GB/T 22941-2008 蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　ICS 67 . 050 X 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22941—2008

　　蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、

　　替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、

　　吉他霉素 、竹桃霉素残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　Determination oflincomycin，erythromycin，spiramycin，tilmicosin，

　　tylosin，josamycin，kitasamycin，oleandomycin residuesin honey—

　　LC-MS-MS method

　　2008-12-31 发布 2009-05-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22941—2008

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B 为资料性附录 。

　　本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人：曹彦忠 、张艳梅 、贾光群 、张进杰 、石玉秋 、庞国芳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 22941—2008

　　蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、

　　替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、

　　吉他霉素 、竹桃霉素残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法 。

　　本标准适用于蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素残留量的测定 。

　　本标准的方法检出限均为 2 . 0 μg/kg 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6379 . 1 测 量 方 法 与结 果 的 准 确度( 正 确度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分：总 则 与 定 义(GB/T 6379 . 1—2004 , ISO 5725-1:1994 , IDT)

　　GB/T 6379 . 2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法( GB/T 6379 . 2—2004 , ISO 5725-2:1994 , IDT)

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008 , ISO 3696:1987 , MOD)

　　3 原理

　　蜂蜜中残留的林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(pH=9)提取，过滤后，经 Oasis HLB 固相萃取柱1) 或相当的固相萃取柱净化，用甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙腈-0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液溶解，过 0 . 2 μm 滤膜后，样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量 。

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 水：GB/T 6682 , 一级 。

　　4 . 2 甲醇：色谱纯 。

　　4 . 3 乙腈：色谱纯 。

　　4 . 4 三羟甲基氨基甲烷(Tris) ：优级纯 。

　　4 . 5 氯化钙(CaCl2 ·2H2 O) ：优级纯 。

　　4 . 6 乙酸铵：优级纯 。

　　1) Oasis HLB 固相萃取柱是 Waters 公司产品的商品名 称，给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者，并 不 是 表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。

　　1

　　GB/T 22941—2008

　　4 . 7 盐酸：优级纯 。

　　4 . 8 淋洗液：甲醇溶液(2+3) 。量取 40 mL 甲醇(4 . 2)与 60 mL水混合 。

　　4 . 9 0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液：称取 0 . 77 g 乙酸铵(4 . 6)溶于 1 000 mL水中 。

　　4 . 10 0 . 2 mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 缓冲溶液：称取 12 . 0 g 三羟甲基氨基甲烷(4 . 4) 和 7 . 35 g氯化钙(4 . 5) ,放入 1 000 mL烧杯中，加入 800 mL水溶解，用盐酸(4 . 7)调至 pH 值为 9 . 0 ,再用水定容至 1 000 mL 。

　　4 . 1 1 定容液：乙腈-0 . 01 mol/L 乙酸铵溶液(3+17) 。量 取 15 mL 乙 腈(4 . 3) 和 85 mL 乙 酸 铵 溶 液(4 . 9)混合均匀 。

　　4 . 12 标准物质：林可霉素(CAS:7179-49-9) 、红霉素(CAS:59319-72-1) 、螺旋霉素(CAS:8025-81-8) 、替米考星(CAS: 108050-54-0) 、泰 乐 菌 素 (CAS: 74610-55-2) 、交 沙 霉 素 (CAS: 16846-24-5) 、吉 他 霉 素 (CAS:1392-21-8) 、竹桃霉素(CAS:7060-74-4) ,纯度 ≥99% 。

　　4 . 13 0 . 1 mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的各标准物质(4 . 12) ,用甲醇分别配成 0 . 1 mg/mL 的标准储备溶液 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 14 1 . 0 μg/mL混合标准工作溶液：吸取各标准储备溶液(4 . 13)0 . 1 mL移至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 15 内标物质：罗红霉素(CAS:80214-83-1) 、克林霉素(CAS:21462-39-5) ,纯度 ≥99% 。

　　4 . 16 0 . 1 mg/mL 罗红霉素 、克林霉素内标储备溶液：准确称取适量的罗 红 霉 素 、克 林 霉 素 标 准 物 质(4 . 15) ,用甲醇配成 0 . 1 mg/mL 的内标储备溶液 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 17 1 . 0 μg/mL混合内标工作溶液：分别吸取罗红霉素和克林霉素内标储备溶液(4 . 16) 0 . 1 mL 移至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度 。该溶液在 4 ℃保存 。

　　4 . 18 基质标准工作溶液：吸取不同体积混合标准工作溶液(4 . 14)和 20 μL混合内标工作溶液(4 . 17) ,用空白样品提取液配成 2 . 0 ng/mL、5 . 0 ng/mL、10 . 0 ng/mL、20 . 0 ng/mL、50 . 0 ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液 。 当天配制 。

　　4 . 19 Oasis HLB 固相萃取柱或相当者：200 mg , 6 mL 。使用前依次用 5 mL 甲醇(4 . 2)和 10 mL水活化，保持柱体湿润 。

　　4 . 20 滤膜：0 . 2 μm 。

　　5 仪器

　　5 . 1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源 。

　　5 . 2 分析天平：感量 0 . 1 mg 和 0 . 01 g 。

　　5 . 3 氮气浓缩仪 。

　　5 . 4 液体混匀器 。

　　5 . 5 贮液器：50 mL 。

　　5 . 6 真空泵：最大负压 80 kPa 。

　　5 . 7 固相萃取装置 。

　　5 . 8 吹干管：10 mL 。

　　6 试样的制备与保存

　　6 . 1 试样的制备

　　对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀 。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60 ℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温 。分出 0 . 5 kg作为试样 。制备好的试样置于样品瓶

　　2

　　GB/T 22941—2008

　　中，密封，并做上标记 。

　　6 . 2 试样保存

　　将试样于常温下保存 。

　　7 测定步骤

　　7 . 1 提取

　　称取 2 g试样，精确至 0 . 01 g 。置于 150 mL 三角瓶中，加入 20 μL混合内标工作溶液(4 . 17) ,加入25 mL Tris 缓冲溶液(4 . 10) ,于液体混匀器(5 . 4)上快速混匀 1 min,使试样完全溶解 。

　　7 . 2 净化

　　将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(5 . 5) 连到 Oasis HLB 固相萃取柱(4 . 19) 上，把样液倒入玻璃贮液器中，调节流速小于 3 mL/min,待样液完全流出后，依次用 5 mL水和 5 mL 淋洗液(4 . 8) 洗柱，弃去全部流出液 。减压抽干 20 min,然后用 5 mL 甲醇(4 . 2)洗脱，收集洗脱液于 10 mL 吹干管(5 . 8)中 。用氮气浓缩仪(5 . 3)于 50 ℃吹干 。准确加入 1 . 0 mL定容液(4 . 11)溶解残渣，过 0 . 2 μm 滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定 。

　　按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的样品空白提取液 。

　　7 . 3 测定条件

　　7 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：Atlantis C18 , 3 μm , 150 mm×2 . 1 mm(内径)或相当者;

　　b) 流速：0 . 2 mL/min ;

　　c) 柱温：30 ℃ ;

　　d) 进样量：20 μL ;

　　e) 流动相：A：乙腈，B: 0 . 1%甲酸溶液，C： 甲醇 。梯度洗脱条件见表 1 。

　　表 1 梯度洗脱条件

　　时间/min

　　A/%

　　B/%

　　C/%

　　0 . 00

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　5 . 00

　　5 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　9 . 00

　　5 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　9 . 10

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　17 . 0

　　90 . 0

　　5 . 0

　　5 . 0

　　7 . 3 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式：正离子扫描;

　　c) 检测方式：多反应监测;

　　d) 电喷雾电压：5 500 V ;

　　e) 雾化气压力：0 . 069 MPa ;

　　f) 气帘气压力：0 . 069 MPa ;

　　g) 辅助气流速：7 L/min ;

　　h) 离子源温度：450 ℃ ;

　　i) 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压见表 2 。

　　3

　　GB/T 22941—2008

　　表 2 定性离子对 、定量离子对 、碰撞气能量和去簇电压

　　化合物中文名称

　　化合物英文名称

　　定性离子对

　　(m/≈)

　　定量离子对

　　(m/≈)

　　碰撞气能量/

　　V

　　去簇电压/

　　V

　　林可霉素

　　lincomycin

　　407/126

　　407/359

　　407/126

　　37

　　24

　　50

　　50

　　红霉素

　　erythromycin

　　688/158

　　688/544

　　688/158

　　42

　　23

　　30

　　30

　　螺旋霉素

　　spiramycin

　　734/158

　　734/576

　　734/158

　　42

　　28

　　50

　　50

　　替米考星

　　tilmicosin

　　869/174

　　869/132

　　869/174

　　62

　　70

　　90

　　90

　　泰乐菌素

　　tylosin

　　916/174

　　916/145

　　916/174

　　54

　　55

　　80

　　80

　　交沙霉素

　　josamycin

　　425/126

　　425/377

　　425/126

　　45

　　25

　　53

　　53

　　吉他霉素

　　kitasamycin

　　843/142

　　843/174

　　843/142

　　48

　　50

　　60

　　60

　　竹桃霉素

　　oleandomycin

　　772/215

　　772/109

　　772/215

　　42

　　70

　　70

　　70

　　7 . 4 液相色谱-串联质谱测定

　　7 . 4 . 1 定性测定

　　被测组分选择 1 个母离子，2 个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2 . 5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 3 规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物 。

　　表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示

　　相对离子丰度 K

　　K>50

　　20

　　10

　　K≤10

　　允许最大偏差

　　± 20

　　± 25

　　± 30

　　± 50

　　7 . 4 . 2 定量测定

　　在仪器的最佳工作条件下，用基质标准工作溶液(4 . 18)分别进样，以各标准溶液中被测组分峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各标准溶液被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量 。样品溶液中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素的参考保留时间见表 4 。林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素的标准物质多反应监测( MRM)色谱图参见附录 A 中的图 A. 1 。

　　本方法的添加平均回收率数据参见附录 B 中的表 B. 1 。

　　表 4 林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉参考保留时间

　　化合物名称

　　保留时间/min

　　林可霉素

　　7 . 61

　　红霉素

　　9 . 96

　　4

　　GB/T 22941—2008

　　表 4(续)

　　化合物名称

　　保留时间/min

　　螺旋霉素

　　8 . 91

　　替米考星

　　9 . 56

　　泰乐菌素

　　10 . 04

　　交沙霉素

　　11 . 33

　　吉他霉素

　　10 . 62

　　竹桃霉素

　　9 . 72

　　7 . 5 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 。

　　7 . 6 空白试验

　　除不称取试样外，均按上述步骤进行 。

　　8 结果计算

　　蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素残留量的测定结果按式(1)计算：

　　X = c

　　式中：

　　X— 试样中被测物残留量，单位为微克每千克(μg/kg) ;

　　cs — 基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　A— 试样溶液中被测物的色谱峰面积;

　　As — 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积;

　　ci— 试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　csi— 基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　Asi— 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积;

　　Ai— 试样溶液中内标物的色谱峰面积;

　　V— 样液最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　m— 试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g) 。

　　计算结果应扣除空白值 。

　　9 精密度

　　9 . 1 一般规定

　　本标准的精密度数据是按照 GB/T 6379 . 1 和 GB/T 6379 . 2 规定确定的，其重复性和再现性的值是以 95%的可信度来计算 。

　　9 . 2 重复性

　　在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素添加浓度范围及重复性方程见表 5 。

　　5

　　表 5 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克

　　化合物名称

　　添加浓度范围

　　重复性限 r

　　再现性限 R

　　林可霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 051 0 lg m- 1 . 265 0

　　lg R= 0 . 865 6 lg m-0 . 652 0

　　红霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 033 5 lg m- 1 . 225 1

　　lg R= 1 . 110 8 lg m-0 . 990 1

　　螺旋霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 870 2 lg m- 1 . 101 4

　　lg R= 1 . 102 8 lg m- 1 . 016 0

　　替米考星

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 093 4 lg m- 1 . 349 1

　　lg R= 0 . 962 1 lg m-0 . 807 0

　　泰乐菌素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 970 7 lg m- 1 . 146 3

　　lg R= 0 . 815 7 lg m-0 . 680 1

　　交沙霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 937 9 lg m- 1 . 177 0

　　lg R= 0 . 857 1 lg m-0 . 756 5

　　吉他霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 1 . 020 8 lg m- 1 . 338 6

　　lg R= 0 . 959 8 lg m-0 . 900 4

　　竹桃霉素

　　2 . 0 ~ 50 . 0

　　lg r= 0 . 975 7 lg m- 1 . 274 2

　　lg R= 0 . 886 3 lg m-0 . 584 9

　　注：m为两次测定值的算术平均值 。

　　如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 。

　　9 . 3 再现性

　　在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，蜂蜜中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素的添加浓度范围及再现性方程见表 5 。

　　6

　　GB/T 22941—2008

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素标准物质多反应监测( MRM)色谱图见图 A. 1 。

　　图 A.1 标准物质多反应监测(MRM)色谱图

　　7

　　GB/T 22941—2008

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回 收 率

　　本方法中林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素添加浓度及平均回收率的试验数据见表 B. 1 。

　　表 B.1 林可霉素 、红霉素 、螺旋霉素 、替米考星 、泰乐菌素 、交沙霉素 、吉他霉素 、竹桃霉素

　　添加浓度及平均回收率的试验数据

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　林可霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　100 . 0

　　99 . 4

　　95 . 7

　　94 . 9

　　红霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　85 . 7

　　86 . 2

　　87 . 7

　　90 . 8

　　螺旋霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　83 . 9

　　83 . 7

　　82 . 8

　　87 . 7

　　替米考星

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　84 . 9

　　87 . 6

　　90 . 4

　　89 . 3

　　泰乐菌素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　86 . 4

　　84 . 4

　　86 . 7

　　88 . 8

　　交沙霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　80 . 6

　　86 . 0

　　77 . 7

　　84 . 0

　　吉他霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　79 . 3

　　83 . 4

　　79 . 3

　　83 . 0

　　8

　　表 B.1(续)

　　化合物名称

　　添加浓度/(μg/kg)

　　平均回收率/%

　　竹桃霉素

　　2 . 0

　　5 . 0

　　10 . 0

　　50 . 0

　　83 . 0

　　83 . 8

　　84 . 6