GB/T 22910-2023 痒病诊断技术

　　ICS 1 1 . 220 CCS B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 22910—2023代替 GB/T22910—2008

　　痒 病 诊 断 技 术

　　Diagnostic techniques for scrapie

　　2023-09-07 发布 2024-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 22910—2023

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 22910—2008《痒病诊断技术》' 与 GB/T 22910—2008 相比 ' 除结构调整和编辑性改动外 ' 主要技术变化如下:

　　— 增加了组织病理染色法 、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围(见第 1 章) ;

　　— 更改了临床症状的描述(见 6 . 2 ' 2008 年版的第 2 章) ;

　　— 更改了 H . E组织病理染色法操作步骤(见第 8 章 ' 2008 年版的 3 . 1)和免疫组织化学方法操作步骤(见第 9 章 ' 2008 年版的 3 . 2) ;

　　— 增加了免疫印迹方法(见第 10 章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 。

　　本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心 。

　　本文件主要起草人:刘雨田 、王志亮 、孙成友 、邹艳丽 、迟田英 、宋芳芳 、于小静 、刘春菊 、任炜杰 、戈胜强 、徐天刚 、左媛媛 、吴晓东 、孙涛 、王树双 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:

　　— 2008 年首次发布为 GB/T 22910—2008 ;

　　— 本次为第一次修订 。

　　I

　　GB/T 22910—2023

　　引 言

　　痒病(Scrapie)是由肮病毒(prion)引起的 自然发生于绵羊和山羊的一种进行性 、致死性 、神经退行性传染病 ' 对多种动物健康构成威胁 ' 世界动物卫生组织(WOAH)将其列为严重影响国际贸易的动物疫病之一 ' 我国将其归为一类动物疫病 。毒株和宿主的不同决定了痒病表型 。典型痒病自然条件下具有水平传播和垂直传播的能力 ' 多发于 2 岁 ~5 岁的绵羊 ' 潜伏期一般为 1 年 ~3 年 ' 山羊的潜伏期一般不超过 1 年 ' 18 月龄以下和 5 岁以上的绵羊和山羊罕见 。非典型痒病的潜伏期明显长于典型痒病的潜伏期 ' 多发生在 5 岁以上的绵羊 ' 有的甚至发生在 10 岁以上的绵羊 ' 且具有散发性特点 ' 自然条件下不具备水平传播和垂直传播的能力 。

　　大多数痒病病羊具有典型的临床症状 ' 但是确诊需结合实验室诊断来实现 。痒病的病原是动物机体内正常肮蛋白的异构体 ' 在病羊血清里无法检测出痒病肮病毒抗体 ' 所以血清学检测在痒病诊断方面没有意义 。 目前 ' 实验室诊断方法多以检测痒病病原为目的 ' 包括免疫组织化学方法 、免疫印迹方法 、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法等 ' 其中 ' 免疫组织化学方法和免疫印迹方法是 WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》规定的痒病确诊方法 。痒病病羊的中枢神经被肮病毒侵害会出现海绵状空泡变性 ' 在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下 ' 应用 H ● E组织病理染色法可以观察到这些病变 。WOAH 《陆生动物诊断试验和疫苗手册》规定在使用免疫组织化学方法诊断痒病时 ' 同时使用 H ● E 组织病理染色法予以辅助确诊;在使用免疫印迹方法诊断痒病时 ' 如果样品适合进行 H ● E 组织病理染色 ' 那么也同时使用 H ● E组织病理染色法予以辅助确诊 。

　　GB/T 22910—2008 发布实施已十余年 ' 其仅包括临床诊断 、组织病理学检查 、免疫组织化学检查等 3 种诊断方法 ' 未包括 WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》指定的免疫印迹方法 。 相较于免疫组织化学方法 ' 免疫印迹方法灵敏性和特异性更强 ' 是痒病诊断技术中一种更优的确诊方法 。本次修订增加的免疫印迹方法是参照 WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2018 年版)第 3 . 7 . 11 章和《英国WOAH 痒病参考实验室痒病诊断手册》而制定 ' 技术方法与 WOAH 推荐的方法一致 ' 能更好地服务于我国痒病的监测工作 。

　　Ⅱ

　　GB/T 22910—2023

　　痒 病 诊 断 技 术

　　1 范围

　　本文件规定了痒病的临床诊断'描述了 H ● E组织病理染色法 、免疫组织化学方法 、免疫印迹方法。本文件适应于痒病的诊断 、检测 、检疫 、监测和流行病学调查。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　AEC:3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethyl carbazole)

　　H ● E:苏木精伊红(hematoxylin and eosin)

　　HRP:辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)

　　PBS:磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)

　　PK 酶:蛋白酶 K(proteinase K)

　　PrP:肮蛋白(prion protein)

　　PVDF:聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride)

　　SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)

　　TBST:含吐温的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl buffered solution with Tween)

　　5 生物安全措施

　　样品采集与处理 、H ● E 组织病理染色法 、免疫组织化学 、免疫印迹的试验操作应在生物安全 Ⅱ 级及以上的实验窒进行'组织匀浆 、消化以及变性的试验步骤需在负压罩下操作。

　　6 临床诊断

　　6 . 1 易感动物

　　绵羊和山羊'但绵羊的易感性与 PrP基因的多态性有关。

　　1

　　GB/T 22910—2023

　　6 . 2 临床症状

　　6 . 2 . 1 行为异常

　　病初症状不易被察觉 ' 表现为易疲劳 ' 步态不稳并逐渐加重 。 时常欲饮水却饮用很少 。此外 ' 表现为焦躁不安 、恐惧 、精神错乱;具攻击性或离群独处 ' 呆立一旁;摇头竖耳 、凝视 。非典型痒病有时会出现转圈运动 。症状出现 3 个 ~4 个月后 ' 异常行为更加明显 。

　　6 . 2 . 2 瘙痒

　　瘙痒是痒病的重要临床症状 。表现为病羊将头部 、胁部或臀部靠在支撑物上强迫性摩擦 ' 甚至啃咬或用后蹄踢抓身体痒感处 ' 致使头部 、面部 、耳部 、侧胸 、四肢 、尾部等多处皮肤脱毛 、破损甚至撕脱 。人为抓病羊尻部脊梁部可诱使啃咬反应或反射性伸颈摇头 、咬唇等反应 。

　　6 . 2 . 3 感觉或反应过敏

　　病羊对声音敏感 ' 易受惊 。有的病例表现出肌肉震颤 ' 因人接近而震颤加重 ' 安静时则变轻 。

　　6 . 2 . 4 共济失调

　　表现为转弯僵硬 ' 行走或奔跑时高抬后肢 ' 臀部摇摆过度 ' 发病后期共济失调加重而倒地不起 。

　　6 . 2 . 5 体重和体况下降

　　病羊体重和体况明显下降 ' 并随着病程的发展进一步恶化 ' 最后衰竭死亡 。

　　6 . 3 结果判定

　　典型痒病通常表现出 6 . 2 所描述的临床症状 ' 而非典型痒病主要表现共济失调 ' 有时会出现转圈运动 ' 无瘙痒症状 。根据 6 . 2 . 1 、6 . 2 . 2 、6 . 2 . 3 和/或 6 . 2 . 4 的临床症状可初步判定为痒病疑似病例 ' 确诊则应采集易感动物的脑组织和淋巴组织进行实验室诊断 。

　　7 样品采集与处理

　　7 . 1 仪器设备

　　电锯/钢锯 、骨钳 、眼科剪 、眼科镊 、直形镊(长约 25 cm) 、止血钳 、毛剪 、手术刀 、切片刀 、烘烤箱 、脱水筐 、染色缸 、包埋模具 、载玻片 、玻璃棒 、铅笔 、量筒(量程分别为 100 mL、1 000 mL、5 000 mL) 、75%乙醇棉球 、通风橱 、切片机 、组织匀浆机 。

　　7 . 2 试剂

　　7 . 2 . 1 10%中性福尔马林固定液 ' 按照附录 A 中 A. 1 的方法配制 。

　　7 . 2 . 2 98%甲酸 。

　　7 . 2 . 3 无水乙醇 。

　　7 . 2 . 4 2%盐酸利多卡因 。

　　7 . 2 . 5 三氯甲烷 。

　　7 . 2 . 6 二甲苯 。

　　7 . 2 . 7 软蜡(熔点 56 ℃) 。

　　7 . 2 . 8 硬蜡(熔点 60 ℃) 。

　　2

　　GB/T 22910—2023

　　7 . 3 样品采集

　　7 . 3 . 1 脑组织样品

　　将羊头固定 ' 用电锯从前额两羊角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开 ' 使脑部暴露。 剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管 ' 取出整脑 ' 包括大脑 、小脑和完整脑干。 大规模监测采样时 ' 可用专用采样勺从枕骨大孔处取出延脑部组织。 采样勺取样时 ' 先上 、下 、左 、右 4 个方向剪开脑硬膜 ' 再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一圈以切断脑神经和血管 ' 然后紧贴颅腔壁插入采样勺 ' 插入深度 3 cm ~ 5 cm。用力将采样勺的手柄往上翘 ' 再往下切断脑组织 ' 然后左右切断脑组织 ' 最后将切下的脑组织往外抠出。 采集的脑组织用于 H ● E组织病理染色 、免疫组织化学和免疫印迹检测。

　　7 . 3 . 2 淋巴组织样品

　　7 . 3 . 2 . 1 羊只处死后 ' 用手术刀取 2 份大小约 2 cm×2 cm× 1 cm 脾脏组织块 ' 取 2 份肠系膜淋巴结和2 份腹股沟淋巴结。 采集的淋巴组织用于免疫组织化学和免疫印迹检测。

　　7 . 3 . 2 . 2 活体检测绵羊痒病时 ' 可采集眼睑黏膜表层淋巴组织(即第三眼睑) 。在绵羊的眼角滴 2%盐酸利多卡因局部麻醉后 ' 用消毒的止血钳 、眼科镊翻转并固定第三眼睑 ' 再用消毒的毛剪剪取第三眼睑。该组织用于免疫组织化学和免疫印迹检测。

　　7 . 4 样品处理

　　7 . 4 . 1 固定

　　将用于制作组织切片的脑组织和淋巴组织直接放入 10 倍体积的 10%中性福尔马林固定液中渗透固定 96 h ' 到期后更换新配制的 10%中性福尔马林固定液再固定 48 h 。 固定后的样品用于 H ● E组织病理染色和免疫组织化学检测。

　　7 . 4 . 2 匀浆和离心

　　适用于免疫印迹检测。 样品在匀浆处理前应在 — 15 ℃ ~ — 20 ℃冷冻保存待用。 取 100 mg ~ 130 mg组织放入 1 . 5 mL的匀浆管中 ' 加入 1 . 2 mL匀浆缓冲液 ' 以 6 200 r/min 的速度匀浆 45 s 。将匀浆好的样品吸取至 1 . 5 mL离心管中 ' 以 7 000g 离心 5 min ' 然后将上清移至另一离心管中待用。

　　7 . 5 组织切片制作

　　7 . 5 . 1 取材

　　7 . 5 . 1 . 1 用手术刀将大脑 、小脑 、脑干组织分离开 ' 分别横切成 3 mm~5 mm 厚的组织块 ' 选取以下部位组织做进一步处理:大脑 、小脑 、丘脑 、脑门 、延髓。 适当修剪这 5 块组织边角以适用脱水筐大小 ' 剩余组织继续固定以备用。 用脱水筐装好检测用的组织块 ' 并用铅笔做好标记 ' 盖好脱水筐盖。

　　7 . 5 . 1 . 2 用手术刀将淋巴组织靠近组织边缘切出一个切面 ' 弃去边缘小块组织 ' 然后靠近切面以平行方向继续切取 3 mm~5 mm厚的组织块 ' 大小以适应脱水筐为准 ' 剩余组织继续固定以备用。 用铅笔在脱水筐上做好标记 ' 盖好脱水筐盖。

　　7 . 5 . 2 甲酸处理

　　将装有组织块的脱水筐移入 98%甲酸中作用 1 h ' 自来水冲洗 20 min ' 然后再移入新配制 10%中性福尔马林固定液中处理 3 h 。

　　3

　　GB/T 22910—2023

　　7 . 5 . 3 脱甲醛

　　将装有组织块的脱水筐放入染色缸中 ' 用缓慢流动的自来水漂洗 24 h 。

　　7 . 5 . 4 脱水

　　将装有组织块的脱水筐放入染色缸中 ' 依次在以下梯度乙醇中分别浸泡脱水:75%乙醇 2 h ' 85%乙醇 2 h ' 95%乙醇 2 h ' 再次入新的 95%乙醇 2 h ' 然后入无水乙醇 2 h ' 再次入新的无水乙醇 2 h 。

　　7 . 5 . 5 透明

　　脑组织入三氯甲烷浸泡 2 . 5 h 或者入二甲苯浸泡 40 min 透明处理 ' 然后入新的三氯甲烷浸泡 3 h或者入新的二甲苯浸泡 30 min处理 。

　　淋巴组织入三氯甲烷浸泡 2 . 5 h 或者入二甲苯浸泡 20 min 透明处理 。 然后入新的三氯甲烷浸泡3 h或者入新的二甲苯浸泡 10 min处理 。

　　7 . 5 . 6 浸蜡

　　在温度为 60 ℃下 ' 依次入石蜡中浸蜡处理:软蜡浸泡 40 min ' 再次入新的软蜡浸泡 1 h ' 然后硬蜡浸泡 1 h 。

　　7 . 5 . 7 包埋

　　7 . 5 . 7 . 1 若包埋模具为金属条结构 ' 则先组装好包埋模具 ' 放置在光滑平整的金属台面上 ' 再将熔化的新硬蜡倒入包埋模具里 ' 直至倒满 ' 然后将浸好蜡的组织块放入其中 ' 注意待切片的一面朝下 ' 并放平整 。如果一个模具里可放置多个组织 ' 则两个组织之间距离应大于 1 . 5 cm 。冷却好后 ' 修切成形 ' 获得平整石蜡组织块 ' 然后在组织块上贴好标签 。

　　7 . 5 . 7 . 2 如果包埋模具为凹型的包埋机专用模具 ' 则先将模具加热至 70 ℃ ' 放置在相同温度的金属台面上 ' 然后滴满熔化的新硬蜡 ' 再将浸好蜡的组织块放入其中 ' 用无盖的脱水筐放于其上 ' 最后将含有组织的包埋模具平移至冷台上 。 冷却好后 ' 将脱水筐取下 ' 获得平整石蜡组织块 ' 然后在组织块上贴好标签 。

　　7 . 5 . 8 切片

　　将石蜡组织块切成 5 μm厚的组织薄片 。每块组织连续切片 3 片 ~10 片 ' 切片刀 、碎屑和废弃组织应进行收集并焚烧处理 。组织薄片用干净的黏附剂预处理过的载玻片贴片 ' 组织应贴在磨砂面/标记面的同侧 ' 然后在载玻片上做好标记 。

　　7 . 5 . 9 烤片

　　贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干 ' 然后放入烘烤箱中 50 ℃烘烤 4 h 以上 。

　　8 H . E 组织病理染色法

　　8 . 1 设备器材

　　显微镜 、盖玻片 、染色架 、通风橱 。

　　8 . 2 试剂

　　8 . 2 . 1 无水乙醇 。

　　4

　　GB/T 22910—2023

　　8 . 2 . 2 75%乙醇 。

　　8 . 2 . 3 85%乙醇 。

　　8 . 2 . 4 95%乙醇 。

　　8 . 2 . 5 二甲苯 。

　　8 . 2 . 6 苏木素染液(H ● E染液) ' 按照 A. 2 的方法配制。

　　8 . 2 . 7 1%盐酸乙醇 ' 按照 A. 3 的方法配制。

　　8 . 2 . 8 饱和碳酸锂水溶液 ' 按照 A. 4 的方法配制。

　　8 . 2 . 9 95%乙醇伊红溶液 ' 按照 A. 5 的方法配制。

　　8 . 2 . 10 中性树胶 。

　　8 . 3 组织染色

　　8 . 3 . 1 脱蜡和脱二甲苯

　　取 7 . 5 . 9 烘 烤 好 的 玻 片 整 齐 放 在 染 色 架 上 ' 依 次 在 以 下 试 剂 中 脱 蜡 和 脱二 甲 苯 : 入 二 甲 苯10 min ' 再次入新的二甲苯 10 min ' 无水乙醇 2 min ' 再次入新的无水乙醇 2 min ' 95%乙醇 2 min ' 再次入新的 95%乙醇 2 min ' 85%乙醇 2 min ' 75%乙醇 2 min ' 自来水洗 2 min。

　　8 . 3 . 2 H . E 染色

　　脱蜡和脱二甲苯后的玻片入苏木素染液 15 min ' 自来水漂洗 2 min ' 1%盐酸乙醇 10 s ' 自来水漂洗

　　5 min ' 饱和碳酸锂水溶液 30 s ' 自来水漂洗 10 min ' 75%乙醇 2 min ' 85%乙醇 2 min ' 95%乙醇伊红液

　　1 min 。

　　8 . 3 . 3 脱水和透明

　　H ● E染色后的玻片入 95%乙醇 2 min ' 无水乙醇 2 min ' 再次入新的无水乙醇 2 min ' 二甲苯2 min ' 再次入新的二甲苯 2 min。

　　8 . 3 . 4 封片

　　用干净玻璃棒取 1 滴中性树胶 ' 滴加在脱水和透明后的玻片组织上 ' 再用干净的盖玻片进行封片 ' 放置在平整的台面上使其自然干燥。 或者 ' 通过专门的封片机器进行封片。

　　8 . 3 . 5 镜检及判定

　　8 . 3 . 5 . 1 分别在倍数为 10×10 、10 × 20 和 10 × 40 的光学显微镜下观察切片。

　　8 . 3 . 5 . 2 阳性结果。 灰质区出现空泡变性 ' 特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆形空泡 ' 空泡内不着色或被伊红淡染 ' 界限明显 ' 胞核被挤压于一侧 ' 甚至消失;有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀大 ' 成为“气球样”空泡性神经细胞。 典型痒病容易出现空泡病变的部位是延髓的迷走神经背核 、舌下神经核 、橄榄核 、网状结构 ' 中脑的红核 、被盖核和丘脑内各核群等处 ' 且呈双侧对称性分布 。而非典型痒病的空泡化病变通常出现在小脑 、大脑皮质和基底神经节。

　　8.3.5.3

　　阴性结果。 灰质区无特征性空泡变性。

　　8.3.5.4

　　在正常情况下 ' 动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现 ' 但不呈双侧对称 ' 应注

　　意区别。

　　若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变 ' 则用免疫组织化学方法做进一步诊断。

　　组织病理学诊断只是痒病确诊的辅助方法 ' 确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法。

　　5

　　GB/T 22910—2023

　　9 免疫组织化学方法

　　9 . 1 仪器设备

　　高压锅(温度能达到 134 ℃) 、水浴锅 、恒温箱 、电磁炉 、用于烧水的金属锅 、直径不少于 18 cm 的陶瓷锅 、湿盒(在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒) 、微量移液器(量程分别为 0. 5 μL~10 μL、 5 μL~50 μL、10 μL~100 μL、50 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL) 。

　　9 . 2 试剂

　　9 . 2 . 1 无水乙醇 。

　　9 . 2 . 2 75%乙醇 。

　　9 . 2 . 3 85%乙醇 。

　　9 . 2 . 4 95%乙醇 。

　　9 . 2 . 5 二甲苯 。

　　9 . 2 . 6 蛋白酶 K缓冲液 ' 按照附录 B 中 B. 1 的方法配制 。

　　9 . 2 . 7 蛋白酶 K工作液 ' 按照 B. 2 的方法配制 。

　　9 . 2 . 8 高压缓冲液 ' 按照 B. 3 的方法配制 。

　　9 . 2 . 9 3%过氧化氢-甲醇 ' 按照 B. 4 的方法配制 ' 如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂 ' 则使用试剂盒中的试剂 。

　　9 . 2 . 10 0. 1 mol/LPBS' 按照 B. 5 的方法配制 。

　　9 . 2 . 1 1 5%正常猪血清 ' 按照 B. 6 的方法配制 ' 如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂 ' 则使用试剂盒中的试剂 ' 但不应使用反刍动物源性血清 。

　　9 . 2 . 12 Mayer 氏苏木素液(商品化产品) 。

　　9 . 2 . 13 水溶性封片剂(商品化产品) 。

　　9 . 2 . 14 二步法免疫组织化学显色试剂盒(商品化产品 ' 其中二抗应为抗鼠二抗) 。

　　9 . 2 . 15 一抗(商品化产品)工作液 ' 按照 B. 7 的方法配制 。

　　9 . 3 试验步骤

　　9 . 3 . 1 设置痒病阳性和阴性对照组织切片 。

　　9 . 3 . 2 取 7 . 5 . 9 烘烤好的玻片和对照切片整齐放在染色架上 ' 依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯:入二甲苯 10 min ' 再次入新的二甲苯 10 min ' 100%乙醇 2 min ' 再次入新的 100%乙醇 2 min ' 95%乙醇2 min ' 再次入新的 95%乙醇 2 min ' 85%乙醇 2 min ' 75%乙醇 2 min ' 自来水洗 2 min 。

　　9 . 3 . 3 从自来水中取出装有玻片的染色架 ' 在 PBS中洗 3 次 ' 每次 5 min 。在洗第一次 PBS的同时 ' 配制适量的蛋白酶 K缓冲液 ' 并放入水浴锅中预热至 37 ℃ 。

　　9 . 3 . 4 在最后一次 PBS漂洗时 ' 配制好蛋白酶 K工作液 。PBS洗完后 ' 立即将玻片放入装有蛋白酶 K工作液的染色缸中 ' 并确保玻片上的组织全部浸入液体 ' 在 37 ℃水浴中消化处理 15 min 。

　　9 . 3 . 5 将配制好的高压缓冲液倒入陶瓷锅 ' 并立即将玻片放入其中 ' 确保玻片完全浸入水中 ' 盖好盒盖 ' 在 121 ℃高压处理 20 min ' 自然冷却至 60 ℃以下取出 。

　　9 . 3 . 6 在 PBS中洗 3 次 ' 每次 5 min ' 洗最后一遍时配制好 3%过氧化氢-甲醇溶液 。

　　9 . 3 . 7 将玻片完全浸入 3%过氧化氢-甲醇溶液中室温处理 5 min 。

　　9 . 3 . 8 在 PBS中洗 3 次 ' 每次 5 min 。

　　9 . 3 . 9 使用前 5 min配制好 5%正常猪血清 。在玻片的组织上滴满 5%正常猪血清 ' 置湿盒中室温作用20 min 。

　　6

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　　9 . 3 . 10 弃去正常猪血清'用吸水纸吸干组织四周的液体。

　　9 . 3 . 1 1 使用前 5 min配制好一抗工作液。 将一抗工作液滴加在玻片的组织上'确保组织完全覆盖'湿盒中 37 ℃作用 4 h'或者在 2 ℃ ~8 ℃下作用 12 h 以上。

　　9 . 3 . 12 在 PBS中洗 3 次'每次 5 min。 取出。

　　9 . 3 . 13 洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体。 用前 15 min取出 2℃ ~8 ℃下保存的免疫组织化学显色试剂盒'使其回温至室温状态。 在玻片的组织上滴满显色试剂盒中的抗鼠二抗'湿盒中室温作用30 min 。

　　9 . 3 . 14 在 PBS中洗 3 次'每次 5 min。

　　9 . 3 . 15 洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体'然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液'确保组织完全覆盖'湿盒中室温避光作用 5 min~10 min。

　　9 . 3 . 16 在蒸馏水中漂洗 3 次'每次 3 min。

　　9 . 3 . 17 将玻片放入 Mayer 氏苏木素液复染作用 1 min。

　　9 . 3 . 18 在蒸馏水中漂洗 5 min。

　　9 . 3 . 19 用水溶性封片剂封片。

　　9 . 4 结果判定

　　9 . 4 . 1 在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下'分别在倍数为 10×10 、10× 20 和 10× 40 的光学显微镜下观察组织玻片'进行结果判定。

　　9 . 4 . 2 阳性结果:脑组织灰质区特别是脑门部的迷走神经背核和孤束核等处或者淋巴组织的淋巴小结出现特异性颗粒状染色'则判定为痒病阳性。

　　9 . 4 . 3 阴性结果:脑组织灰质区和淋巴组织的淋巴小结均未见特异性颗粒状染色'则判定为痒病阴性。

　　10 免疫印迹方法

　　10 . 1 仪器设备

　　电泳仪 、半干转印仪 、化学发光成像仪 、恒温培养箱(精度 ±0 . 5 ℃) 、金属浴 、摇床 、电子天平 、平皿(直径为 12 cm~15 cm) 、玻璃棒 、保鲜膜 、玻璃板(大小约 20 cm× 20 cm) 、专用铲刀 、微量移液器(量程分别为 0. 5 μL~10 μL、5 μL~50 μL、10 μL~100 μL、50 μL~200 μL、100 L~1 000 μL) 。

　　10 . 2 试剂材料

　　10 . 2 . 1 10 道泳道的 12%SDSNuPage胶(商品化产品或自配) 。

　　10 . 2 . 2 预染蛋白质 Marker(商品化产品'应含有 7 ku~36 ku 的蛋白条带) 。

　　10 . 2 . 3 匀浆缓冲液'按照附录 C 中 C. 1 的方法配制。

　　10 . 2 . 4 蛋白酶 K溶液'按照 C. 2 的方法配制。

　　10 . 2 . 5 消化阻止液'按照 C. 3 的方法配制。

　　10 . 2 . 6 5×上样缓冲液'按照 C. 4 的方法配制。

　　10 . 2 . 7 电泳缓冲液(商品化产品'与 12%SDSNuPage 匹配) 。

　　10 . 2 . 8 甲醇 。

　　10 . 2 . 9 TBST'按照 C. 5 的方法配制。

　　10 . 2 . 10 转印缓冲液'按照 C. 6 的方法配制。

　　10 . 2 . 1 1 封闭液'按照 C. 7 的方法配制。

　　10 . 2 . 12 PVDF膜 。

　　10 . 2 . 13 3MM 滤纸 。

　　7

　　GB/T 22910—2023

　　10 . 2 . 14 一抗(商品化产品)工作液 ' 按照 C. 8 的方法配制 。

　　10 . 2 . 15 标记 HRP的兔抗鼠 IgG(商品化产品)工作液 ' 按照 C. 9 的方法配制 。

　　10 . 2 . 16 化学发光显色试剂盒(商品化产品) 。

　　10 . 2 . 17 阳性对照 ' 按照 C. 10 的方法配制 。

　　10 . 2 . 18 阴性对照 ' 按照 C. 11 的方法配制 。

　　10 . 3 试验步骤

　　10 . 3 . 1 蛋白酶 K 消化

　　取 50 μL离心好的样品 、阳性对照 、阴性对照分别移至 1 . 5 mL离心管中 ' 各加入 5 μL蛋白酶 K 溶液 ' 使蛋白酶 K终浓度达到 50 μg/mL' 混匀后放于 48 ℃金属浴中消化 40 min 。消化完后各加入 3 μL消化阻止液阻止蛋白水解反应 。

　　10 . 3 . 2 蛋白变性

　　在消化完的样品 、阳性对照 、阴性对照中分别加入 50 μL上样缓冲液 ' 混匀后置 96 ℃金属浴中变性

　　5 min 。

　　10 . 3 . 3 电泳

　　10 . 3 . 3 . 1 将 12%SDSNuPage胶安放好 ' 在电泳槽内槽加满电泳缓冲液的工作液(不要溢出) ' 外槽加至浸没过胶底端 1/3 处和电泳槽中的导热丝(总共需要约 400 mL电泳缓冲液) 。

　　10 . 3 . 3 . 2 平稳拔出梳子 ' 在各泳道分别加入 10 μL蛋白质 Marker12 μL 阳性对照 、12 μL阴性对照及

　　12 μL变性完的样品 。安装好电泳装置 ' 接通电源 ' 根据电泳装置说明设定好电压和时间进行电泳 。 同时 ' 配制转印缓冲液 ' 2 ℃ ~8 ℃下预冷 。

　　10 . 3 . 4 电转印(半干转印法)

　　10 . 3 . 4 . 1 电泳完后 ' 取出 12%SDSNuPage胶 。 用专用铲刀从四周撬开胶外壳 ' 切掉胶的加样齿孔及胶底部染液线以下部分 。在胶上倒一些转印缓冲液 ' 使胶保持湿润 。 根据胶的大小 ' 剪好 PVDF膜及4 张滤纸 ' PVDF膜比滤纸稍大 。将 PVDF膜放入 100%甲醇中浸湿 1 min ' 之后将滤纸和膜放入转印缓冲液中浸泡平衡 15 min 。

　　10 . 3 . 4 . 2 在干净台面上先放置两层对齐的滤纸 ' 用玻璃棒沿一个方向轻赶气泡 ' 用铲刀将胶取出放于滤纸上 ' 并与滤纸对齐 。滴一些转印液在胶上 ' 使胶全部浸湿 ' 然后将浸好的膜从一端慢慢往另一端放下 ' 直至完全覆盖在胶上 。取出另两层滤纸整齐放于膜上 ' 用玻璃棒驱赶气泡 ' 将其转入转印槽中 ' 注意膜的一端朝向正极 。再次往滤纸上倒入少量转印缓冲液 ' 用玻璃棒轻赶气泡 。

　　10 . 3 . 4 . 3 盖上盖 ' 接通电源 ' 设定电压 15 V、时间 15 min进行转印 。

　　10 . 3 . 5 封闭

　　转印结束后 ' 弃去胶和滤纸 。观察 Marker转印效率 ' 如果膜上有清晰的 Marker 条带 ' 说明转印效率良好 ' 否则转印失败 。将膜放入装有封闭液的平皿中 ' 确保膜完全浸没 ' 4 ℃作用 12 h 以上或者37 ℃作用 1 h 。封闭结束 ' 置摇床上用 TBST摇洗 3 次 ' 每次 5 min 。

　　10 . 3 . 6 一抗作用

　　将膜放入一抗工作液中 ' 确保膜完全浸没 ' 摇床摇振孵育室温下 1 . 5 h 或者 37 ℃下 30 min 。作用完后 ' 置摇床上用 TBST摇洗 6 次 ' 每次 5 min 。

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　　GB/T 22910—2023

　　10 . 3 . 7 二抗作用

　　将膜放入标记 HRP的兔抗鼠 IgG工作液中'确保膜完全浸没'室温下置摇床摇振孵育 1 h 。孵育时'打开化学发光成像仪预热 15 min。 孵育完后'置摇床上用 TBST摇洗 6 次'每次 5 min。

　　10 . 3 . 8 底物作用

　　按照化学发光显色试剂盒说明书配制好化学发光底物溶液(一张膜需要 5 mL) '混匀。 将膜置于干净平皿中'底物溶液滴加至膜的表面上'作用 10 min。

　　10 . 3 . 9 化学发光

　　底物作用完后'将膜取出'滴掉多余液体'放入化学发光成像仪中曝光。 一般情况曝光 2 min ~ 3 min 即可。 若条带太浅'则需要增加曝光时间;反之'则减少曝光时间'直至效果最佳。

　　10 . 4 结果判定

　　10 . 4 . 1 在阳性对照和阴性对照均成立的条件下'才可判定检测样品的结果。

　　10 . 4 . 2 阳性结果:曝光照片上的样品泳道出现 3 条大小在 17 ku~27 ku之间特异性黑色条带'则判定为典型痒病阳性;样品泳道出现多条大小在 11 ku~31 ku 之间特异性黑色条带'则判定为非典型痒病阳性。

　　10 . 4 . 3 阴性结果:曝光照片上的样品泳道没有特异性黑色条带'或者有个别杂条带'但对比胶上的蛋白质 Marker分析条带大小不在 11 ku~31 ku之间'则判定为痒病阴性。

　　10 . 4 . 4 可疑结果:样品泳道出现个别条带'且对比胶上的蛋白质 Marker 分析条带大小在 11 ku ~ 31 ku之间'则判定为痒病可疑结果'应结合免疫组织化学方法的结果最终判定。 当免疫组织化学方法检测结果为阳性时'则最终判定为痒病阳性;当免疫组织化学方法检测结果为阴性时'则最终判定为痒病阴性。

　　1 1 综合判定

　　1 1 . 1 经 H ● E组织病理染色法'可对临床判定为疑似病例的做出初步诊断。

　　1 1 . 2 临床无明显特征性症状或临床判定为疑似病例的'经免疫组织化学方法或者免疫印迹方法检测出痒病病原'则可判定为痒病确诊病例。

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　　GB/T 22910—2023

　　附 录 A

　　(规范性)

　　H . E 组织病理染色法试剂配制(试剂均为分析纯)

　　A. 1 10%中性福尔马林固定液

　　称取 4. 0 g磷酸二氢钠(无水) 、6 . 5 g磷酸氢二钠(无水) '投入 100 mL 甲醛和 900 mL蒸馏水的混合液中'充分混匀溶解 。

　　A. 2 苏木素染色液

　　称取 1 . 0 g苏木精'溶于 10 mL无水乙醇'然后将 20. 0 g 钾明矾和蒸馏水煮沸溶化'去火并迅速加入苏木精无水乙醇溶液中'再立即加入 0. 5 g 氧化汞并煮沸'迅速冷却后加入 8 mL冰乙酸'过滤后使用 。

　　A. 3 1%盐酸乙醇

　　在 100 mL70%或 80%乙醇中加入 1 mL的浓盐酸即可 。

　　A. 4 饱和碳酸锂水溶液

　　碳酸锂 2 g加入 100 mL蒸馏水'充分溶解 。

　　A. 5 95%乙醇伊红溶液

　　伊红 0. 5 g加入 100 mL 95%乙醇中溶解 。

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　　GB/T 22910—2023

　　附 录 B

　　(规范性)

　　免疫组织化学方法试剂配制(试剂均为分析纯)

　　B. 1 蛋白酶 K 缓冲液

　　称取 1 . 11 g氯化钙溶解于 100 mL蒸馏水 ' 待用 。量取 0. 75 mL氯化钙溶液和 2 . 5 mL商品化的盐酸三羟甲基氨基甲烷(1 mol/L'PH8 . 0)溶液 ' 加入 50 mL蒸馏水中混匀 。

　　B. 2 蛋白酶 K 工作液

　　使用前在蛋白酶 K缓冲液中加入 17 μL蛋白酶 K母液(蒸馏水配制 ' 质量浓度为 14. 7 mg/mL) ' 使其工作浓度达 5 μg/mL。

　　B. 3 高压缓冲液

　　称取 2 . 58 g柠檬酸钠溶于 100 mL蒸馏水 ' 待用;19 . 213 g柠檬酸溶于 1 000 mL蒸馏水 ' 待用 。将1 350 mL蒸馏水煮沸 ' 然后加入 27 mL柠檬酸钠溶液和 123 mL柠檬酸溶液 ' 混匀即可 。

　　B. 4 3%过氧化氢-甲醇(使用前 5 min 配制)

　　量取 1 . 5 mL过氧化氢(30%)和 50 mL甲醇 ' 充分混匀 。

　　B. 5 0 . 1 mol/L PBS(PH 7 . 4)

　　称取 8 g氯化钠 、0. 2 g 氯化钾 、1 . 44 g 磷酸氢二钠 、0. 24 g 磷酸二氢钾 ' 加入 800 mL蒸馏水中溶解 ' 用浓盐酸调 PH 至 7 . 4 ' 加蒸馏水至 1 L。

　　B. 6 5%正常猪血清

　　移取 200 μL正常猪血清加入 4 mL0. 1 mol/L PBS(PH 7 . 4)中充分混匀 。

　　B. 7 一抗工作液

　　一抗为商品化的鼠抗羊肮蛋白单克隆抗体(或者同等效力的一抗) ' 用 0. 1 mol/L PBS(PH 7 . 4)稀释单克隆抗体 ' 使其工作浓度达到 5 μg/mL。

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　　GB/T 22910—2023

　　附 录 C

　　(规范性)

　　免疫印迹方法试剂配制(试剂均为分析纯)

　　C. 1 匀浆缓冲液

　　称取 14. 376 mg 蔗糖 、0. 5 g脱氧胆酸钠 、0. 5 g NP40(乙基苯基聚乙二醇) ' 加入 100 mL蒸馏水中充分溶解混匀 ' 可在 4 ℃下保存数周 。

　　C. 2 蛋白酶 K 溶液

　　称取 11 . 1 mg 氯化钙 、6 mg 蛋白酶 K' 加入 10 mL商品化的盐酸三羟甲基氨基甲烷(1 mol/L' PH 8. 0)溶液中充分溶解 。

　　C. 3 消化阻止液

　　称取 174 mg苯甲基磺酰氟 ' 溶于 10 mL异丙醇 ' 得到浓度为 100 mmol/L溶液 。使用时工作浓度约为 5 mmol/L。配好后应分装保存在 —20 ℃下 。或者用市场上其他的蛋白酶 K 阻止液 ' 按照说明书配制使用即可 。

　　C. 4 5×上样缓冲液

　　量取 10 mL甘油与 10 mL蒸馏水混匀得到 50%甘油 。称取 10 g SDS粉末溶解于 100 mL蒸馏水 ' 混匀得到 10% SDS溶液 。 量取 0. 6 mL 商品化的盐酸三羟甲基 氨 基 甲 烷 (1 mol/L' PH 6 . 8) 、 5 mL 50%甘油 、2 mL 10%SDS、0. 5 mL2-巯基乙醇 、1 mL1%溴酚蓝 、0. 9 mL蒸馏水 ' 混匀得到 5×上样缓冲液 。

　　使用时取 1 份 5×上样缓冲液 ' 加蒸馏水 4 份 ' 充分混匀 。可在 4 ℃下保存数周 。

　　C. 5 TBST

　　称取 8 g氯化钠 、0. 2 g氯化钾 、3 g 三羟甲基氨基甲烷 ' 加入 800 mL蒸馏水中溶解 ' 加入浓盐酸调PH 至 7 . 4(大约需要 1 . 9 mL浓盐酸) ' 然后加蒸馏水定容至 1 000 mL' 最后加 500 μLTween-20 ' 混匀 。

　　C. 6 转印缓冲液

　　称取 3 . 028 g 三羟甲基氨基甲烷 、14. 413 g甘氨酸 ' 加入 900 mL蒸馏水中溶解 ' 再加 100 mL100%甲醇 ' 混匀 。用前于 2 ℃ ~8 ℃下预冷 。

　　C. 7 封闭液

　　称取 2 g 牛血清白蛋白 ' 加入 100 mL TBST 中充分溶解 ' 待用 。

　　C. 8 一抗工作液

　　一抗为商品化的鼠抗羊肮蛋白单克隆抗体(或者同等效力的一抗) ' 用含 1%牛血清白蛋白的TBST溶液稀释单克隆抗体 ' 使其工作浓度达到 5 μg/mL。

　　C. 9 标记 HRP的兔抗鼠 IgG工作液

　　用含 1%牛血清白蛋白的 TBST溶液稀释抗体 ' 使其工作浓度达到 5 μg/mL。