GB/T 21828-2025 化学品 大型溞繁殖试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21828—2025代替 GB/T21828—2008

　　化学品 大型溞繁殖试验

　　Chemicals—Daphniamagna reproduction test

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21828—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 试验原理 2

　　5 受试物信息 3

　　6 参比物 3

　　7 试验准备 3

　　8 试验程序 4

　　9 质量保证与质量控制 8

　　10 数据与报告 8

　　附录 A (规范性) ElendtM4和 M7培养基的制备 11

　　附录 B (资料性) 总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中 TOC含量的线性图绘制 13

　　附录 C (资料性) 培养基更换 ,物理-化学监测数据 ,喂食 、大型溞繁殖和亲溞死亡率数据记录表

　　示例 15

　　附录 D (资料性) 化学分析结果记录数据表示例 16

　　附录 E (资料性) 时间-加权平均值的计算 17

　　附录 F (资料性) 幼溞性别鉴别指南 19

　　参考文献 20

　　Ⅰ

　　GB/T 21828—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21828—2008《化学品 大型溞繁殖试验》, 与 GB/T 21828—2008相比 , 除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 更改了 “受试物信息 ”的内容(见第 5 章 ,2008年版的第 3 章) ;

　　— 更改了喂食的 内 容 (见 8. 1. 4, 2008 年 版 的 8. 1. 4) ; 增 加 了 预 试 验 和 限 度 试 验 (见 8. 1. 8 和8. 1. 10) ;更改了设置浓度范围的注意事项[见 8. 1. 9. 3,2008年版的 8. 1. 8c] ;

　　— 更改了其他参数的内容(见 8. 5,2008年版的 8. 5) ;

　　— 更改了数据与报告的内容(见第 10章 ,2008年版的第 10章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 、广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 、生态环境部南京环境科学研究所 、上海市检测中心 、沈化测试技术(南通)有限公司 、贵州健安德科技有限公司 、粤港澳生态环境科学中心 、上海化工院检测有限公司 。

　　本文件主要起草人 :刘纯新、窦从从、梅承芳、刘洪英、张瑛、刘晓建、郭敏、孙田、杨迪、田智勇、许玉洁、赵亚洲 、舒耀皋 、石利利 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21828—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 21828—2025

　　化学品 大型溞繁殖试验

　　1 范围

　　本文件确立了大型溞繁殖试验的试验原理 ,规定了受试物信息 、试验准备 、试验程序 、质量保证与质量控制 、数据与报告的要求 。

　　本文件适用于测试与评价可能暴露于水生生态环境的化学品对大型溞繁殖的影响 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T

　　21801

　　化学品 快速生物降解性 呼吸计量法试验

　　GB/T

　　21802

　　化学品 快速生物降解性 改进的 MITI试验(I)

　　GB/T

　　21803

　　化学品 快速生物降解性 DOC消减试验

　　GB/T

　　21830

　　化学品 溞类急性活动抑制试验

　　GB/T

　　21831

　　化学品 快速生物降解性 密闭瓶法试验

　　GB/T

　　21845

　　化学品 水溶解度试验

　　GB/T

　　21852

　　化学品 分配系数(正辛醇-水) 高效液相色谱法试验

　　GB/T

　　21853

　　化学品 分配系数(正辛醇-水) 摇瓶法试验

　　GB/T

　　21855

　　化学品 与 pH 有关的水解作用试验

　　GB/T

　　21856

　　化学品 快速生物降解性 二氧化碳产生试验

　　GB/T

　　21857

　　化学品 快速生物降解性 改进的 OECD筛选试验

　　GB/T

　　22052

　　用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系和初始分解温度的方法

　　GB/T

　　22228

　　工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 1 Pa至 105 Pa范围内的测定 静态法

　　GB/T

　　22229

　　工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 3 Pa至 1 Pa范围内的测定 蒸气压平

　　衡法

　　GB/T

　　27850

　　化学品 快速生物降解性 通则

　　GB/T

　　42426

　　化学品 蒸气压试验

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。 3. 1

　　亲溞 parentanimals

　　试验开始时用于繁殖的雌溞 。 3.2

　　幼溞 offspring

　　试验期间亲溞所产的溞 。

　　1

　　GB/T 21828—2025

　　3.3

　　繁殖量 reproductiveoutput

　　试验期间亲溞所产成活幼溞数 。

　　3.4

　　死亡 mortality

　　溞体不动 , 即不能游动 ,或轻晃试验容器 ,15 s 内溞的附肢或后腹部也未见活动的状况 。 3.5

　　意外死亡 accidentalmortality

　　由已知原因的意外导致 、与受试物无关的死亡 。

　　3.6

　　偶然死亡 inadvertentmortality

　　由未知原因导致 、与受试物无关的死亡 。

　　3.7

　　最低可观察效应浓度 lowestobserved effectconcentration;LOEC

　　试验期间 ,与对照组相比 ,观察到的对受试生物产生显著(p小于 0. 05)效应的最低受试物浓度 。 3. 8

　　无可观察效应浓度 no observed effectconcentration;NOEC

　　试验期间 ,与对照组相比 ,对受试生物未产生显著效应(p小于 0. 05)的最高受试物设置浓度 。

　　注 : 试验中只略低于 LOEC 的受试物浓度 。

　　3.9

　　效应浓度 effectconcentration;ECx

　　在指定的暴露期内 ,引起受试生物繁殖量降低 x%时的受试物浓度 。

　　3. 10

　　内禀增长率 intrinsicrateofincrease

　　综合繁殖量与特定种龄死亡率来衡量种群增长能力的参数 。

　　注 : 稳定状态的种群 , 内禀增长率为零 ;增长的种群 , 内禀增长率为正 ;衰退的种群 , 内禀增长率为负 。

　　3. 11

　　检出限 limitofdetection

　　可检出但不能定量的最低浓度 。

　　3. 12

　　定量限 limitofquantitation

　　可定量测定的最低浓度 。

　　4 试验原理

　　将溞龄小于 24h 的 幼 雌 溞(亲 溞) 暴 露 于 一 定 浓 度 范 围 的 受 试 物 溶 液 中 开 始 试 验 。试 验 周 期 为21 d。试验结束时 ,应对繁殖的成活幼溞的总数量和每只存活亲溞繁殖的成活幼溞的总数量进行评价(即不包括试验期间死亡的幼溞) 。亲溞的繁殖量也可用其他方式表示 ,如从产生头胎幼溞开始平均每只亲溞每天产生的成活幼溞数量 ,不过这些结果应另外计算 。如果试验期间亲溞意外死亡和/或偶然死亡 ,或者转化为雄溞 ,应在数据评估中排除这些平行 。通过对暴露于受试物中的亲溞繁殖量与对照组的比较 ,确定最低可观 察 效 应 浓 度(LOEC) 和 无 可 观 察 效 应 浓 度(NOEC) 。 如 可 能 , 利 用 回 归 模 型 估 算ECx (如 EC50、EC20或 EC10) 。

　　还应记录存活的 亲 溞 数 量 和 产 头 胎 溞 的 时 间 。 生 长 情 况(体 长) 和 内 禀 增 长 率 等 其 他 参 数 也 应

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　　研究 。

　　5 受试物信息

　　5. 1 在试验前 ,应已知受试物的下列信息 :

　　a) 按照 GB/T 21845的方法测定的水中溶解度 ;

　　b) 按照 GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229、GB/T 42426的方法测定的蒸气压和亨利常数 ;

　　c) 在水溶液中的定量分析方法 、回收率以及检出限 、定量限 ;

　　d) 按照 GB/T 21830的方法测定的溞类急性活动抑制试验数据 。

　　5.2 可能需要受试物的下列信息 :

　　a) 标识信息(通用名 、化学名) ,结构式 ;

　　b) 纯度 ;

　　c) 按照 GB/T 21855的方法测定的水解作用 ;

　　d) 光稳定性 ,具体方法见参考文献[3] ;

　　e) 按照 GB/T 21852或 GB/T 21853的方法测定的正辛醇-水分配系数(Pow ) ;

　　f) 按 照 GB/T 21801、GB/T 21802、GB/T 21803、GB/T 21831、GB/T 21856、GB/T 21857、 GB/T 27850的方法测定的快速生物降解性试验结果 ;也可用其他方法测定的结果 ,见参考文献[4] 。

　　6 参比物

　　无推荐参比物 。

　　7 试验准备

　　7. 1 仪器和设备

　　7. 1. 1 接触到试验溶液的试验容器和其他设备宜是全玻璃制品或由其他化学惰性材料制成 。试验容器通常为烧杯 。

　　7. 1.2 需用下列部分或全部仪器设备 :

　　a) 溶解氧测定仪(带有微电极或其他能测定少量样品的溶解氧浓度的适当装置) ;

　　b) 适当的温度控制设备 ;

　　c) pH 计 ;

　　d) 测定水硬度的设备 ;

　　e) 总有机碳(TOC)测定仪或化学需氧量(COD)测定仪 ;

　　f) 控制光照的设备以及测定光照强度的设备等 。

　　7.2 受试生物准备

　　7.2. 1 受试生物的选择

　　受试生物为大型溞(Daphnia magna Straus) 。无性繁殖系宜用基因型鉴定 。 在本文件给定条件下培育 , 品系 A(来源于法国的 IRCHA)始终满足质量控制要求 , 即存活亲溞 21 d所产成活幼溞的平均值不少于 60只 。若能满足质量控制要求 ,也可使用其他的溞类品系 。

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　　7.2.2 受试生物的驯养

　　试验开始时 ,试验用溞应是溞龄小于 24h 的非头胎溞 。试验用溞应来源于同一个健康的保种培养容器 , 即未表现任何受胁迫现象(如死亡率高 , 出现雄溞和冬卵 ,初产延迟 ,体色异常等) 。 日常培养的条件(光照 、温度 、培养基 、喂食单位体积的动物数量)应和试验条件一致 ,如果试验时所用培养基与 日常使用的培养基不同 ,试验前宜将试验用溞在试验条件下驯养 3周(即一代) , 以避免新培养基对亲溞产生胁迫作用 。

　　7.3 试验培养基

　　7.3. 1 宜使用附录 A规定的培养基 ,如 ElendtM4和 M7培养基 。若能满足大型溞培养的要求 ,也可考虑其他培养基 。

　　7.3.2 如果使用的培养基中含有未规定的添加成分 ,应在报告中详细说明 ,特别是含碳组分 。 宜测定培养基的总有机碳(TOC)和(或)化学需氧量(COD) 。培养基(在添加藻类食物之前)中的 TOC应小于2 mg/L。

　　7.3.3 当受试物含有金属元素时 ,应特别注意培养基的性质(如硬度 、螯合能力) 有可能发生改变并改变受试物的毒性效应 。不宜使用 ElendtM4和 M7培养基 , 同样尽量避免用含有已知螯合剂的其他培养基测含有金属元素的物质 。可选择替代培养基 ,如配制不含有乙二胺四乙酸(EDTA)的硬质淡水 ,并加入海藻提取物 ,方法见参考文献[1] 。尽管海藻中的有机物与金属也有微弱的螯合作用 ,这种方法配制的硬质淡水和海藻提取物的混合物也适合大型溞的长期培养和试验 。

　　7.3.4 试验开始和试验期间溶解氧浓度应大于 3 mg/L。 pH 值在 6~ 9 范围内 ,在同一个试验中变化不应超过 1. 5个单位 。硬度大于 140 mg/L(以 CaCO3 计) 。

　　7.4 试验溶液

　　7.4. 1 所选浓度的试验溶液一般通过稀释贮备液准备 。贮备液宜是将受试物加入到试验用水中 ,用机械的方法(如振荡 、搅拌或者超声波处理 ,或者其他适当的方法)混合配制而成 。

　　7.4.2 应尽量避免使用溶剂 、乳化剂或分散剂 ,如不得已要使用这些物质来配制适当浓度的贮备液 , 除了试验浓度组之外 ,应设置足够数量平行的稀释水对照组和溶剂对照组 。 常用的溶剂有丙酮 、乙醇 、甲醇 、二甲基甲酰胺和三甘醇 。常用的分散剂有聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯 、0. 01%的甲基纤维素甲醚和聚氧乙烯化氢化蓖麻油 。有 机 溶 剂 或 分 散 剂 在 溶 液 中 的 最 大 允 许 浓 度 不 应 超 过 0. 1 mL/L。 在 此 浓 度下 ,上述溶剂和分散剂无毒且不会提高物质的水中溶解度 。任何情况下 ,受试物的浓度不应超过其在试验用水中的溶解度 。

　　8 试验程序

　　8. 1 暴露条件

　　8. 1. 1 试验周期

　　试验周期为 21 d。

　　8. 1.2 负荷

　　亲溞分开培养 ,每个容器一只 ,容器中培养基体积 50 mL~ 100 mL。

　　尽管允许合并各平行的溶液进行化学分析 ,有时为了分析测定受试物浓度 ,需要增加溶液的体积 。如果溶液体积超过 100mL,需要加大对大型溞的喂食量 ,并满足喂食标准 。对于流水式试验 , 由于技术

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　　GB/T 21828—2025

　　原因 ,试验可分成 4 个平行 , 每组 10 只溞 , 放在一个较大的容器中 , 如果试验设计有变 化 应 在 报 告 中注明 。

　　8. 1.3 受试生物分组

　　8. 1.3. 1 对于半静态试验 ,每个试验浓度至少 10只溞 ,并单独分开培养 ,对照组同样处理 。

　　8. 1.3.2 对于流水式试验 ,宜将 40只溞分成 4 组 ,每组 10只 。也可减少溞的数量 , 至少 20只 ,平均分成 2个或 4个平行 。

　　注 : 如果亲溞有偶然死亡/意外死亡 ,就无法计算试 验 结 束 时 每 只 存 活 亲 溞 的 繁 殖 量 。 因 此 , 繁 殖 量 用 试 验 开 始 时每只亲溞所产成活幼溞总数表示 。

　　8. 1.3.3 亲溞应随机分配到各试验容器中 ,而且此后的操作也都应按照随机的方式进行 。否则会导致对浓度影响的错误判断 。尤其是按处理组或浓度顺序放置时 ,一些与时间有关的影响因素 ,如操作者疲劳或其他过失 ,都会 对 高 浓 度 组 导 致 更 大 的 影 响 。 此 外 , 如 果 试 验 结 果 可 能 受 初 始 因 素 或 环 境 的 影响 ,如在实验室中的位置 ,应考虑结束试验 。

　　8. 1.4 喂食

　　8. 1.4. 1 对于半静态试验 ,宜每天喂食 ,至少每周 3 次(即换液时喂食) 。考虑添加藻悬浮液稀释受试物溶液暴露浓度的可能性 ,并使用浓缩的藻悬浮液尽量避免此类情况发生 。 由其他试验方式(如采用流水式试验)导致的差异应在报告中说明 。

　　8. 1. 4. 2 试 验 期 间 亲 溞 的 食 物 可 选 : 小 球 藻 (Chlorella sp.) 、近 头 状 尖 胞 藻 (Raphidocelis subcapitata,曾用 名 : 羊 角 月芽 藻/Pseudokirchneriella subcapitata) 和 近 具 棘 链 带 藻 (Desmodesmus subspicatus,曾用名 :栅藻/Scenedesmussubspicatus) 。 喂食量应以提供给每只亲溞的有机碳数量为基础 。每只大型溞每天的喂食量(以碳计)在 0. 1 mg~0. 2 mg之间 ,可满足繁殖试验的要求 。试验期间的喂食量可保持稳定不变 ,也可在初期稍低 , 随着亲溞的生长逐渐增加喂食量 ,但每只大型溞每天的喂食量(以碳计)始终应在推荐的 0. 1 mg~0. 2 mg范围内 。

　　8. 1.4.3 如果用替代测定的方法 ,如藻细胞数量法或光吸收法 ,来计算喂食率(由于碳含量测定受时间限制 ,为方便起见 ,可用这些方法替代) , 每个实验室都应单独建立碳含量和藻细胞浓度之间的直线图(见附录 B) 。直线图应至少每年校准一次 ,如果藻类的培养条件发生变化 ,还应增加校准频率 。此外发现光吸收法比藻细胞数量法更适合作为替代测定的方法 。

　　8. 1.4.4 应给大型溞喂食经浓缩的藻液 , 以减少进入试验容器中的藻培养基 。浓缩藻液可通过离心获得 ,然后用蒸馏水 、去离子水或溞培养基使其重新悬浮 。

　　8. 1.5 光照

　　每天 16h光照 ,试验容器水面的光照强度不超过 15 μE · m- 2 · s- 1 ~ 20 μE · m- 2 · s-1 (相当于1 000 lx~ 1 500 lx冷白光) 。对于以勒克斯(lx)为单位的光照测量仪器 ,相当于 1 000 lx~ 1 500 lx 的冷白光源 。

　　8. 1.6 试验温度

　　试验溶液的 温 度 应 控 制 在 18 ℃ ~ 22 ℃ 。 同 一 试 验 中 , 每 天 的 温 度 变 化 不 超 过 2℃ (如 18 ℃ ~ 20 ℃ ,19 ℃ ~ 21 ℃或 20 ℃ ~ 22 ℃) 。可另增加一个试验容器监测温度变化 。

　　8. 1.7 曝气

　　试验期间不曝气 。

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　　8. 1. 8 确定浓度范围的预试验

　　宜先进行一个寻找浓度范围的预试验 ,例如设置 5个试验浓度组和 1个对照组 ;每个试验浓度组设置 2个平行 ,对照组不设平行 。与受试物性质类似的化合物的溞类和/或其他水生生物的急性毒性试验结果或参考文献 ,对于确定预试验浓度范围可能有参考作用 。

　　预试验进行 21 d,或到足以可靠地预估出效应水平为止 。试验结束时 ,评估溞类的繁殖情况 ,记录亲溞和幼溞的数量 。

　　8. 1.9 正式试验

　　8. 1.9. 1 应预先知道受试物的毒性(通过急性毒性试验或 8. 1. 8 中的预试验得知) , 以助于选择适当的试验浓度 。

　　8. 1.9.2 正式试验一般至少包括 5个浓度 ,按几何级数排列 ,浓度的间隔系数不大于 3. 2,每个浓度应有适当的平行数量和溞数(见 8. 1. 3) 。如果试验浓度少于 5个 ,应在试验报告中给予合理解释 。受试物浓度不应超过其在试验溶液中的溶解度 。

　　8. 1.9.3 设置浓度范围时 ,应注意以下方面 。

　　a) 若旨在评估繁殖效应的 ECx ,应有足够多的试验浓度来计算 ECx 和置信区间 。使用的测试浓度宜涵盖预估的 ECx , 即 ECx 是 通 过 内 插 而 不 是 外 推 得 到 的 。 设 置 较 多 的 试 验 浓 度(例 如10个) 、每 个 浓 度 的 平 行 较 少(例 如 5 个 , 从 而 保 持 容 器 总 数 不 变) , 且 对 照 组 设 置 10个 平行 ,有利于后续统计分析 。

　　b) 若旨在获得 LOEC和(或) NOEC, 最低试验浓度组的繁殖量不应显著低于对照组 。 否则 ,应降低试验浓度重新试验 。最高试验浓度组的繁殖量应显著低于对照组 。否则 ,应提高试验浓度重新试验 ,除非在初 始 试 验 中 使 用 的 最 高 试 验 浓 度 是 慢 性 效 应 试 验 所 需 的 最 高 试 验 浓 度(如 10 mg/L) 。

　　8. 1. 10 限度试验

　　8. 1. 10. 1 若在 8. 1. 8 中预试验受试物的最高浓度(例如 10 mg/L)下没有观察到效应 ,或者根据受试物对其他生物的低毒性和/或低吸收资料推测受试物有可能是低毒或无毒时 ,该繁殖试验可按限度试验进行 ,使用一个试验浓度组(例如 10 mg/L)和对照组 。试验组和对照组各设 10个平行 。

　　8. 1. 10.2 如在流水式系统中进行限度试验 ,可适当减少平行 。

　　8. 1. 10.3 限度试验将提供机会 , 以证明在该限定浓度下没有统计学意义上显著效应 ;但如果发现有显著效应 ,则应进行完整的正式试验 。

　　8. 1. 11 对照组

　　8. 1. 11. 1 应设置试验培养基对照组(空白对照组) 。若使用溶剂或分散剂 ,还应增设溶剂对照组或分散剂对照组 ,溶剂或分散剂的浓度应与含有受试物的容器中的一致 。各对照组应设适当数量的平行(见8. 1. 3) 。

　　8. 1. 11.2 对照组每只亲溞间的繁殖量的变异系数应不大于 25% ;对于亲溞使用单独培养方式设计的试验 ,应在报告中注明 。

　　8. 1. 12 试验培养基更换

　　8. 1. 12. 1 根据受试物的稳定性确定试验培养基的更换频率 ,但至少每周 3 次 。若在为期最长 3 d 的稳定性预试验中表明受试 物 不 稳 定(如 在 配 制 浓 度 值 的 80% ~ 120%范 围 外 或 低 于 初 始 浓 度 测 定 值 的80%) ,应考虑增加更换频率 ,或使用流水式系统 。

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　　GB/T 21828—2025

　　8. 1. 12.2 半静态试验的溶液更换时 ,应准备另一套试验容器用于放置亲溞 ,可用内径合适的玻璃吸管转移亲溞 。转移亲溞时应尽量少吸原容器培养基的体积 。

　　8.2 观察

　　试验期间的观察结果应记录在数据表格(见附录 C 和附录 D)上 。如要求测定其他参数 ,其他观察指标也应记录(见 第 4 章 和 8. 5) 。 如 观 察 到 受 试 物 浓 度 变 化 超 过 ±20% , 应 记 录 计 算(见 附 录 E) 的结果 。

　　8.3 幼溞

　　从头胎溞开始 ,每 天 从 试 验 器 皿 中 移 出 幼 溞 并 计 数 , 以 避 免 消 耗 食 物 影 响 亲 溞 。 计 数 成 活 的 幼溞 ,对死胎和死亡的幼溞也要进行记录 。

　　8.4 死亡率

　　试验期间应每天记录亲溞的死亡情况 ,或者至少与幼溞记数次数相同 。

　　8.5 其他参数

　　尽管本方法设计的主要目的是评价受试物对溞繁殖能力的影响 ,其他的影响因素也可能被充分定量以满足统计分析的要求 。可记录每只存活亲溞的繁殖量 , 即试验期间每只存活亲溞所产成活幼溞数 。这可与主要反应变量(在试验开始每只亲溞繁殖的幼溞 ,这里的亲溞是指试验期间没有意外死亡或偶然死亡的亲溞)进行比较 。如果暴露的平行中发生亲溞死亡 ,则应考虑死亡率是否符合一个浓度-反应模型 ,例如 ,是否存在一个对受试物浓度的反应有正斜率的显著回归(可用一个类似 Cochran-Armitage趋势检验的统计检验) 。如果死亡率不符合一个浓度-反应模型 ,则应将具有亲溞死亡的平行排除在试验结果分析之外 。如果死亡率符合一个浓度-反应模型 ,则亲溞死亡应归因于受试物的影响 ,并且不应从试验结果的分析中排除这些平行 。既然有足够的信息表明可能的亚致死效应比单一的繁殖力更能说明问题 , 因此生长情况测量是非常值得一提的参数 ;另外宜在试验结束时测定亲溞的体长(不包括尾刺) 。

　　其他用来测量或计算的参数包括 :亲溞头胎(及随后的几胎)产溞时间 、每只亲溞产溞总胎数和每胎产溞数 、死胎数量 、雄溞数或冬卵和种群内禀增长率 。

　　幼溞性别鉴定见附录 F。

　　8.6 分析测定频率

　　8.6. 1 至少每周测定一次对照组和最高试验浓度组的新 、旧溶液的溶解氧浓度 、温度 、硬度和 pH值 。

　　8.6.2 试验期间 ,应定期测定受试物浓度 。

　　8.6.3 半静态试验的受试物浓度应保持在配制浓度的 ±20%的范围内(见第 5 章和 8. 1. 12) 。宜在试验开始后第一周内的新制备时和更换试液时至少测定一次最高和最低浓度组的新配制的溶液(新 、旧溶液应为同一试液中的样品) 。此后 ,至少每周分析一次 。

　　8.6.4 当受试物浓度不在配制浓度的 ±20%范围内 ,应分析所有新 、旧试验溶液 。 当初始浓度是可重复且稳定的 , 即在配制浓度的 80% ~ 120%范围内 ,第 2周 ~第 3周内可仅测最高与最低浓度组 。在所有情况下 ,更新溶液前只需测定每个浓度组的一个平行中受试物的浓度 。

　　8.6.5 若采用流水式试验 , 除无需 测 定 待 更 新 试 验 溶 液 之 外 , 半 静 态 试 验 中 所 述 采 样 方 法 同 样 适 用 。在试验第一周 ,宜增加随机采样次数(例如 3 次)以确保试验浓度保持稳定 。应每天检查稀释率及受试物浓度(即稀释水和受试物贮备液流速) 。

　　8.6.6 在整个试验期间 ,若证明受试物浓度保持在配制浓度或初始测定浓度的 ±20%范围内 ,那么结果应以配制浓度或初始测定浓度为基础 。若偏差大于配制浓度或初始测定浓度的 ±20% ,结果应以时

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　　GB/T 21828—2025

　　间-加权平均值(见附录 E)表示 。

　　9 质量保证与质量控制

　　9. 1 试验开始时所用亲溞的溞龄小于 24h,且不是头胎溞 。

　　9.2 试验结束时 ,对照组亲溞(雌溞)的死亡率不超过 20% ,每个试验浓度组中亲溞的意外和偶然死亡率不超过 20% 。

　　9.3 试验结束时 ,对照组平均每只存活亲溞所产成活幼溞不少于 60只 。

　　10 数据与报告

　　10. 1 结果处理

　　10. 1. 1 一般要求

　　10. 1. 1. 1 按每个试验容器(即平行)计算每只亲溞所产成活幼溞总数 。任一平行中 ,若亲溞在试验期间意外死亡或偶然死亡 ,或转化成雄溞 ,则应在结果处理时排除此平行 。然后 ,按扣除后的平行数进行统计分析 。如果在 暴 露 的 平 行 中 发 生 亲 溞 死 亡 , 则 应 考 虑 这 些 死 亡 是 否 遵 循 一 个 浓 度-反 应 模 型 。 例如 ,如果对受试物浓度的反应有一个正斜率的显著的回归(可用一个类似于 Cochran-Armitage趋势检验的统计检验) 。如果死亡率不符合浓度-反应模型 ,则应将具有亲溞死亡的平行从试验结果的分析中排除 。如果这些死亡率符合浓度-反应模型 ,则这些亲溞死亡应归因于受试物的影响 ,并且不应从试验结果的分析中排除这些平行 。

　　10. 1. 1.2 总之 , 当用 LOEC、NOEC或者 ECx 来表示效应时 ,宜用以上提到的 2 个反应变量计算繁殖效应 , 即 :试验期间非偶然/意外死亡的每只亲溞所产成活幼溞总数和每只存活亲溞所产成活幼溞数 。然后用这 2个反应变量中的任何一个计算最后的结果 , 即最小的 LOEC、NOEC或者 ECx 。

　　10. 1. 1. 3 在 使 用 统 计 分 析 之 前 , 如 方 差 分 析 (ANOVA) , 通 过 Student t 检 验 、Dunnett’s 检 验 、 Williams检验或者递减 Jonckheere-Terpstra检验比较试验浓度组和对照组 ,为满足特定的统计检验方法的需要 ,宜先考虑数据的转换 。如果要用非参数的检验方法可考虑用 Dunn’s或 Mann-Whitney’s检验 。95%的置信区间以单个处理的方法进行计算 。

　　10. 1. 1.4 未处理的对照组中存活的亲溞数量是试验的一个有效性指标 ,并且应予以记录和报告 。 另外 ,所有有害效应 ,如异常行为和毒理学上的显著效应 , 同样应在最后的报告中说明 。

　　10. 1.2 ECx 的结果处理

　　用适当的统计学方法(如逻辑回归 、威布尔分布函数 、trimmed Spearman-Karber方法或简单的插值法)计算 ECx 值及相关的置信区间 。为了计算 EC10、EC50或任何其他 ECx ,应对完整的数据集进行回归分析 。

　　10. 1.3 NOEC/LOEC的结果处理

　　的单侧假设检验将试验浓度组的有害效应与对照组相比 。

　　若用统计分析确定 NOEC/LOEC,需选用合适的统计学方法(见参考文献[5]) 。通常 ,用 p= 0. 05

　　减(验)趋(p布)(如。差ll行is-,irl(.5](t)t))’和,se)

　　8

　　验浓度组与对照组之间是否存在显著差异(p= 0. 05) 。另外 ,可用非参数检验方法(如根据 Holm 或者

　　GB/T 21828—2025

　　Jonckheere-Terpstra趋势检验得到的 Bonferroni-U检验)确定 NOEC和 LOEC。

　　10. 1.4 限度试验的结果处理

　　如果进行限度试验(仅比较对照组和一个试验浓度组) ,并且满足参数检验方法的先决条件(正态分布和方差齐性) ,可用 Student检验(t检验)方法评估度量响应 。如果这些要求都没有满足 ,可使用一个不等方差的 t检验方法(如 Welch检验)或者如 Mann-Whitney-U检验的一个非参数检验方法 。

　　为了确定对照组间(对照组和溶剂对照组 、分散剂对照组)的显著性差异 ,按照限度试验描述的统计方法检验每个对照组的各个平行 。如果检验不出显著性差异 ,所有对照组和溶剂对照组的平行可合并 。否则 ,所有试验浓度组应与溶剂对照组进行比较 。

　　10.2 试验报告

　　试验报告应包括下列内容 。

　　a) 受试物 :

　　• 通用名 、化学名 、CAS号 ;

　　• 物理属性和相关理化性质 ;

　　• 化学鉴定数据 ,包括纯度 。

　　b) 受试生物 :

　　• 品系(无论是否进行过遗传鉴定) ,提供者(如果已知)和培养条件 ;

　　• 如果不使用大型溞 ,而用其他种类 ,应做鉴定并在报告中说明 。

　　c) 试验条件 :

　　• 试验程序(如半静态或流水式试验 、体积 、每升负载溞数) ;

　　• 光照周期和光照强度 ;

　　• 试验设计(平行数 ,每一平行的溞数) ;

　　• 所用培养基的详细说明 ;

　　• 若 另 外 添 加 有 机 物 , 包 括 成 分 、来 源 、制 备 方 法 、贮 备 液 中的 TOC/COD、试 验 培 养 基TOC/COD测定值 ;

　　• 喂食的详细 资 料 , 包 括 每 只 大 型 溞 每 天 的 喂 食 量(以 碳 计) 和 喂 食 时 间 表(例 如 食 物 类型 ,包括藻的名称 、品系 、培养条件) ;

　　• 试验贮备液的配制方法和更新频率(若使用助溶剂 ,应给出其浓度) 。

　　d) 试验结果 :

　　• 关于受试物稳定性的所有预试验结果 ;

　　• 配制试验浓度和确定试验容器中受试物浓度的所有分析结果(见附录 D) ,测定方法的回收率以及检出限 、定量限 ;

　　• 每个容器中受试物的实测浓度 。添加回收试验的方法和仪器的定量限 ;

　　• 试验容器中的水质(pH值 、温度和溶解氧浓度 、TOC和/或 COD、硬度) ;

　　• 试验期间每只亲溞所产成活幼溞的完整记录(见附录 C) ;

　　• 亲溞死亡数及其死亡时间(见附录 C) ;

　　• 对照组繁殖量的变异系数(以试验结束时每只存活亲溞所产成活幼溞总数为基础) ;

　　• 以试验结束时每一平行中每只存活亲溞(不包括试验期间偶然死亡和/或意 外 死 亡 的 亲溞)所产成活幼溞总数对受试物浓度作图 ;

　　• 每个平行中每只存活的亲溞所产成活幼溞总数对受试物浓度作适当的图 ;

　　• 若适用 ,应报告繁殖的 LOEC,包括对所使用的统计方法的描述和被检测到的效应的大小(实验开始前先进行充分的分析 ,为 LOEC 的测定起辅助作用) ;报告繁殖的 NOEC;用来

　　9

　　GB/T 21828—2025

　　计算 LOEC和 NOEC值的反应变量的信息(或者作为试验期间每个非偶然死亡/意外死亡的亲溞所产的总 的 成 活 幼 溞 数 , 又 或 者 作 为 每 只 存 活 亲 溞 所 产 成 活 幼 溞 总 数) , 若 适用 ,应报告亲溞死亡的 LOEC/NOEC;

　　• 若适用 ,ECx 和置信区间 ,用于计算的模型曲线 ,浓度-反应曲线的斜率及其标准误差 ;

　　• 其他观察到或测定的生物学效应(如亲溞生长等) ,并加以合理的解释 ;

　　• 对于试验中任何偏离本文件的解释说明 。

　　10

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　ElendtM4和 M7培养基的制备

　　A. 1 对 ElendtM4和 M7培养基的适应

　　根据一些实验室的经验 ,很难将溞直接转移到 M4和 M7培养基中 。应通过逐步适应的过程 : 即将溞从原培养基中取出 ,放入比例较低的 Elendt培养基中 ,如 30%的 Elendt培养基中 ,然后增大 Elendt培养基的比例到 60% ,再逐渐增至 100% 。大约需要一个月左右 。

　　A.2 配制

　　A.2. 1 微量元素

　　首先用去离子水 、蒸馏水或反渗透水(以下简称水)分别配制各微量元素的贮备液 Ⅰ 。再用贮备液Ⅰ 制备贮备液 Ⅱ ,其含有所有微量元素(混合液) ,见表 A. 1。

　　表 A. 1 ElendtM4和 M7培养基贮备液 Ⅱ 的制备

　　贮备液 Ⅰ (单一物质)

　　加入到水中的量mg/L

　　浓度

　　(与 M4培养基的关系)

　　为制备贮备液 Ⅱ将贮备液 Ⅰ 加入到水中的量

　　mL/L

　　M4

　　M7

　　H3BO3

　　57 190

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　MnCl2 · 4H2 O

　　7 210

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　LiCl

　　6120

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　RbCl

　　1420

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　SrCl2 · 6H2 O

　　3 040

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　NaBr

　　320

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　Na2 MoO4 · 2H2 O

　　1260

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　CuCl2 · 2H2 O

　　335

　　20 000倍

　　1. 0

　　0. 25

　　ZnCl2

　　260

　　20 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　CoCl2 · 6H2 O

　　200

　　20 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　KI

　　65

　　20 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　Na2 SeO3

　　43. 8

　　20 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　NH4VO3

　　11. 5

　　20 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　Na2 EDTA · 2H2 O

　　5 000

　　2 000倍

　　—

　　—

　　FeSO4 · 7H2 O

　　1 991

　　2 000倍

　　—

　　—

　　Fe-EDTA溶液

　　—

　　1 000倍

　　20. 0

　　5. 0

　　注 : Na2 EDTA 和 FeSO4 两者单独制备 ,混在一起后立即灭菌 。

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　　GB/T 21828—2025

　　A.2.2 M4和 M7培养基

　　用贮备液 Ⅱ 、常量营养元素和维生素配制 M4和 M7培养基 ,具体见表 A. 2。

　　表 A.2 M4和 M7培养基的配制

　　组分

　　加到水中的量mg/L

　　浓度

　　(与 M4培养基的关系)

　　加到制备培养基中贮备液的量

　　mL/L

　　M4

　　M7

　　贮备液 Ⅱ

　　(微量元素混合液)

　　20倍

　　50

　　50

　　常量营养贮备液

　　(单一物质)

　　CaCl2 · 2H2 O

　　293 800

　　1 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　MgSO4 · 7H2 O

　　246 600

　　2 000倍

　　0. 5

　　0. 5

　　KCl

　　58000

　　10 000倍

　　0. 1

　　0. 1

　　NaHCO3

　　64 800

　　1 000倍

　　1. 0

　　1. 0

　　Na2 SiO3 · 9H2 O

　　50 000

　　5 000倍

　　0. 2

　　0. 2

　　NaNO3

　　2 740

　　10 000倍

　　0. 1

　　0. 1

　　KH2PO4

　　1 430

　　10 000倍

　　0. 1

　　0. 1

　　K2 HPO4

　　1 840

　　10 000倍

　　0. 1

　　0. 1

　　混合维生素贮备液

　　—

　　10 000倍

　　0. 1

　　0. 1

　　混合维生素贮备液a

　　盐酸硫胺(维生素 B1 )

　　750

　　10 000倍

　　氰钴胺(维生素 B12)

　　10

　　10 000倍

　　钙长石(维生素 H)

　　7. 5

　　10 000倍

　　注 : 制备培养基时 ,为避免盐沉淀 ,将适量的贮备液加入到 500 mL~ 800 mL去离子水中 ,然后定容至 1 L。

　　a 混合维生素贮备液是将 3 种维生素加到 1 L水中制成的 ,应以较小分装冷藏保存 。在使用前把维生 素 加 入 到培养基中 。

　　12

　　GB/T 21828—2025

　　附 录 B

　　(资料性)

　　总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中 TOC含量的线性图绘制

　　喂食的藻中的碳含量通常不能直接测定 ,可用替代测量参数(例如藻细胞数或光吸收)的相关性(即线性图)来确定碳含量 。

　　测定 TOC,高温氧化法优于紫外(UV)或过硫酸盐法 。

　　绘制线性图 ,采用离心法将藻从生长的培养基中分离 , 随后用蒸馏水重新悬浮 。在每一浓度用三个平行测定替代参数和 TOC浓度 。分析蒸馏水空白并从藻样品的 TOC浓度推出 TOC浓度 。

　　线性图的线性部分涵盖碳浓度范围要求 。如图 B. 1、图 B. 2、图 B. 3 的例子所示 。

　　注 : 这几个图仅为示例 ,不能用于交流 ,各实验室绘制 自 己的线性图 。

　　图 B. 1 总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中 TOC含量示意图一

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　　GB/T 21828—2025

　　图 B.2 总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中 TOC含量示意图二

　　图 B.3 总有机碳(TOC)分析与喂食的藻中 TOC含量示意图三

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　培养基更换 ,物理-化学监测数据 ,喂食、大型溞繁殖和亲溞死亡率数据记录表示例

　　大 型溞繁殖试验 观察记 录表示例见表 C. 1。

　　表 C. 1 大型溞繁殖试验观察记录表

　　试 验 号 : 开始 日期 : 品 系 : 培养基 : 食 物类 型 : 受试 物 : 配 制 浓度 :

　　GB/T 21828—2025

　　总数

　　a 同 时说 明测 的是 哪个 容 器 , 即说 明试 验 容 器 的 编 号 。

　　b 在 相应 的 表格 以 “AB”记 录死 胎 。

　　c 在 相应 的 表格 中 以 “M”记 录 亲 溞死 亡 。

　　新

　　旧

　　新

　　旧

　　新

　　旧

　　总数

　　21

　　20

　　19

　　18

　　17

　　16

　　15

　　14

　　13

　　12

　　11

　　10

　　9

　　8

　　7

　　6

　　5

　　4

　　3

　　2

　　1

　　0

　　试 验 时 间 /d

　　培养基更新 (√ )

　　pHa

　　O2 浓度a/(mg/L)

　　温度a/℃

　　是 否 提供食 物 (√ )

　　成活幼溞数量b

　　容 器 1

　　容 器 2

　　容 器 3

　　容 器 4

　　容 器 5

　　容 器 6

　　容 器 7

　　容 器 8

　　容 器 9

　　容 器 10

　　亲 溞 累 积 死 亡 率 c

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　化学分析结果记录数据表示例

　　化学分析结果记录数据表见表 D. 1 和表 D. 2。

　　表 D. 1 化学分析测定浓度记录数据表

　　配制浓度

　　第一周样品

　　第二周样品

　　第三周样品

　　新换的

　　原来的

　　新换的

　　原来的

　　新换的

　　原来的

　　表 D.2 测定浓度记录数据表(以百分率表示)

　　配制浓度

　　第一周样品

　　第二周样品

　　第三周样品

　　新换的

　　原来的

　　新换的

　　原来的

　　新换的

　　原来的

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　时间-加权平均值的计算

　　若受试物浓度在更换培养基期间是下降的 ,基于生物学和统计学的考虑 ,选择某个浓度作为亲溞暴露浓度范围的代表 。若繁殖主要受峰值浓度影响 ,则使用最高浓度 。若认为受试物的蓄积和长期效应更为重要 ,则时间-加权平均浓度更合适 。

　　时间-加权平均浓度的示例如图 E. 1所示 :

　　图 E. 1 时间-加权平均值示例

　　图 E. 1是个简化了的试验的示例 ,试验持续 7 d,在第 0 天 、第 2 天 、第 4 天更新培养基 。

　　图 E. 1 中 “之 ”字形线代表任意时间点的浓度 ,假定浓度是沿着某一指数衰减过程下降的 ; 6 个方形点代表在每一个更换周期开始与结束时测定的浓度 ;粗实线表示时间-加权平均值的位置 。

　　因时间-加权平均值下的面积与浓度曲线下的面积相等 , 可经计算得出时间-加权平均值 。 上例的计算见表 E. 1。

　　表 E. 1 时间-加权平均值计算

　　更换编号

　　d

　　ρ0

　　ρ1

　　ln ρ0

　　ln ρ1

　　S

　　1

　　2

　　10. 000

　　4. 493

　　2. 303

　　1. 503

　　13. 767

　　2

　　2

　　11. 000

　　6. 037

　　2. 398

　　1. 798

　　16. 544

　　3

　　3

　　10. 000

　　4. 066

　　2. 303

　　1. 403

　　19. 781

　　总天数 :7

　　时间-加

　　总面积 :50. 092

　　权平均值 :7. 156

　　每一个更新周期指数曲线下的面积用式(E. 1)进行计算 。

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　　S d …………………………( E. 1 )

　　式中 :

　　S — 每一更新周期指数曲线下的面积 ,单位为毫克每升天[mg/(L · d)] ;

　　ρ0 — 每一更新周期开始时测定的质量浓度 ,单位为毫克每升(mg/L) ;

　　ρ1 — 每一更新周期结束时测定的质量浓度 ,单位为毫克每升(mg/L) ;

　　lnρ0 — 浓度 ρ0 的自然对数 ;

　　lnρ1 — 浓度 ρ1 的自然对数 ;

　　d — 更新周期内的天数 ,单位为天(d) 。

　　时间-加权平均值(TW)是用总面积除以总天数 。

　　对于溞类繁殖试验 ,表格应扩大到 21 d。

　　仅在每一更新周期的开始和结束时测浓度 ,不足以确定浓度衰减过程为指数型 。不同的曲线计算出不同的面积 。但衰减过程可能是指数型 ,且指数型可能是在缺乏其他信息情况下的最佳曲线 。

　　若在更新周期结束时化学分析未发现受试物 ,则需慎重 。如不能估测出受试物从溶液中消失的速率 ,则不能获得曲线下可靠的面积 , 因此 ,也不可能获得合理的时间-加权平均值 。

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　　附 录 F

　　(资料性)

　　幼溞性别鉴别指南

　　如果环境条件发生变化(例如光周期缩短 、温度降低 、食物浓度降低 、种群密度增加) ,大型溞的雌溞可能繁殖雄性幼溞 。在化学品胁迫的条件下 ,孤雌生殖的雌溞所产幼溞的繁殖能力可能降低 , 同时也可能出现雄性幼溞增加的现象 。 因本文件试验方法的主要目标是评价幼溞的繁殖量 ,可将雄性幼溞的出现作为一个备选的观 察 终 点 。 如 增 加 这 个 备 选 观 察 终 点,则 将 对 照 组 中 雄 性 幼 溞 出 现 的 比 率 不 超 过5%增补为试验有效性的判定标准 。

　　因为雄溞和雌溞的遗传学特征完全一致 ,而且其性别取决于环境条件 ,所以根据大型溞的形态学特征来区分不同性别的大型溞 ,是可操作性最强且最简单易行的方法 。可通过第一根触角的长度和形态的差异来区分雄溞和雌溞 ,雄溞的第一根触角比雌溞的长(见图 F. 1) 。这个差异在幼溞出生后即可辨别 ,而其他第二性别特征是随着成长逐渐发育出来的 。

　　为了观察性别分化的形态学特征 ,使用吸管将每只亲溞所产的幼溞转移到盛有培养基的培养皿中 。培养基使用应保持在最小量 , 以限制幼溞游动 。可在体视显微镜( ×10~ ×60)下观察第一根触角 。

　　溞龄为 24h 的雄溞(左)与雌溞(右)示例见图 F. 1。

　　注 : 黑色圆圈中显示雄溞和雌溞在第一根触角的长度和形态方面的差异 。

　　图 F. 1 溞龄为 24h 的雄溞(左)与雌溞(右)示例

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　　GB/T 21828—2025

　　参 考 文 献

　　[1] ASTM. (2008) Standard GuideforConductingAcuteToxicityTestswithFishes,Macroin- vertebrates,and Amphibians. In: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Tech- nology, vol. 11. 04; ASTM E729-96 ( 2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia,PA.

　　[2] OECD GuidelinesforTheTesting ofChemicals No. 211Daphniamagna Reproduction Test (2012) .

　　[3] OECD Guidelines for The Testing of Chemicals No. 316 Phototransformation of Chemicals in Water-DirectPhotolysis(2008) .

　　[4] OECD Guidelines for The Testing of Chemicals No. 310 Ready Biodegradability-CO2 in Sealed Vessels (Headspace Test)(2014) .

　　[5] OECD Series on Testing and AssessmentNumber54 CurrentApproachesin The Statisti- calAnalysis ofEcotoxicityData:A Guidance to Application(2012) .

　　20