m- 1 . 418 5

　　lg R= 1 . 122 7 lg m-0 . 696 5

　　注：m为两次测定值的算术平均值 。

　　如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素的添加浓度范围及再现性方程见表 5 。

　　6

　　GB/T 22946—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反应监测( MRM)色谱图分别见图 A. 1 、图 A. 2 、图 A. 3 、图 A. 4 、图 A. 5 、图 A. 6 、图 A. 7 、图 A. 8 。

　　图 A.1 林可霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.2 红霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.3 替米考星标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.4 泰乐菌素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　7

　　GB/T 22946—2008

　　图 A.5 克林霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.6 螺旋霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.7 吉他霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　图 A.8 交沙霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　8

　　GB/T 22946—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)回 收 率

　　本方法中，林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 林可霉素 、红霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、克林霉素 、螺旋霉素 、吉他霉素和

　　交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　林可霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　20 . 0

　　94 . 9

　　94 . 9

　　101 . 9

　　88 . 8

　　红霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　20 . 0

　　97 . 1

　　98 . 0

　　96 . 6

　　94 . 1

　　替米考星

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　20 . 0

　　94 . 2

　　98 . 7

　　92 . 7

　　85 . 8

　　泰乐菌素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　20 . 0

　　89 . 6

　　86 . 8

　　96 . 6

　　91 . 9

　　克林霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　20 . 0

　　98 . 4

　　98 . 1

　　93 . 7

　　90 . 5

　　螺旋霉素

　　2 . 0

　　5 . 0