GB/T 21107-2025 饲料中马、驴源性成分的测定

　　ICS 65. 120 CCS B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21107—2025代替 GB/T21107—2007

　　饲料中马、驴源性成分的测定

　　Determination ofhorseanddonkey-derived materialsin feeds

　　2025-06-30发布 2026-01-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21107—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件 代 替 GB/T 21107—2007《动 物 源 性 饲 料 中 马 、驴 源 性 成 分 定 性 检 测 方 法 PCR 方 法》, 与GB/T 21107—2007相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 更改了适用范围和检出限(见第 1 章 ,2007年版的第 1 章) ;

　　b) 增加了 “缩略语 ”一章(见第 4章) ;

　　c) 增加了 “实时荧光聚合酶链式反应法 ”一章(见第 5 章) ;

　　d) 更改了样品(见 6. 4,2007年版的第 7章) ;

　　e) 更改了结果判定与表述(见 6. 6,2007年版的第 9章) ;

　　f) 更改了实验室污染防治措施(见第 7章 ,2007年版的第 10章) ;

　　g) 增加了 “危害性废弃物处理 ”一章(见第 8章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 、新希望六和股份有限公司 。

　　本文件主 要 起 草 人 : 蔡 一 村 、潘 良 文 、韩 伟 、李 勇 、许 镇 坚 、杨 青 、张 语 秋 、张 晨 、邵 冰 玉 、薛 俊 欣 、林颖峥 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2007年发布的 GB/T 21107—2007;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21107—2025

　　饲料中马、驴源性成分的测定

　　1 范围

　　本文件描述了饲料中马 、驴源性成分的实时荧光聚合酶链式反应和聚合酶链式反应检测方法 。

　　本文件中实时荧光 PCR法适用于配合饲料 、浓缩饲料 、精料补充料 、饲料原料 、复合预混合饲料和混合型饲料添加剂中马 、驴源性成分的定性检测;PCR法适用于动物源性饲料原料中马 、驴源性成分的检测 。

　　本文件的检出限为 0. 1% 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19495. 3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

　　GBT 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　bp:碱基对(base pair)

　　Ct值 :循环阈值(cycle threshold)

　　CTAB:十六烷基三甲基溴化铵 (cetyltrimethylammonium bromide)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　Tris:三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethylaminomethane)

　　5 实时荧光聚合酶链式反应法

　　5. 1 原理

　　根据马和驴的特异性 DNA 片段设计引物和探针 ,采用实时荧光 PCR 技术进行扩增 ,根据扩增反应中产生的荧光信号和 Ct值实现对马 、驴源性 DNA成分的检测 。

　　1

　　GB/T 21107—2025

　　5.2 试剂或材料

　　除非另有规定 ,仅使用分析纯试剂 。所有试剂均使用无 DNA酶污染的容器存储或分装 。

　　5.2. 1 水 :GB/T 6682,一级 。

　　5.2.2 2×实时荧光 PCR预混液 :含有 Taq DNA 聚合酶 、实时荧光 PCR缓冲液 、MgCl2 和 dNTPs等成分 。

　　5.2.3 氢氧化钠溶液(10 mol/L) :称取 400 g氢氧化钠 ,加水定容至 1 L。

　　5.2.4 Tris-盐酸溶液(1 mol/L) :称取 121. 1 gTris溶解于 800mL水中 ,用盐酸调 pH 至 8. 0,加水定容至 1 L。在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,室温保存 。

　　5.2.5 EDTA溶液(0. 5 mol/L) :称取 186. 1 g Na2EDTA · 2H2 O 溶解于 800 mL水中 ,磁力搅拌器上剧烈搅拌 ,加入氢氧化钠约 20 g,再滴加氢氧化钠溶液(5. 2. 3) 调 pH 至 8. 0,定容至 1 L,在 103. 4 kPa、 121 ℃灭菌 20 min,室温保存 。

　　5. 2.6 Tris-EDTA(TE)缓冲液 :分别量取 10mL Tris-盐酸溶液(5. 2. 4)和 2 mLEDTA溶液(5. 2. 5) ,加水定容至 1 L,混匀 ,在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,备用 。

　　5.2.7 引 物 和 探 针 : 用 TE 缓 冲 液(5. 2. 6) 或 水 将 每 条 引 物 或 者 探 针 分 别 配 制 成 10 μmol/L工 作 溶液 ,备用 。 -18 ℃以下分装保存 ,避免多次冻融 。序列见表 1。

　　5.2. 8 阳性对照样品 :含有马 、驴源成分的样品 。

　　5.2.9 阴性对照样品 :不含有马 、驴源成分但含有其他动物成分的样品 。

　　表 1 引物探针序列

　　目标物种

　　引物探针名称

　　序列

　　基因序列号

　　片段大小/bp

　　18S rRNA

　　18S-179bp-F

　　5'-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3'

　　AF176811. 1

　　179

　　18S-179bp-R

　　5'-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3'

　　18S-179bp-P

　　5'-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3'

　　马

　　Horse-125 bp-F

　　5'-ACTCATCAAACGCCGCTCTC-3'

　　NC_009171. 3

　　125

　　Horse-125 bp-R

　　5'-GCTGTGAAGACCCCGTTGG-3'

　　Horse-125 bp-P

　　5'-[FAM]-CCAGGGCTCGGTGCTTCCAATCGC-[TAMRA]-3'

　　驴

　　Donkey-95 bp-F

　　5'-TGAGTCAGGTGCTCCTTGAAC -3'

　　NC_052194. 1

　　95

　　Donkey-95 bp-R

　　5'-CTGAGGCACTCGTCTCTCTTG -3'

　　Donkey-95 bp-P

　　5'-[FAM]-CCGCTTCCCGTCAGTTGTGTCCTTAGTTG-[TAMRA] -3'

　　注 : 扩增靶标序列见附录 A。

　　5.3 仪器设备

　　5.3. 1 实时荧光 PCR仪 。

　　5.3.2 分析天平 :精度 0. 1 mg。

　　5.3.3 离心机 :离心速度不低于 14000 r/min。

　　5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪 。

　　5.3.5 微量移液器 :2. 5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL等规格 。

　　2

　　GB/T 21107—2025

　　5.4 样品

　　按照 GB/T 20195规定制备试样 ,至少 200g,粉碎或碾磨使其全部通过 0. 25 mm 孔径的试验筛 ,充分混匀 ,装入密闭容器中 ,备用 。也可采用经过验证等效的其他粉碎和碾磨方法 。

　　同法制备阳性对照样品(5. 2. 8)和阴性对照样品(5. 2. 9) 。

　　注 : 粉碎或研磨一个样品后 ,清洗粉碎机或研磨仪的容器和刀具 , 防止污染 。

　　5.5 试验步骤

　　5.5. 1 DNA提取

　　平行做两份试验 。称取试 样 100 mg~ 200 mg,按 照 GB/T 19495. 3—2004 附 录 C 中 C. 6. 2 提 取DNA。也可采用经过验证可靠的 DNA 提取试剂盒进行 DNA 提取 ,具体参照说明书使用 。 提取空白对照除不加试样外 ,其他操作同试样一致 。必要时 ,提取阳性对照样品和阴性对照样品的 DNA。

　　注 : 提取出的 DNA如需保存 ,置于 -18℃以下 。

　　5.5.2 DNA 溶液浓度测定

　　用紫外分光光度计(波长 :260 nm)或微量核酸蛋白测定仪(5. 3. 4) 测定 DNA 溶液(5. 5. 1) 的质量浓度 。DNA溶液质量浓度宜控制在 5 ng/μL~ 50 ng/μL。

　　5.5.3 对照设置

　　实时荧光检测过程中应设置阳性对照 、阴性对照 、扩增空白对照 、提取空白对照(5. 5. 1) 。用阳性样品(5. 2. 8)的 DNA作阳性对照 ,用阴性样品(5. 2. 9) 的 DNA作阴性对照 ,用等体积的水代替 DNA 溶液作为扩增空白对照 。

　　5.5.4 反应体系

　　按表 2 配制实时荧光 PCR检测反应体系 。

　　表 2 实时荧光 PCR检测反应体系

　　试剂

　　试剂浓度

　　体积/μL

　　2×实时荧光 PCR预混液(5. 2. 2)

　　2×

　　12. 5

　　上游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　下游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　探针

　　10 μmol/L

　　0. 5

　　DNA溶液

　　5 ng/μL~ 50 ng/μL

　　5

　　水

　　—

　　5

　　注 : 不同品牌的实时荧光 PCR检测试剂 ,其反应缓冲液成分可能不同 ,具体操作参见产品使用说明书 。

　　5.5.5 实时荧光 PCR扩增

　　按表 3反应参数在实时荧光 PCR仪上进行扩增 , 以平行测定的 Ct值的平均值作为最终结果 。

　　3

　　GB/T 21107—2025

　　表 3 实时荧光 PCR反应参数

　　反应步骤

　　反应温度

　　反应时间

　　循环数

　　预变性

　　95 ℃

　　10 min

　　1

　　热循环

　　95 ℃

　　15 s

　　40

　　60 ℃

　　1 min

　　注 : 不同品牌的实时荧光 PCR检测试剂 ,对 PCR反 应 程 序 的 设 置(如 : 变 性 温 度) 可 能 不 同 ,具 体 操 作 参 见 产 品使用说明书 。

　　5.6 质量控制

　　5.6. 1 内参对照基因扩增

　　真核生物内参对照基因 18S rRNA基因检测应符合下列条件 ,否则重新提取核酸样品 :

　　a) 提取空白对照 :Ct值 ≥37. 0 或无 Ct值 ;

　　b) 扩增空白对照 :Ct值 ≥37. 0 或无 Ct值 ;

　　c) 阴性对照 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤28. 0;

　　d) 阳性对照 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤28. 0;

　　e) 待测样品 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤33. 0。

　　5.6.2 马、驴源性特异基因扩增

　　马 、驴源性特异基因的实时荧光 PCR检测应符合以下条件 :

　　b(a))) 扩增空白对照(提取空白对照) :: Ct值(Ct值)40(40).. 0或无 Ct值(0或无 Ct值) ;;

　　d(c))) 阳性对照(阴性对照) ::荧(Ct)光(值)道(40)有.0荧(或)光(无)信C号检(t值);出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤35. 0。

　　5.7 结果判定和表述

　　5.7. 1 结果判定

　　符合 5. 6 时 ,被测样品的检测结果按以下进行判定 :

　　a) Ct值 ≤35. 0,则判定为被检样品阳性 ;

　　b) Ct值 =40. 0 或无 Ct值 ,则判定为被检样品阴性 ;

　　c) 35. 0

　　5.7.2 结果表述

　　结果为阳性的表述为 “检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　结果为阴性的表述为 “未检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　4

　　GB/T 21107—2025

　　6 聚合酶链式反应法

　　6. 1 原理

　　利用裂解液破碎细胞 , 三 氯 甲 烷 抽 提 蛋 白 质 , 异 丙 醇 沉 淀 得 到 DNA; 以 提 取 的 DNA 为 模 板 进 行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物;PCR 阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证 。

　　6.2 试剂或材料

　　除非另有规定外 ,仅使用分析纯试剂 。所有试剂均使用无 DNA酶污染的容器存储或分装 。

　　6.2. 1 水 :GB/T 6682,一级 。

　　6.2.2 马 、驴源性成分检测用引物(对)序列为 :F:5'-TGC CAC AGT TGG ATA CAT CAA C-3' R :5'-ATT GAG ATT AGG CGA TTG TT-3'。

　　6.2.3 Taq DNA聚合酶(Thermusaquaticu,水生栖热菌) 。

　　6.2.4 限制性内切酶 :Sau3A I酶 ,Alu I酶 。

　　6.2.5 dNTPs:dATP (deoxyadenosine triphosphate, 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 ) 、dTTP (deoxythymidine triphosphate, 脱 氧 胸 苷 三 磷 酸) 、dCTP(deoxycytidine triphosphate,脱 氧 胞 苷 三 磷 酸) 、dGTP(deox- yguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸) 。

　　6.2.6 琼脂糖 : 电泳纯 。

　　6.2.7 溴化乙锭 。

　　6.2. 8 三氯甲烷 。

　　6.2.9 异丙醇 。

　　6.2. 10 体积分数为 70%乙醇 。

　　6.2. 11 分子量标准品(100bp~ 2 000 bp) 。

　　6.2. 12 裂 解 液 : 1% CTAB(cetyltrithylammonium bromide, 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵) , 0. 05 mol/L Tris-HCl(pH 8. 0) [Tris-: tris(hydroxymethyl) aminomethane, 三 (羟 甲 基) 氨 基 甲 烷] , 0. 7 mol/L NaCl,0. 01 mol/LEDTA(pH 8. 0)(ethylene diaminetetraacetic acid, 乙二胺四乙酸) 。

　　6.2. 13 TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液) : 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0) , 1 mmol/L EDTA(pH 8. 0) 。

　　6.2. 14 10×PCR缓冲液 :100 mmol/L KCI, 160 mmol/L (NH4 )2SO4 , 20 mmol/L MgSO4 , 200 mmol/L Tris-HCI(pH 8.8) ,1% Triton X-100(t-octylphenoxypolyethoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇) ,1 mg/mL BSA(bovineserum albumin,牛血清蛋白) 。

　　6.2. 15 电 泳 缓 冲 液 : Tris 54 g, 硼 酸 27. 5 g, 0. 5 mol/L TE 缓 冲 液 (pH 8. 0) 20 mL, 加 蒸 馏 水 至1 000 mL;使用时 10倍稀释 。

　　6.2. 16 溴化乙锭贮存液 :用水配制成 10 mg/mL。

　　6.2. 17 加样缓冲液 :0. 25%溴酚蓝 ,质量分数为 40%的蔗糖水溶液 。

　　6.2. 18 酶切缓冲液 :10 mmol/LTris-HCl(pH 7.5) ,10 mmol/LMgCl2 ,50 mmol/LNaCl,0.1 mg/mLBSA。

　　6.3 仪器设备

　　6.3. 1 DNA热循环仪 。

　　6.3.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。

　　6.3.3 恒温水浴锅 。

　　6.3.4 离心机 :离心力 12 000g。

　　6.3.5 微量移液器 。

　　5

　　GB/T 21107—2025

　　6.3.6 电泳仪 。

　　6.3.7 紫外检测仪 。

　　6.3. 8 pH 计 。

　　6.3.9 天平 :精度 0. 1 mg。

　　6.4 样品

　　同 5. 4。

　　6.5 试验步骤

　　6.5. 1 总 DNA提取

　　称取 100 mg试样于 1. 5 mL离心管中 ,加入 600 μL ~ 800 μL裂解液 ,涡旋混匀 ,置于 65 ℃恒温水浴中保持 30min,期间不时振荡混匀;12000g离心 5 min,转移上清液于洁净离心管中 ,加 400μL三氯甲烷 +异戊醇(24+1) ,混匀;12000g 离心 5 min,取上清液 ;在上清液中加入等于该上清液体积 0. 8倍的异丙醇 , 沉 淀 ; 12 000g 离 心 5 min, 弃 上 清 液 ; 体 积 分 数 为 70% 的 乙 醇 洗 涤 一 次 , 晾 干 ; 加 入50 μLTE,溶解沉淀 。

　　也可用等效 DNA提取试剂盒提取模板 DNA。

　　6.5.2 DNA 浓度和纯度测定

　　取 5 μL DNA溶液加水稀释至 1 mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和280 nm 处的吸光值 A260和 A280 。DNA 的质量浓度按公式(1)计算 :

　　c=A × N × 50/1 000 ……………………( 1 )

　　式中 :

　　c—DNA质量浓度 ,单位为微克每微升(μg/μL) ;

　　A— 260 nm 处的吸光值 ;

　　N— 核酸稀释倍数 。

　　当 A280/A260 比值在 1. 7~ 1. 9之间时 ,适宜于 PCR扩增 。

　　6.5.3 PCR扩增

　　25 μL的反应体系 ,在 0. 2 mL 的 PCR 反应管中 ,加入上下游引物各 200 nmol/L,10×PCR反应缓冲液 ,2 mmol/L MgCl2 , 200 nmol/L dNTPs, 1. 5U Taq DNA 聚 合 酶 , 1. 0 μL DNA 模 板(100 ng ±

　　50 ng DNA) 。

　　PCR反应条件随仪器不同略有改变 ,一般的反应程序为 : 94 ℃预变性 1 min~ 3 min , 94 ℃变性30 s~ 60 s,57 ℃退火 30 s~ 60 s,72 ℃延伸 30 s~ 60 s,30个循环 ,72 ℃延伸 5 min。4 ℃保存 。

　　检测过程中分别设阳 性 对 照 、阴 性 对 照 和 空 白 对 照 。 用 已 知 含 马 或 驴 源 性 成 分 的 样 品 作 阳 性 对照 ,用已知不含马和驴源性成分但含有其他动物成分的样品作阴性对照 ,用等体积的水代替模板 DNA作空白对照 。

　　6.5.4 PCR扩增产物电泳检测

　　取 2 g 琼 脂 糖 , 于 100 mL 电 泳 缓 冲 液 中 加 热,充 分 熔 化 , 加 入 溴 化 乙 锭 贮 存 液 至 终 质 量 浓 度 为0. 5 μg/mL,制胶 。在电泳槽中加入电泳缓冲液 ,使液面刚刚没过凝胶 。将 5 μL~ 8 μL PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合,点样 。9 V/cm 恒压电泳 ,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 。 紫外检测仪下观察电泳结果并记录 。

　　6

　　GB/T 21107—2025

　　6.5.5 限制性内切酶酶切及产物电泳检测

　　如果 PCR 扩增产物电泳检测结果阳性 ,进行限制性内切酶酶切反应 。

　　反应体系(50 μL) : Sau3A I 酶 或 Alu I 酶 1 μL(10 U/μL) , 酶 切 缓 冲 液 5 μL, PCR 扩 增 产 物20 μL,水 24μL。 充 分 混 匀 反 应 液 , 37 ℃水 浴 1 h, 65 ℃水 浴 5 min终 止 酶 切 反 应 。 酶 切 完 成 后 电泳 ,方法见 6. 5. 4。

　　6.6 结果判定与表述

　　6.6. 1 PCR扩增产物电泳检测结果

　　若 PCR扩增产物大小为 294bp(序列参考附录 B) ,需要进行酶切 ;

　　若无 PCR扩增条带为阴性 。

　　6.6.2 限制性内切酶酶切电泳检测结果

　　PCR扩增产物经 Sau3A I 限制 性 内 切 酶 酶 切 后 , 片 段 大 小 是 226 bp和 68 bp为 马 阳 性 , 否 则 为阴性 。

　　PCR扩增产物经 Alu I 限 制 性 内 切 酶 酶 切 后 , 片 段 大 小 是 113 bp和 181 bp为 驴 阳 性 , 否 则 为阴性 。

　　6.6.3 结果表述

　　PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马 、驴源性成分 ,表述为未检出马 、驴源性成分 。

　　PCR扩增产物电泳检测结果片段大小正确且限制性内切酶酶切产物片段大小正确 ,判为含有马或驴源性成分 ,表述为检出马或驴源性成分 。

　　7 实验室污染防治措施

　　按照 GB/T 27403—2008附录 D 的规定执行 。

　　8 危害性废弃物处理

　　按照 GB/T 27403—2008中 5. 5. 2 的规定执行 。

　　7

　　GB/T 21107—2025

　　附 录 A

　　(资料性)

　　马、驴实时荧光 PCR检测内参对照基因及靶基因序列

　　A. 1 18SrRNA

　　18S rRNA 内参对照基因序列如下 :

　　A.2 马(Equuscaballus)

　　马靶基因序列如下 :

　　A.3 驴(Equusasinus)

　　驴靶基因序列如下 :

　　注 : 单下划线为引物位置 ,双下划线为探针位置 。

　　8

　　GB/T 21107—2025

　　附 录 B

　　(资料性)

　　PCR产物测序结果

　　B. 1 马(Equuscaballus)

　　马靶基因序列如下 :

　　B.2 驴(Equusasinus)

　　驴靶基因序列如下 :

　　注 : 单下划线为引物位置 。

　　9

　　GB/T 21107—2025

　　参 考 文 献

　　[1] ISO/TS20224-6:2020 Molecularbiomarkeranalysis—Detection ofanimalderived materi- alsin foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR—Part6: Horse DNA detection method

　　[2] ISO/TS20224-7:2020 Molecularbiomarkeranalysis—Detection ofanimalderived materi- alsin foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR—Part7:DonkeyDNA detection method

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