GB/T 22943-2008 蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22943—2008

　　蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination oftrimethoprim residuesin honey—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22943—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：曹彦忠 、贾光群 、杨志伟 、石玉秋 、孙海侠 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22943—2008

　　蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 。

　　本标准的方法检出限为 2 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法( GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　蜂蜜中残留的三甲氧苄氨嘧啶用磷酸盐缓冲溶液(pH=9) 提取，过滤后，经 Oasis HLB1) 柱或相当的固相萃取柱净化，用甲醇洗脱并蒸干，残渣用流动相溶解，过 0 . 2 μm 滤膜后，样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 4 磷酸氢二钾(K2 HPO4 ·3H2 O) ：优级纯 。

　　4 . 5 磷酸二氢钾：优级纯 。

　　4 . 6 氢氧化钠：优级纯 。

　　4 . 7 甲酸：优级纯 。

　　4 . 8 2 . 0 mol/L氢氧化钠：称取 8 . 0 g 氢氧化钠(4 . 6) ,定容至 100 mL 。

　　4 . 9 0 . 1%甲酸溶液：吸取 1 . 0 mL 甲酸(4 . 7) ,用水稀释至 1 000 mL 。

　　4 . 10 淋洗液：甲醇溶液(2+3) 。量取 40 mL 甲醇(4 . 2)与 60 mL水混合 。

　　4 . 1 1 0 . 2 mol/L磷酸盐缓冲溶液：称取 43 . 86 g 磷酸氢二钾(4 . 4) 和 1 . 05 g 磷酸二氢钾(4 . 5) ,放入1 000 mL烧杯中，加入 800 mL水溶解，用氢氧化钠(4 . 6)调至 pH 值为 9 . 0 ,再用水定容至 1 000 mL 。

　　4 . 12 流动相：乙腈-0 . 1%甲酸溶液(7+13) 。

　　1) Oasis HLB 固相萃取柱是 Waters 公司产品的商品名 称，给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者，并 不 是 表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。

　　1

　　GB/T 22943—2008

　　4 . 13 标准物质：三甲氧苄氨嘧啶 (CAS:738-70-5) ,纯度 ≥99% 。

　　4 . 14 0 . 1 mg/mL 标 准 储 备 溶 液：准 确 称 取 适 量 的 三 甲 氧 苄 氨 嘧 啶 标 准 物 质(4 . 13) , 用 甲 醇 配 成

　　0 . 1 mg/mL 的标准储备溶液 。标准储备溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 15 标准工作溶液：吸取标准储备溶液(4 . 14)0 . 1 mL移至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 16 基质标准工作溶液：吸 取 不 同 体 积 标 准 工 作 溶 液(4 . 15) ,用 空 白 样 品 提 取 液 配 成 2 . 0 ng/mL、 5 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、20 . 0 ng/mL、50 . 0 ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液 。 当天配制 。

　　4 . 17 Oasis HLB 固相萃取柱或相当者：500 mg , 6 mL 。使用前依次用 5 mL 甲醇和 10 mL水预处理，保持柱体湿润 。

　　4 . 18 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源 。

　　5 . 2 分析天平：感量 0 . 1 mg 和 0 . 01 g 。

　　5 . 3 氮气浓缩仪 。

　　5 . 4 液体混匀器 。

　　5 . 5 固相萃取装置 。

　　5 . 6 贮液器：50 mL 。

　　5 . 7 真空泵：真空度应达到 80 kPa 。

　　5 . 8 pH 计 。

　　5 . 9 吹干管：10 mL 。

　　6 试样的制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀 。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60 ℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温 。分出 0 . 5 kg作为试样 。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记 。

　　6 . 2 试样保存

　　将试样于常温下保存 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取 2 g试样，精确至 0 . 01 g 。置于 150 mL 三角瓶中，加入 25 mL 磷酸盐缓冲溶液(4 . 11) ,于液体混匀器(5 . 4)上快速混匀 1 min,使试样完全溶解 。

　　7 . 2 净化

　　将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(5 . 6) 连到 Oasis HLB 固相萃取柱(4 . 17) 上，把样液倒入玻璃贮液器中，调节流速小于 3 mL/min,使样液通过 Oasis HLB 固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用 5 mL 水和 5 mL淋洗液(4 . 10)洗柱，弃去全部流出液 。减压抽干 20 min,然后用 5 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL 吹干管中 。用氮气浓缩仪于 50 ℃吹干 。准确加入 1 . 0 mL 流动相(4 . 12) 溶解残渣，过 0 . 2 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液 。

　　2

　　GB/T 22943—2008

　　7 . 3 测定条件

　　7 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Atlantis C18 , 3 μm , 150 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流动相：乙腈-0 . 1%甲酸溶液(7+13) ;

　　c) 流速：0 . 2 mL/min ;

　　d) 柱温：30 ℃ ;

　　e) 进样量：20 μL 。

　　7 . 3 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测;

　　d) 电喷雾电压：5 500 V ;

　　e) 雾化气压力：0 . 076 MPa ;

　　f) 气帘气压力：0 . 069 MPa ;

　　g) 辅助气流速：6 L/min ;

　　h) 离子源温度：450 ℃ ;

　　i) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压见表 1 。

　　表 1 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对(m/≈)

　　定量离子对(m/≈)

　　碰撞气能量/V

　　去簇电压/V

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　trimethoprim

　　291/230

　　291/123

　　291/275

　　291/230

　　35

　　40

　　35

　　50

　　7 . 4 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 4 . 1 定性测定

　　被测组分选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 2 规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。

　　表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 4 . 2 定量测定

　　用标准工作溶液(4 . 16)分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线 。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨嘧啶的参考保留时间为 2 . 39 min 。 三甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测( MRM)色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 。

　　本方法的添加平均回收率数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　7 . 5 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 6 空白试验

　　除不称取试样外，均按上述步骤进行 。

　　3

　　8 结果计算

　　蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定结果按式(1)计算 。

　　X = c …………………………( 1 )

　　式中：

　　X— 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　c— 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　V— 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度范围及重复性方程见表 3 。

　　表 3 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 878 0 lg m- 1 . 212 9

　　lg R= 1 . 311 9 lg m-0 . 978 7

　　注：m为两次测定值的算术平均值 。

　　如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶的添加浓度范围及再现性方程见表 3 。

　　4

　　GB/T 22943—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测( MRM)色谱图见图 A. 1 。

　　图 A.1 三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　5

　　GB/T 22943—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　本方法中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率的试验数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率的试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　三甲氧苄氨嘧啶

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　104 . 1

　　99 . 0

　　101 . 8

　　104 . 3

　　6