GB/T 22948-2008 蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22948—2008

　　蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination oftrimethoprim residuesin royaljelly—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22948—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：曹彦忠 、贾光群 、张进杰 、石玉秋 、王占英 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22948—2008

　　蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 。

　　本标准的方法检出限为 2 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　蜂王浆中残留的三 甲 氧 苄 氨 嘧 啶 用 去 离 子 水 提 取，三 氯 乙 酸 沉 淀 蛋 白，离 心 后，上 清 液 经 Oasis MCX离子交换柱1) 或相当的固相萃取柱净化，用氨水-甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙腈-0 . 1%甲酸水溶液溶解 。样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 4 三氯乙酸：优级纯 。

　　4 . 5 甲酸：优级纯 。

　　4 . 6 氨水：分析纯 。

　　4 . 7 三氯乙酸溶液：50%(质量分数)。20 g 三氯乙酸(4 . 4)溶于 20 mL水中 。

　　4 . 8 2%甲酸溶液：吸取 2 mL 甲酸(4 . 5)用水稀释至 100 mL 。

　　4 . 9 0 . 1%甲酸溶液：吸取 1 mL 甲酸(4 . 5)用水稀释至 1 000 mL 。

　　4 . 10 流动相：乙腈-0 . 1%甲酸溶液(7+13) 。

　　4 . 1 1 氨水-甲醇溶液(1+19) : 5 mL 氨水(4 . 6)与 95 mL 甲醇(4 . 2)混合均匀 。

　　4 . 12 三甲氧苄氨嘧啶标准物质(CAS:738-70-5) ：纯度 ≥99% 。

　　4 . 13 0 . 1 mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的标准物质(4 . 12) ,用甲醇配成 0 . 1 mg/mL 的标准储

　　1) Oasis MCX离子交换柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者，并 不 是 表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。

　　1

　　GB/T 22948—2008

　　备溶液，该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 14 标准工作溶液：吸取 0 . 1 mL标准储备溶液(4. 13),移至 10 mL容量瓶中，用甲醇配成 1 . 0 μg/mL的标准工作溶液 。该标准工作溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 15 Oasis MCX柱或相当 者：150 mg , 6 mL 。 用 前 依 次 用 5 mL 甲 醇 和 10 mL 水 活 化 。保 持 柱 体湿润 。

　　4 . 16 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源 。

　　5 . 2 液体混匀器 。

　　5 . 3 振荡器 。

　　5 . 4 氮气浓缩仪 。

　　5 . 5 分析天平：感量 0 . 1 mg 和 0 . 01 g 。

　　5 . 6 真空泵：真空度应达到 80 kPa 。

　　5 . 7 聚丙烯离心管：50 mL 。

　　5 . 8 移液器：0 . 1 mL , 1 mL 。

　　5 . 9 玻璃贮液器：50 mL 。

　　5 . 10 浓缩管：10 mL 。

　　6 试样制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均匀 。分出 0 . 5 kg作为试样 。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记 。

　　6 . 2 试样的保存

　　将试样于- 18 ℃冷冻保存 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取 2 g试样，精确至 0 . 01 g 。置于 50 mL具塞的聚丙烯离心管中，加入 20 mL水，于液体混匀器(5 . 2)上快速混匀 1 min,再置于振荡器(5 . 3)上振荡提取 10 min,加入 50%三氯乙酸溶液 0 . 5 mL,快速摇动 0 . 5 min , 以 3 000 r/min 离心 5 min,移取上清液至另一离心管中，再向残渣中加入 15 mL 水，重复上述步骤，合并上清液 。

　　7 . 2 净化

　　将塞有玻璃棉塞的玻璃贮液器(5 . 9)连到 Oasis MCX柱(4 . 15)上，将上清液(7 . 1)倒入玻璃贮液器(5 . 9)中，使样液以小于 3 mL/min 的流速通过 Oasis MCX柱，待样液完全流出后，分别用 5 mL 甲酸溶液(4 . 8)和 5 mL 甲醇(4 . 2)洗柱，弃去全部流出液 。最后用 5 mL 氨水-甲醇溶液(4 . 11) 洗脱，收集洗脱液于 10 mL 浓 缩 管 (5 . 10) 中 。 在 45 ℃水 浴 中 用 氮 气 浓 缩 仪 (5 . 4) 吹 干 。 准 确 加 入 1 . 0 mL 流 动 相(4 . 10)溶解残渣，样液过 0 . 2 μm 滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　7 . 3 基质标准工作溶液的制备

　　称取 4 份阴性样品各 2 g , 精确至 0 . 01 g 。置于 50 mL具塞的聚丙烯管中，分别加入 4 μL、10 μL、 20 μL、40 μL、100 μL 标 准 工 作 溶 液 (4 . 14) , 按 7 . 1 和 7 . 2 步 骤 操 作 。 制 备 成 浓 度 为 2 . 0 ng/mL、

　　2

　　GB/T 22948—2008

　　5 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、20 . 0 ng/mL、50 . 0 ng/mL 的基质标准工作溶液 。

　　7 . 4 测定条件

　　7 . 4 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Atlantis , 3 μm , 150 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：乙腈-0 . 1%甲酸溶液(7+13) ;

　　c) 流速：0 . 2 mL/min ;

　　d) 柱温：35 ℃ ;

　　e) 进样量：20 μL 。

　　7 . 4 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测;

　　d) 电喷雾电压：5 500 V ;

　　e) 雾化气压力：0 . 076 MPa ;

　　f) 气帘气压力：0 . 069 MPa ;

　　g) 辅助气流速：7 L/min ;

　　h) 离子源温度：450 ℃ ;

　　i) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压见表 1 。

　　表 1 三甲氧苄氨嘧啶的定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压

　　中文名称

　　英文名称

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　碰撞气能量/V

　　去簇电压/V

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　trimethoprim

　　291/230

　　291/123

　　291/275

　　291/230

　　35

　　40

　　35

　　50

　　50

　　50

　　7 . 5 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 5 . 1 定性测定

　　将被测组分分别选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 2 规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。

　　表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 5 . 2 定量测定

　　用基质标准工作溶液(7 . 3)分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准添加浓度(ng/mL)为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨嘧啶的参考保留时间为 2 . 39 min 。 三甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测( MRM)色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 。

　　本方法的添加平均回收率数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　7 . 6 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 7 空白试验

　　除不称取样品外，均按上述步骤进行 。

　　3

　　GB/T 22948—2008

　　8 结果计算

　　蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定结果按式(1)计算 。

　　X = c ……………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　c— 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　V— 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 的规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度范围及重复性方程见表 3 。

　　表 3 添加浓度范围及重复性和再限性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性 R

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lgr= 0 . 775 9lgm-0 . 847 5

　　lgR= 0 . 622 3lgm-0 . 681 1

　　注：m为两次测定值的平均值 。

　　如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶的添加浓度范围及再现性方程见表 3 。

　　4

　　GB/T 22948—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测( MRM)色谱图见图 A. 1 。

　　图 A.1 三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　5

　　GB/T 22948—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　本方法中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及其平均回收率试验数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　101 . 7

　　98 . 1

　　97 . 5

　　104 . 3

　　6