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GB/T 18646-2025 动物布鲁氏菌病诊断技术

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资料介绍

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中华人民共和国国家标准

　　GB/T 18646—2025代替 GB/T 18646—2018

　　动物布鲁氏菌病诊断技术

　　Diagnostic techniques for animal brucellosis

　　2025⁃05⁃30 发布 2025⁃12 ⁃01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 18646—2025

　　前言 Ⅴ

　　引言 Ⅵ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 临床诊断 2

　　5.1 流行特点 2

　　5.2 临床症状 2

　　5.3 病理变化 3

　　5.4 结果判定 3

　　6 样品采集、保存、运输及处理 3

　　6.1 仪器设备 3

　　6.2 试剂材料 3

　　6.3 样品采集 3

　　6.4 样品运输和保存 4

　　6.5 样品处理 4

　　7 病原学诊断方法 5

　　7.1 改良萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色 5

　　7.2 布鲁氏菌分离与鉴定 6

　　7.3 实时荧光 PCR 方法 7

　　7.4 荧光 RAA 方法 9

　　7.5 多重 PCR 方法 11

　　8 免疫学诊断方法 12

　　8.1 标准血清 12

　　8.2 虎红平板凝集试验(RBT) 13

　　8.3 试管凝集试验(SAT) 14

　　8.4 补体结合试验(CFT) 17

　　8.5 间接 ELISA 抗体检测方法(iELISA) 22

　　8.6 竞争 ELISA 抗体检测方法(cELISA) 24

　　8.7 荧光偏振试验(FPA) 26

　　8.8 全乳环状试验(MRT)(仅适用于牛) 29

　　8.9 免疫层析法(ICA) 30

　　Ⅰ

　　GB/T 18646—2025

　　9 综合判定 30

　　9.1 布鲁氏菌疑似感染动物判定 30

　　9.2 布鲁氏菌感染动物判定 31

　　附录 A(资料性) 检测方法的适用性 32

　　附录 B(规范性) 布鲁氏菌培养基的配制 33

　　B .1 基础培养基 33

　　B .2 血清葡萄糖培养基 33

　　B .3 选择培养基 33

　　附录 C(规范性) 生化反应试剂的配制 34

　　C .1 结晶紫储备液和工作液配制 34

　　C .2 氧化酶试验试剂配制 34

　　C .3 尿素酶活性试验培养基配方及制备 34

　　附录 D(规范性) 布鲁氏菌种和生物型的生化鉴定 35

　　附录 E(规范性) 实时荧光 PCR、RAA 及多重 PCR 引物和探针序列 37

　　附录 F(规范性) 多重 PCR 溶液配制及结果判定 39

　　F .1 TAE 电泳缓冲液 39

　　F .2 1.5% 琼脂糖凝胶 39

　　F .3 多重 PCR 判定标准 39

　　附录 G(规范性) 试管凝集试验(SAT)试剂的配制 40

　　G .1 含 0.5% 苯酚的生理盐水 40

　　G .2 含 0.5% 苯酚的 10% 氯化钠溶液 40

　　G .3 参照比浊管的制备 40

　　附录 H(规范性) 补体结合试验(CFT)试剂的配制及效价测定 41

　　H .1 稀释液配制 41

　　H .2 绵羊红细胞悬液的配制(2 .5%) 41

　　H .3 溶血素效价测定 41

　　H .4 补体制备及效价测定 44

　　H .5 抗原效价的测定 49

　　H .6 溶血标准比色管的制备及补体结合试验结果判定方法 50

　　H .7 待检血清的稀释和灭活 51

　　附录 I(规范性) 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂的制备 52

　　I.1 包被抗原 LPS 提取 52

　　I.2 包被液(0 .05 mol/L 的 pH 9.6 碳酸盐缓冲液) 52

　　I.3 封闭液(含 2% BSA 、0.05% 吐温-20 的 pH 7.4 PBS) 52

　　I.4 样品稀释液(含 1%BSA 的 pH 7.4 PBS) 52

　　I.5 洗涤液(含 0.05% 吐温-20 的 pH 7.4 PBS) 52

　　Ⅱ

　　GB/T 18646—2025

　　I.6 显色液 52

　　I.7 终止液(2 mol/L 硫酸) 53

　　附录 J(资料性) 竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)单克隆抗体的制备 54

　　附录 K(规范性) 荧光偏振试验(FPA)抗原和稀释液的制备 55

　　K .1 标记抗原的制备 55

　　K .2 样品稀释液的配制 55

　　参考文献 56

　　Ⅲ

　　GB/T 18646—2025

　　前言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件代替 GB/T 18646—2018《动物布鲁氏菌病诊断技术》，与 GB/T 18646—2018 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

　　a) 更改了“范围”(见第 1 章，2018 年版的第 1 章);

　　b) 更改了“ 临床诊断”，增加了流行病学、临床症状和病理变化内容(见第 5 章，2018 年版的 4.1、 4.2、4.3);

　　c) 增加了“实时荧光 PCR 方法 ”“荧光 RAA 方法”(见 7.3 和 7.4);

　　d) 将“布鲁氏菌 Bruce-Ladder 检测方法 ”更改为“多重 PCR 方法”(见 7.5，2018 年版的 4.13);

　　e) 增加了免疫学诊断方法中 RBT 、SAT 、CFT 、iELISA 、cELISA 和 FPA 方法的标准化内容(见第 8 章);

　　f) 更改了“ 虎红平板凝集试验(RBT)”(见 8.2，2018 年版的 4.4)、“间接 ELISA 抗体检测方法(iELISA)”(见 8.5，2018 年版的 4.8)、“竞争 ELISA 抗体检测方法(cELISA)”(见 8.6，2018年版的 4.9);

　　g ) 增加了“荧光偏振试验(FPA)”“免疫层析法(ICA)”(见 8.7 和 8.9)。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。

　　本文件起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国疾病预防控制中心、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、辽宁省动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心、河南省动物疫病预防控制中心、重庆市动物疫病预防控制中心、浙江省动物疫病预防控制中心、青岛市动物疫病预防控制中心。

　　本文件主要起草人：孙淑芳、李俊平、邵卫星、孙明军、姜海、南文龙、田莉莉、樊晓旭、焉鑫、孙雨、胡森、李岩、朱良全、王建龙、闫若潜、张存瑞、李彦、顾贵波、赵洪进、董春霞、赵灵燕、郭宇、孙翔翔、刘蒙达、张皓博、孙世雄、李嘉琪。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

　　——2002 年首次发布为 GB/T 18646—2002，2018 年第一次修订;

　　——本次为第二次修订。

　　Ⅴ

　　GB/T 18646—2025

　　引言

　　布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)感染动物和人而引起的一种人兽共患传染病。目前已报道的布鲁氏菌属成员包括 6 个经典种、5 个新鉴定种及部分未确定种型的非典型布鲁氏菌。经典种包括羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌(Bru ⁃ cella suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬种布鲁氏菌(Brucella canis)和沙林鼠种布鲁氏菌(Brucella neotomae);新鉴定种包括鲸种布鲁氏菌(Brucella ceti)、鳍种布鲁氏菌(Brucella pinnipedia⁃ lis)、田鼠种布鲁氏菌(Brucella microti)、人源布鲁氏菌(Brucella inopinata，暂未确定其他动物宿主)和狒狒种布鲁氏菌(Brucella papionis);未确定种型的包括分离自啮齿类、狐类和蛙类的非典型布鲁氏菌。本文件主要规定了对畜牧业影响最大的羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌三种光滑型布鲁氏菌引起的动物布鲁氏菌病相关诊断检测技术内容，仅在病原鉴定及 PCR 检测方法中涉及了粗糙型的绵羊附睾种和犬种布鲁氏菌检测。

　　布鲁氏菌病在全世界范围内严重威胁动物和人类健康。世界动物卫生组织(World Organization of Animal Health，WOAH)将布鲁氏菌病列入通报病种名录，我国农业农村部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》将布鲁氏菌病列为二类动物疫病，国家卫生健康委员会将布鲁氏菌病列为法定报告乙类传染病。从事布鲁氏菌病诊断相关的样品采集、包装运输、检测诊断等活动的人员，经过严格培训，在相应级别的生物安全防护条件下进行试验活动。

　　本文件参考了 WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》3 .1.4 章“布鲁氏菌病(牛种、羊种和猪种布鲁氏菌感染)(2022 版)”规定的诊断技术方法，包括临床诊断、病原学诊断方法(涂片镜检、分离与鉴定、实时荧光 PCR 方法)及免疫学诊断方法[虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、间接 ELISA 抗体检测方法(iELISA)、竞争 ELISA 抗体检测方法(cELISA)、荧光偏振试验(FPA)和全乳环状试验(MRT)];并根据我国技术发展增加了技术成熟的荧光 RAA 方法和免疫层析法(ICA)。

　　本文件的发布机构提请注意，声明相关产品符合本文件时，可能涉及本文件 7.3 中引物和探针序列与《一种区分布鲁氏菌 A19 疫苗株与野毒株的分子标记》(授权公告号：CN113186312B)、《鉴别布鲁氏菌疫苗株 S2 和野毒株的 SNP 分子标记及其应用》(授权公告号：CN111793704B)相关专利的使用。

　　本文件的发布机构对于涉及专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

　　该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组织或个人在实施该国家标准时实施专利。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：

　　专利(授权公告号：CN113186312B)持有人姓名：中国动物卫生与流行病学中心。

　　地址：山东省青岛市市北区南京路 369 号。

　　专利(授权公告号：CN111793704B)持有人姓名：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

　　地址：北京市昌平区昌百路 155 号。

　　请注意，除上述 2 项专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　Ⅵ

　　GB/T 18646—2025

　　动物布鲁氏菌病诊断技术

　　1 范围

　　本文件描述了动物布鲁氏菌病的临床诊断方法、病原学诊断方法和免疫学诊断方法，并规定了综合判定要求。

　　本文件适用于布鲁氏菌病畜群无疫检测、动物个体无疫检测、根除计划实施、疑似或临诊病例确诊、群体流行率监测等。

　　注：附录 A 中详细列出了不同领域检测方法的选择。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　cELISA：竞争酶联免疫吸附试验(Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

　　CFT：补体结合试验(Complement Fixation Test)

　　Ct：循环阈值(Cycle Threshold)

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　FPA：荧光偏振试验(Fluorescence Polarisation Assay)

　　HRP：辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase)

　　ICA：免疫层析试验(Immunochromatography Assay)

　　iELISA：间接酶联免疫吸附试验(Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

　　LPS：脂多糖(Lipopolysaccharide)

　　MRT：全乳环状试验(Milk Ring Test)

　　OD 值：光密度值(Optical Density)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　RAA：重组酶介导等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification)

　　RBT：虎红平板凝集试验(Rose Bengal Test)

　　SAT：试管凝集试验(Serum Agglutination Test)

　　SDS：十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)

　　GB/T 18646—2025

　　5 临床诊断

　　5.1 流行特点

　　5.1.1 传染源与传播因子

　　布鲁氏菌病的主要传染源是患病或无症状的感染带菌动物。感染母畜流产或分娩时的胎儿、胎盘、胎衣、羊水、阴道分泌物等，感染动物的乳汁或精液中均含有大量布鲁氏菌。感染动物的头部淋巴结、脾脏、生殖器官(子宫、睾丸和附睾)以及关节病变部位均含有布鲁氏菌 ;在急性感染期，动物的肝脏、脾脏及主要淋巴结均含有布鲁氏菌。

　　5.1.2 传播途径

　　5.1.2.1 呈典型接触传播特征，直接或间接接触均可造成传播，主要感染途径是消化道，也可通过呼吸道、黏膜、皮肤(尤其是带有伤口的皮肤)感染。

　　5.1.2.2 动物可因接触或舔食感染母畜的流产物、刚分娩的幼畜、胎衣、被污染的饲料、饲草、地面和饮水而感染。

　　5.1.2.3 感染动物交配时可互相传染。若精液中含有布鲁氏菌，实施人工授精也可导致母畜感染。

　　5.1.2.4 垂直传播和未经消毒的感染动物乳汁饲喂是新生动物感染的主要途径。

　　5.1.3 易感动物

　　布鲁氏菌病是自然疫源性疫病，布鲁氏菌可感染多种易感动物。家养动物中，牛、羊、猪、犬、鹿相对易感，骆驼也可感染。野生动物中，羚羊、麋鹿、驯鹿等也可感染。

　　5.1.4 潜伏期

　　一般为 14 d~180 d。

　　5.1.5 种间特性

　　5.1.5.1 牛布鲁氏菌病通常由牛种布鲁氏菌引起，也可因感染羊种布鲁氏菌引起，由猪种布鲁氏菌感染病例极少。

　　5.1.5.2 羊布鲁氏菌病(不包括绵羊附睾种布鲁氏菌感染)主要由羊种布鲁氏菌引起，也可由牛种布鲁氏菌引起，由猪种布鲁氏菌感染病例较少。

　　5.1.5.3 猪布鲁氏菌病主要由猪种布鲁氏菌 1、2 或 3 生物型引起，也有较少由牛种布鲁氏菌或羊种布鲁氏菌感染所引发的病例。

　　5.1.5.4 单峰驼、双峰驼(包括羊驼)、水牛、牦牛、鹿、羚羊等，可因接触感染布鲁氏菌的反刍动物感染牛种布鲁氏菌或羊种布鲁氏菌。

　　5.1.5.5 犬布鲁氏菌病通常由犬种布鲁氏菌引起，也可因接触感染布鲁氏菌的反刍动物感染牛种布鲁氏菌或羊种布鲁氏菌。

　　5.2 临床症状

　　5.2.1 通常，未成年动物和未妊娠动物感染布鲁氏菌不表现明显临床症状。

　　5.2.2 母畜头胎发病较多且症状明显，牛在怀孕后 5 个月~9 个月、羊在怀孕后 3 个月~4 个月流产，猪怀孕后任何阶段都可流产，以怀孕 50 d~110d 最常见。

　　5.2.3 在布鲁氏菌病长期流行地区，感染母畜可能不发生流产，主要表现为乳房炎、关节炎、局部脓肿、

　　GB/T 18646—2025

　　胎衣不下、久配不孕等临床症状。慢性感染的母畜以不孕为主要临床症状。

　　5.2.4 成年公畜感染后主要症状表现为睾丸炎和附睾炎，并可引起不育。

　　5.2.5 少数情况下，感染牛仅在腿部关节处出现水囊瘤，无其他可见症状，水囊瘤液中常含有布鲁氏菌。

　　5.2.6 猪感染后可出现关节炎及腱鞘肿胀、跛行，偶尔出现后躯麻痹的症状。公猪感染布鲁氏菌，通常一侧睾丸出现肿胀，进而硬化和萎缩，伴随着生殖器官损伤，影响性行为。部分公猪感染后生殖器官没有明显异常，性行为表现正常，但公猪的精液中含有布鲁氏菌。

　　5.2.7 其他家养、圈养及野生动物感染后临床症状与牛、绵羊或山羊症状相似，但一些野生反刍动物感染后会出现关节化脓或钙化、睾丸炎、色素膜炎和神经系统疾病。

　　5.3 病理变化

　　5.3.1 妊娠或流产母畜子宫内膜出现炎性浸润、充血、出血及坏死。

　　5.3.2 流产胎儿呈败血症病变，浆膜和黏膜有出血点和出血斑，皮下结缔组织发生浆液性、出血性炎症。

　　5.3.3 公畜睾丸、附睾或精囊有炎症、出血、坏死灶或化脓灶。

　　5.4 结果判定

　　成年动物出现上述临床症状(5 .2)和/或病理变化(5 .3)，可判定为疑似患布鲁氏菌病，应进一步开展实验室病原学和/或免疫学诊断。

　　6 样品采集、保存、运输及处理

　　6.1 仪器设备

　　6.1.1 器械：一次性无菌注射器(5 mL、10 mL)、解剖刀、剪子、镊子、移液器(200 μL、1 000 μL)、吸头(200 μL、1 000 μL)、离心机(离心力>2 000g)、组织匀浆器、样品保温箱、Ⅱ级生物安全柜等。

　　6.1.2 容器：血清采集管(不含抗凝剂)、全血采集管(含柠檬酸钠或 EDTA 抗凝剂)、带螺口的采样管(1 .5 mL、5 mL、15 mL、50 mL)、带螺口的密封组织样品盒(50 mL)等。

　　6.1.3 个人防护用品：手套、口罩、鞋套、防护服、护目镜等。

　　6.1.4 其他：封口膜、密封袋、冰袋等。

　　6.2 试剂材料

　　6.2.1 无菌 PBS(0 .1 mol/L，pH 7.2~7 .4)或 0.85% 生理盐水。

　　6.2.2 消毒剂：0 .2% 新洁尔灭或其他有效消毒剂。

　　6.3 样品采集

　　6.3.1 血清及全血

　　按 NY/T 541 的规定执行。

　　6.3.2 乳样

　　6.3.2.1 个体乳样：先将整个乳房清洗擦干，用适于黏膜的消毒剂(如聚维酮碘溶液)对乳头区消毒。采样时，挤弃前三把乳，之后每个乳头各采集 10 mL~20 mL，混合保存。采集不同动物样品时，应更换手套，避免交叉污染。

　　GB/T 18646—2025

　　6.3.2.2 大缸乳样：采集牛场当日奶厅大缸乳样，每缸采集 20 mL~40 mL 。

　　6.3.3 组织样

　　包括流产胎儿的胃内容物、肝、脾、肺，母畜的胎盘、胎衣，公畜的精囊、睾丸、附睾，屠宰后动物的子宫、乳房、淋巴结等。采集上述组织样品至少 20 g，将其置于样品盒中，拧紧密封。

　　6.3.4 拭子样

　　用棉拭子蘸取动物羊水、阴道分泌物、鼻腔黏液及粪尿等，置于含 1 mL~2 mL PBS 或生理盐水的离心管中(用于病原分离时，可用含 50% 甘油的 PBS 或生理盐水)，拧紧密封。

　　6.3.5 阴道分泌物、羊水、胃液、关节液、精液等液体样

　　6.3.5.1 阴道分泌物、羊水、胃液、关节液等液体样：用一次性注射器抽取 1 mL~2 mL，装入 5 mL 的无菌螺口离心管中，拧紧密封。

　　6.3.5.2 精液：可在冻精库随机抽取冻精样品;也可现场采集精液 1 mL~2 mL，装入 5 mL 的无菌螺口离心管中，拧紧密封。

　　6.4 样品运输和保存

　　6.4.1 采集后 12 h 内能够送达实验室的样本，可放在 4 ℃左右的容器中冷藏运输 ;不能在 12 h 运输到实验室的样本，应在-20 ℃以下冷冻后冷藏运输。

　　6.4.2 样品到达实验室后，应尽快处理 ;如不能立即进行处理和检测，应置-20 ℃以下冷冻保存 ;若需长期保存，应置-70 ℃超低温冰箱。

　　6.5 样品处理

　　6.5.1 血清样

　　恢复至室温待检。样品浑浊时，3 000g~5 000g 离心 10 min~15 min，将血清移至另一管中，沉淀弃去。

　　6.5.2 全血样

　　冷冻全血应解冻后使用，新鲜全血可直接检测。用于布鲁氏菌分离培养时，直接涂布于固体培养基上进行培养;用于布鲁氏菌 DNA 提取时，按细菌 DNA 提取试剂盒说明书进行。

　　6.5.3 乳样

　　6.5.3.1 用于抗体检测：冷冻后的样品应在解冻后使用，新鲜样品直接用于检测，按商品化试剂盒提供的方法处理。

　　6.5.3.2 用于病原学检测：样品应在 Ⅱ 级生物安全柜中处理。用于病原分离时，取 10 mL~15 mL 乳样置于 15 mL 离心管中，3 000g 离心 10 min，留取离心管上部奶油层和下部沉淀层。用于实时荧光 PCR或 RAA 检测时，取 200 μL 乳样至 1.5 mL 离心管，加入 1 mL PBS，混匀，12 000g 离心 5 min，弃上清液，用无菌棉签擦去残余乳脂，用 200 μL ddH2O 重悬沉淀。

　　6.5.4 组织样

　　样品应在Ⅱ级生物安全柜中处理。每份样品取约 5 g 组织，将其剪碎，加入研磨管中，再加入 10 mL无菌 PBS，旋紧研磨管，在研磨器上研磨 5 min~10 min，取上清液 200 μL 备用待检。

　　GB/T 18646—2025

　　6.5.5 拭子样

　　将拭子管中的拭子充分振荡后，在 Ⅱ级生物安全柜中取出，并弃于含消毒剂的容器中，留取管中液体 200 μL 备用待检。

　　6.5.6 阴道分泌物、羊水、胃液、关节液、精液等液体样

　　样品应在 Ⅱ 级生物安全柜中进行处理。阴道分泌物、羊水、胃液、关节液等液体样，取 200 μL 备用待检 ;精液样品，取 200 μL 精液加入 1 mL PBS，12 000g 离心 5 min，弃上层液体，用 200 μL 无菌 PBS重悬沉淀备用待检。

　　7 病原学诊断方法

　　7.1 改良萋⁃尼氏(Ziehl⁃Neelsen)抗酸染色

　　7.1.1 仪器设备

　　7.1.1.1 光学显微镜(100×油镜)。

　　7.1.1.2 酒精灯、载玻片。

　　7.1.2 试剂材料

　　7.1.2.1 碱性复红染色液：碱性复红乙醇饱和液 10 mL，加 5% 苯酚水溶液 90 mL，混合。

　　7.1.2.2 乙酸(0 .05%)。

　　7.1.2.3 亚甲蓝溶液：0 .1% 亚甲蓝水溶液。

　　7.1.2.4 二甲苯、乙醚、乙醇(体积分数 95%)。

　　7.1.3 样品

　　全血样、乳样、组织样、拭子样及液体样，按 6.5 进行处理。

　　7.1.4 试验程序

　　7.1.4.1 涂片

　　吸取处理后的样品，均匀涂布于玻片上。如待检样品为乳样，涂片后，应滴加二甲苯或乙醚，使其覆盖整个涂片，摇动 1 min~2 min 脱脂后弃去，再滴加乙醇(体积分数 95%)，以除去二甲苯，待乙醇挥发后即可染色。

　　7.1.4.2 染色

　　涂片经火焰固定后，滴加苯酚复红染色液，覆盖整个涂片，染色 15 min 后充分水洗，滴加乙酸(0 .05%)脱色 15 s，充分洗涤，滴加亚甲蓝溶液复染 2 min 。水洗，晾干，镜检。

　　7.1.5 结果判定

　　在光学显微镜下观察，背景为蓝色，出现长 0.6 µm~1 .5 µm、宽 0.5 µm~0 .7 µm 的红色球杆菌或短棒状杆菌，多为单个存在，有时成对或成团，可判定为疑似布鲁氏菌。

　　GB/T 18646—2025

　　7.2 布鲁氏菌分离与鉴定

　　7.2.1 仪器设备

　　7.2.1.1 Ⅱ级生物安全柜。

　　7.2.1.2 恒温培养箱(37 ℃)、CO2 培养箱(37 ℃)。

　　7.2.1.3 光学显微镜(100×油镜)。

　　7.2.1.4 冰箱(2 ℃~8 ℃ 、-20 ℃)。

　　7.2.1.5 无菌器具：接种环、棉拭子、涂布棒、玻璃试管、试管塞、滤纸条、培养皿。

　　7.2.1.6 微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL)及配套无菌枪头。

　　7.2.2 试剂材料

　　7.2.2.1 基础培养基，按附录 B 中 B .1 配制。

　　7.2.2.2 血清葡萄糖培养基，按 B .2 配制。

　　7.2.2.3 选择培养基，按 B .3 配制。

　　7.2.2.4 结晶紫储备液和工作液，按附录 C 中 C .1 配制。

　　7.2.2.5 氧化酶试验试剂，按 C .2 配制。

　　7.2.2.6 2% 尿素酶活性试验培养基，按 C .3 配制。

　　7.2.7.7 乙醇(体积分数 70%)、乙醇(体积分数 75%)、生理盐水、PBS(0 .1 mol/L，pH 7.4)乙酸铅试纸条。

　　7.2.2.8 布鲁氏菌 A 、M 和 R 表面抗原特异单价血清。

　　7.2.2.9 标准噬菌体液。

　　7.2.3 样品

　　全血样、乳样、组织样、拭子样及液体样，按 6.5 进行处理。

　　7.2.4 分离培养

　　7.2.4.1 涂布

　　取经过处理的样品 100 μL，涂布于选择培养基固体平板表面;对于乳样，用接种环分别取离心后的奶油层和沉淀层各 2 环，分别涂布于选择培养基固体平板表面。每份样品均涂布两个平板。

　　7.2.4.2 培养

　　将上述每份样品涂布的两个选择培养基固体平板分别置于普通培养箱和含 5%~10%(体积分数) CO2 培养箱中，37 ℃培养，观察 3 d~10 d。

　　7.2.5 菌落鉴定

　　7.2.5.1 菌落形态观察

　　布鲁氏菌菌落呈圆形，直径 1 mm~ 2 mm，边缘光滑。透射光下，菌落呈浅黄色有光泽，半透明。菌落微隆起，灰白色。随时间推移，菌落变大，颜色变暗。

　　7.2.5.2 光滑型/粗糙型菌落鉴定

　　用移液器吸取结晶紫稀释染液，浸没菌落 15 s~ 20 s，然后吸出染色液，弃至 0.2% 新洁尔灭消毒

　　GB/T 18646—2025

　　液中。光滑型菌落不着色，粗糙型菌落被染成紫色。

　　7.2.6 生化鉴定

　　7.2.6.1 对 CO2 需求试验

　　用菌悬液接种 4 支血清葡萄糖培养基斜面，2 支置于恒温培养箱，2 支置于 5%~10%(体积分数) CO2 培养箱，37 ℃培养 2 d~3 d，观察比较 4 支斜面生长情况。

　　7.2.6.2 产 H2S 试验

　　将乙酸铅试纸条放入接种细菌的斜面培养基管内，夹在管壁和塞子之间，且不和培养基接触。置于 37 ℃恒温培养箱培养，若有 H2S 产生，则试纸条顶端变黑。每天记录结果并更换试纸条，持续 4 d。

　　7.2.6.3 氧化酶试验

　　新鲜配制氧化酶试剂。取载玻片大小的滤纸条在氧化酶试剂中浸渍后置于平皿中备用。接种环蘸取新鲜培养物，涂在平皿中的滤纸条上，10 s 后观察颜色变化。涂抹处呈鲜红色或深红色，则表示氧化酶阳性。

　　7.2.6.4 脲酶试验

　　用接种环蘸取一环新鲜培养物，涂抹在含 2% 尿素的培养基上，分解脲的菌株可使培养基由黄色变成粉红色或紫色。通常情况下会很快出现反应，有些菌株反应较慢，可置室温保存 24 h，约 2 h~5h观察一次颜色变化。

　　7.2.6.5 对硫堇、复红染料的敏感性试验

　　用无菌棉拭子浸蘸菌悬液，在分别含硫堇、复红染料的培养基(染料质量浓度为 20 μg/mL)上划线，并置于 37 ℃恒温培养箱培养，3 d~4 d 后观察平皿菌落生长情况。每个平皿上的不同菌悬液划线不应交叉、接触。

　　7.2.6.6 特异性血清凝集试验

　　吸取 25 μL~30 μL 布鲁氏菌 A 、M 、R 表面抗原特异单价血清置于玻片上，取等量菌液加到血清样品旁，然后用混匀棒充分混匀血清和菌液，轻轻摇晃玻片，在自然光或强灯光下立即观察。粗糙型菌株与布鲁氏菌 R 抗原的单价血清产生凝集反应，光滑型菌株与 A 或 M 单价血清产生凝集反应。

　　7.2.6.7 噬菌体溶解试验

　　用无菌生理盐水将待检菌株制成 109 CFU/mL 悬液，涂布于干燥的琼脂平皿上，待表面无液体后，用直径为 2 mm 的接种环勾取标准噬菌体液加于平皿上，置 37 ℃恒温培养箱中培养，24 h 后初步观察结果，再放置室温下，经 24 h 后最后判定结果。细菌完全不生长，判为阳性(+);部分生长，判为可疑(±);细菌生长良好，判为阴性(—)。

　　7.2.6.8 结果判定

　　进行上述试验操作后，按附录 D，判定布鲁氏菌菌株的种和生物型。

　　7.3 实时荧光 PCR 方法

　　7.3.1 方法特性

　　实时荧光 PCR 方法可检测布鲁氏菌 DNA 片段，既可用于布鲁氏菌分离株的鉴定，也可用于临床

　　GB/T 18646—2025

　　样品检测。本文件列入了布鲁氏菌属、牛种、羊种、猪种(犬种)布鲁氏菌及 A19、S2 疫苗株与野毒株鉴别特异性引物序列和探针。根据免疫背景，可采用多种引物和探针联用的方式进行检测。

　　7.3.2 仪器设备

　　7.3.2.1 Ⅱ级生物安全柜。

　　7.3.2.2 干式加热器。

　　7.3.2.3 水浴锅。

　　7.3.2.4 荧光 PCR 扩增仪及配套 PCR 管。

　　7.3.2.5 台式高速冷冻离心机(离心力≥12 000g)。

　　7.3.2.6 冰箱(2 ℃~8 ℃ 、-20 ℃ , -80 ℃)。

　　7.3.2.7 微量移液器(量程 10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)及配套无菌枪头。

　　7.3.3 试剂材料

　　7.3.3.1 2× 荧光 PCR 预混液(2×Buffer，含 0.05 U/μL Taq 酶、0.4 mmol/L dNTPs 及 4 mmol/L 氯化镁)。

　　7.3.3.2 ddH2O 、PBS(0 .1 mol/L，pH 7.4)。

　　7.3.3.3 阳性对照，为参考菌株(牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌基因组以及 A19 和 S2 疫苗株等) DNA，可使用 102 CFU/mL~103 CFU/mL 的细菌 200 μL 提取细菌 DNA 。

　　7.3.3.4 阴性对照，为 ddH2O 。

　　7.3.3.5 细菌 DNA 提取试剂盒。

　　7.3.4 引物探针序列

　　按附录 E 中表 E .1。

　　7.3.5 菌株及样品灭活处理

　　7.3.5.1 疑似布鲁氏菌分离株

　　疑似布鲁氏菌分离株的灭活：在 BSL-3 实验室的生物安全柜内，用接种环从培养皿上挑取单个疑似菌落或多个经纯培养的疑似菌落，加入含 200 μL 的 PBS 或 ddH2O 的离心管中，重悬菌液，密封管盖，置于干式加热器，80 ℃灭活 2 h。

　　7.3.5.2 样品

　　全血样、乳样、组织样、拭子样及液体样，按 6.5 进行处理后，置于干式加热器或水浴锅，80 ℃灭活2 h。

　　7.3.6 菌株及样品 DNA 提取

　　可采用细菌 DNA 提取试剂盒，按说明书规定程序提取样品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法，步骤如下：

　　a) 取 200 μL 处理过的样品放入离心管，加入裂解液(10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl， 0.5% SDS，200 μg/mL 蛋白酶 K)200 μL，56 ℃ 消化 2 h，12 000g 离心 20 s，取上清液置于另一个管中，然后加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)混合物，上下颠倒 3 次~4 次，混匀;

　　b) 4 ℃ 7 000g 离心 10 min，移上层液相置于另一个管中，加入 2.5 倍体积预冷 70%(体积分数)

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　　乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12 000g 离心 10 min，弃去液相，加入 1 mL 70%(体积分数)乙醇漂洗，12 000g 离心 2 min~3 min，弃去液相，留取沉淀，真空或室温干燥，加入 20 μL ddH2O， -20 ℃保存备用。

　　7.3.7 反应体系

　　按表 1 配制反应体系，每次检测，应设阴性对照和阳性对照，采用商品化试剂盒时，按试剂盒提供的方法配制。

　　表 1 实时荧光 PCR 反应体系

　　试剂成分

　　储存液浓度

　　体积/μL

　　荧光 PCR 反应预混液

　　2×

　　10.0

　　上游引物

　　10 pmol/μL

　　0.4

　　下游引物

　　10 pmol/ μL

　　0.4

　　探针

　　10 pmol/μL

　　0.2

　　无核酸酶水

　　—

　　4.0

　　样品 DNA

　　—

　　5.0

　　总体积

　　—

　　20.0

　　7.3.8 反应条件

　　将 PCR 扩增管置入荧光 PCR 仪中。设定反应条件：第一步，95 ℃ 5 min;第二步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 25 s，40 个循环，在 60 ℃延伸结束时收集荧光信号。

　　7.3.9 试验成立条件

　　阳性对照 Ct 值 <26，并出现特异性扩增曲线 ;阴性对照无 Ct 值，且没有特异性扩增曲线，试验成立。

　　7.3.10 结果判定

　　满足 7.3.9 条件下：

　　a) 样品 Ct 值≤36，且出现特征性的扩增曲线，可判定为核酸阳性;

　　b) 样品无 Ct 值或者无特征性扩增曲线，可判定为核酸阴性;

　　c) 样品 Ct 值>36，且出现特征性的扩增曲线，应重新检测。重新检测时，模板量加倍，并做 3 个重复;复检后有 2 个以上重复反应 Ct 值≤38，则判为核酸阳性，否则判为阴性。

　　注：附录 E 表 E .1 的引物及探针序列，对应识别相应的布鲁氏菌属、种或疫苗株核酸检测结果。

　　7.4 荧光 RAA 方法

　　7.4.1 方法特性

　　RAA 是一种恒温核酸快速扩增方法，可快速得到结果，适用于牧场产地检疫等现场快速筛查检测，本文件给出的引物序列为布鲁氏菌属通用型。

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　　7.4.2 仪器设备

　　7.4.2.1 恒温荧光基因检测仪及配套反应管。

　　7.4.2.2 样品前处理系统。

　　7.4.2.3 其余器材同 7.3.2。

　　7.4.3 试剂材料

　　7.4.3.1 荧光基础反应单元(含重组酶、单链结合蛋白和 DNA 聚合酶的冻干粉)及配套缓冲液。

　　7.4.3.2 ddH2O 。

　　7.4.3.3 乙酸镁(140 mmol/L)。

　　7.4.3.4 阳性对照、阴性对照，同 7.3.3.3 和 7.3.3.4。

　　7.4.4 引物和探针

　　引物和探针序列按附录 E 中表 E .2。

　　7.4.5 样品、样品处理及细菌 DNA 提取同 7.3.5、7.3.6。

　　7.4.6 RAA 反应体系

　　7.4.6.1 按表 2 配制 RAA 反应混合液(40 μL)。

　　表 2 RAA 反应混合液

　　组分

　　体积/μL

　　缓冲液

　　25.0

　　ddH2O

　　10.2

　　BRU⁃F(10 pmol/μL)

　　2.1

　　BRU⁃R(10 pmol/μL)

　　2.1

　　BRU⁃P(10 pmol/μL)

　　0.6

　　总体积

　　40.0

　　7.4.6.2 将 40 μLRAA 反应混合液加入 RAA 荧光基础反应单元管中。

　　7.4.6.3 将 5 μL 乙酸镁(反应催化剂)加在反应单元管盖内侧。

　　7.4.6.4 向反应单元管中依次加入 5 μL 待测核酸，最后扣紧反应单元管盖。

　　7.4.7 反应程序

　　7.4.7.1 将反应单元管置于样品前处理系统中，39 ℃下按程序运行 4 min。

　　7.4.7.2 将反应单元管放入恒温核酸扩增检测仪，设置扩增温度为 39 ℃ , 扩增时间 30 min，每隔 20 s 收集荧光信号。

　　注：样品前处理系统和恒温核酸扩增检测仪提前 30 min 预热。

　　7.4.8 试验成立条件

　　同时满足以下条件，可判定试验成立，否则应重新试验：

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　　a) 阳性对照出现特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率 K≥20;

　　b) 阴性对照无特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率 K<20。

　　7.4.9 结果判定

　　在满足 7.4.8 的条件下，当样品扩增曲线的斜率 K≥20 时，可判为阳性;否则判为阴性。

　　7.5 多重 PCR 方法

　　7.5.1 方法特性

　　采用多对引物，用 PCR 方法扩增布鲁氏菌 DNA 片段，依据扩增片段的电泳图谱差异可判定布鲁氏菌的种，本文件推荐的引物不能区分猪种和犬种。本方法适合分离菌株的鉴定检测，对临床样品检测的敏感性较低。

　　7.5.2 仪器设备

　　7.5.2.1 恒温培养箱。

　　7.5.2.2 PCR 扩增仪及配套的 PCR 反应管。

　　7.5.2.3 电泳仪和电泳槽。

　　7.5.2.4 凝胶成像系统或紫外透射仪。

　　7.5.2.5 旋涡混匀器。

　　7.5.2.6 其余器材同 7.3.2。

　　7.5.3 试剂材料

　　7.5.3.1 Goldview 或其他等效核酸染料。

　　7.5.3.2 DNA marker(100 bp~2 000 bp)。

　　7.5.3.3 Tris-乙酸(TAE)电泳缓冲液及 1.5% 琼脂糖凝胶，按附录 F 中 F .1 和 F .2 配制。

　　7.5.3.4 PCR 预混液(2×)。

　　7.5.3.5 阳性对照、阴性对照，同 7.3.3.3 和 7.3.3.4。

　　7.5.4 引物

　　按表 E .3 。分别用无核酸酶水将引物稀释成 10 pmol/μL 。取等量 8 条引物混合，配制引物混合液。

　　7.5.5 样品及样品处理

　　7.5.5.1 样品：布鲁氏菌培养菌落。

　　7.5.5.2 样品处理，同 7.3.5、7.3.6。

　　7.5.6 PCR 反应体系

　　按表 3 配制反应体系，在 PCR 反应管中依次加入以下成分，充分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底，使用 PCR 反应混合液时，将试剂稀释至工作浓度。

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　　表 3 多重 PCR 反应体系配制

　　组分

　　体积/μL

　　8 条引物混合液

　　8.0

　　2×PCR 预混液

　　15.0

　　无菌水

　　6.0

　　样品 DNA

　　1.0

　　总体积

　　30.0

　　7.5.7 PCR 反应条件

　　95 ℃ 预变性 5 min;然后 95 ℃ 变性 35 s，64 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，进行 30 个循环 ;最后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

　　7.5.8 电泳

　　用 1×TAE 电泳缓冲液配制 1.5% 琼脂糖凝胶，按每 100 mL 凝胶溶液加入 10 μL 的比例加入核酸染料，倒凝胶平板 ;取 PCR 产物 5 μL 与 1 μL 溴酚蓝缓冲液混合，加样 ;加 DNA marker 作为分子质量对照。5 V/cm~8 V/cm 电泳 1 h，置凝胶成像系统或紫外透射仪上观察，拍照记录检测结果。

　　7.5.9 试验成立条件

　　阴性对照无特异性扩增产物，阳性对照有与分子质量相符的特异性扩增产物，试验成立。

　　7.5.10 结果判定

　　按 F .3 的判定标准，待检验样品出现种特异扩增条带，则判定为相应的布鲁氏菌种：

　　a) 扩增结果出现 1 682 bp 和 587 bp 两条电泳带时，判为牛种布鲁氏菌;

　　b) 扩增结果出现 1 682 bp、1 071 bp 和 587 bp 三条电泳带时，判为羊种布鲁氏菌;

　　c) 扩增结果出现 1 682 bp、1 071 bp、587 bp 和 272 bp 四条电泳带时，判为猪种或犬种布鲁氏菌;

　　d) 扩增结果出现 1 682 bp 一条电泳带时，判为 A19 疫苗株;

　　e) 扩增结果出现 1 071 bp 和 587 bp 两条电泳带时，判为绵羊附睾种布鲁氏菌。

　　8 免疫学诊断方法

　　8.1 标准血清

　　8.1.1 布鲁氏菌 WOAH 国际标准血清是所有其他标准血清(如国家标准血清、工作标准血清)进行比较和标准化的依据。依据 WOAH 国际标准血清可建立国家标准血清或可溯源至上述血清的工作标准血清，国际和国家标准血清可用于对布鲁氏菌病的抗体检测方法进行标准化。

　　8.1.2 虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)和全乳环状试验(MRT)中所使用的抗原，可按 WOAH 国际标准血清(WOAHISS)或能溯源至 WOAHISS 的国家标准血清进行标准化。WOAHISS 来源于牛，含有 1 000 IU(SAT)和 1 000 ICFTU(国际补体结合试验单位)。

　　8.1.3 检测牛血清的 iELISA 、cELISA 和荧光偏振试验(FPA)，可使用国际标准血清中强阳性标准血清(WOAHELISASP SS)、弱阳性标准血清(WOAHELISAWP SS)和阴性标准血清(WOAHELISAN SS)，

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　　或可追溯至这 3 种标准血清的国家标准血清进行标准化。

　　8.1.4 检测绵羊和山羊血清的 iELISA 、cELISA 和荧光偏振试验(FPA)，可使用国际标准血清(IS⁃ aBmS)或可追溯至 ISaBmS 的国家标准血清进行标准化。

　　8.1.5 检测猪血清的 iELISA 、cELISA 和荧光偏振试验(FPA)，目前还没有国际标准血清可用于标准化，但可用欧盟的标准血清或国家相关机构研制的标准血清对这 3 种方法进行标准化。

　　8.2 虎红平板凝集试验( RBT)

　　8.2.1 方法特性

　　RBT 是目前国内外应用最广泛的布鲁氏菌病抗体检测筛选方法之一，该方法经济、简单快速、易操作，可人工判读，也可通过与人工判读比对等效的仪器判读。

　　8.2.2 抗原标准化

　　WOAHISS 或国家标准血清稀释，与抗原进行 RBT 试验。标准血清 1∶45 稀释应观察到凝集，呈阳性反应，标准血清 1∶55 稀释时观察不到凝集，呈阴性反应。

　　8.2.3 仪器设备

　　8.2.3.1 微量移液器(100 μL)。

　　8.2.3.2 灭菌移液器枪头(200 μL)。

　　8.2.3.3 混匀棒、计时器。

　　8.2.3.4 反应板(玻璃板、白色陶瓷砖或搪瓷板)。

　　8.2.4 试剂材料

　　8.2.4.1 布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原。

　　8.2.4.2 布鲁氏菌阳性对照血清和阴性对照血清。

　　8.2.5 样品

　　牛、羊、鹿、骆驼、马等动物血清。

　　8.2.6 试验程序

　　8.2.6.1 在每次开始检测样品前，应用阳性对照血清和阴性对照血清分别与抗原进行反应，以确保试验条件适于检测。

　　8.2.6.2 将待检血清和抗原从冰箱取出，平衡至室温(22 ℃±4 ℃)。

　　8.2.6.3 轻轻混匀待检血清，每份样品吸取 30 μL，加到反应板上。

　　8.2.6.4 轻轻混匀抗原，在每份血清旁滴加 30 μL 等量抗原。

　　8.2.6.5 立即将血清与抗原混合(每个样品用一个干净的混匀棒)，混合成直径约 2 cm 的圆形或椭圆形。

　　8.2.6.6 双手端起反应板，按不同方向轻轻摇晃反应板，室温(22 ℃±4 ℃)下作用 4 min 后，在自然光或强灯光下立即观察凝集情况。

　　注：检测山羊和绵羊血清时，待检血清与抗原的比例调整为 3∶1(如，75 μL 血清∶25 μL 抗原)能提高其检测灵敏性。

　　8.2.7 凝集判定标准

　　凝集反应程度分为 5 个等级：

　　GB/T 18646—2025

　　a) ++++：出现大的凝集片或颗粒，凝集块间液体完全清亮透明;

　　b) +++：有明显凝集颗粒，凝集块间液体几乎清亮透明;

　　c) ++：有较明显凝集颗粒，凝集块间液体稍清亮透明;

　　d) +：有微弱凝集，凝集物间液体浑浊;

　　e) -：无凝集，反应混合液均匀浑浊。

　　8.2.8 试验成立条件

　　同时满足下列条件，判定试验条件成立：

　　a) 阳性对照血清出现“ ++ ”及以上凝集现象;

　　b) 阴性对照血清无凝集“ -”。

　　8.2.9 结果判定

　　符合 8.2.8 的条件，结果判定如下：

　　a) 待检血清出现“ + ”及以上凝集现象时，判定为阳性;

　　b) 待检血清出现“ - ”时，判定为阴性。

　　8.3 试管凝集试验(SAT)

　　8.3.1 方法特性

　　SAT 可在玻璃试管中或 96 孔板上进行。由于 SAT 较低的敏感性，不推荐用于非免疫畜群个体动物的筛查和确诊，不适用于粗糙型布鲁氏菌感染的检测。结果可人工判读，也可通过与人工判读比对等效的仪器判读。

　　8.3.2 抗原标准化

　　用 WOAHISS 或国家标准血清进行多个稀释度的 SAT 试验，标准血清 1 ∶1 000 稀释，凝集程度应为 50%(++)。

　　8.3.3 样品

　　牛、羊、猪、鹿、骆驼、马、犬等动物血清。

　　8.3.4 常量法

　　8.3.4.1 仪器设备

　　8.3.4.1.1 恒温培养箱。

　　8.3.4.1.2 振荡器。

　　8.3.4.1.3 比浊仪。

　　8.3.4.1.4 移液器(1 000 μL)和配套无菌吸头、玻璃试管及试管架。

　　8.3.4.2 试剂材料

　　8.3.4.2.1 布鲁氏菌试管凝集试验抗原。

　　8.3.4.2.2 布鲁氏菌阳性对照血清和阴性对照血清。

　　8.3.4.2.3 含 0.5% 苯酚的生理盐水，按附录 G 中 G .1 配制，用于牛(马、猪、鹿、骆驼、犬)血清的稀释和抗原的稀释。

　　GB/T 18646—2025

　　8.3.4.2.4 含 0.5% 苯酚的 10% 氯化钠溶液，按 G .2 配制，用于羊血清的稀释。

　　8.3.4.2.5 参照比浊管，按 G .3 配制。

　　8.3.4.3 血清稀释

　　8.3.4.3.1 牛(马、鹿、骆驼)血清稀释

　　每份血清用 4 支试管，第 1 管加 960 μL 稀释液(含 0.5% 苯酚的生理盐水)，第 2 管~第 4 管各加入 500 μL 稀释液，然后取待检血清 40 μL，加入第 1 管内，并混合均匀;取 500 μL 混合液加入第 2 管并充分混匀，如此倍比稀释至第 4 管;从第 4 管取混匀液 500 μL 弃去。

　　注：稀释完毕，血清从第 1 管至第 4 管的血清稀释度分别为 1∶25、1∶50、1∶100 和1 ∶200。

　　8.3.4.3.2 羊(猪、犬)血清稀释

　　每份血清用 4 支试管 ;第 1 管加 920 μL 稀释液(含 0.5% 苯酚的 10% 氯化钠溶液);第 2 管~ 第4 管各加入 500 μL 稀释液 ;然后取待检血清 80 μL，加入第 1 管内，并混合均匀 ;取 500 μL 混合液加入第 2 管并充分混匀，如此倍比稀释至第 4 管;从第 4 管取混匀液 500 μL 弃去。

　　注：稀释完毕，血清从第 1 管至第 4 管的血清稀释度分别为 1∶12 .5、1∶25、1∶50 和1 ∶100。

　　8.3.4.4 抗原稀释

　　用含 0.5% 苯酚的生理盐水稀释抗原到工作抗原。

　　8.3.4.5 加入工作抗原

　　分别取 500 μL 稀释好的工作抗原，加入上述各孔已稀释好的血清中，并振荡混匀。

　　注：牛(马、鹿、骆驼)的血清稀释度则依次变为 1∶50、1∶100、1∶200 和 1∶400;羊(猪、犬)的血清稀释度则依次变为1∶25、1∶50、1∶100 和 1 ∶200。

　　8.3.4.6 孵育

　　完成上述加样后，将试管放置恒温恒湿培养箱，37 ℃孵育 18 h~24h。

　　8.3.4.7 结果观察

　　取出试管，与制备的比浊管进行比较，观察并记录结果。

　　8.3.4.8 设置对照

　　每次试验时均应设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照。阴性血清对照和阳性血清对照的稀释与待检血清来源的动物种相同;抗原对照稀释到规定容量，取 500 μL，再加 500 μL 稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

　　8.3.4.9 凝集判定标准

　　凝集反应程度分为 5 个等级(参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读)：

　　a) ++++：菌体完全凝集和沉淀，液体 100% 清亮;

　　b) +++：菌体几乎完全凝集和沉淀，液体 75% 清亮;

　　c) ++：菌体有显著凝集和沉淀，液体 50% 清亮;

　　d) +：有清楚可见的凝集和沉淀，液体 25% 清亮;

　　e) -：无凝集和沉淀，液体均匀浑浊。

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　　8.3.4.10 试验成立条件

　　同时满足下列条件，判定试验条件成立：

　　a) 阳性对照血清出现完全凝集“ ++++”;

　　b) 阴性对照血清无凝集“ -”;

　　c) 抗原对照无自凝“ -”。

　　8.3.4.11 结果判定

　　符合 8.3.4.9 的条件下，对试验结果作出阳性、可疑、阴性的判定。

　　a) 阳性结果：

　　——牛、马、鹿、骆驼血清 1∶100 稀释，出现“ ++ ”及以上凝集;

　　——猪、山羊、绵羊、犬血清 1∶50 稀释，出现“ ++ ”及以上凝集。

　　b) 可疑结果：

　　——牛、马、鹿、骆驼血清 1∶50 稀释，出现“ ++ ”以上凝集;

　　——猪、山羊、绵羊、犬血清 1∶25 稀释，出现“ ++ ”以上凝集。

　　对试验结果为“可疑 ”的动物，应于 3 周~4 周后重新采血检验，若为可疑，判为阳性。

　　c) 阴性结果：

　　待检血清出现“ -”，即不出现任何凝集，判定为阴性。

　　8.3.5 微量法

　　8.3.5.1 仪器设备

　　8.3.5.1.1 恒温培养箱。

　　8.3.5.1.2 振荡器。

　　8.3.5.1.3 微量移液器(20 μL~200 μL)及配套吸头、96 孔 U 形反应板。

　　8.3.5.1.4 薄膜、湿盒(带盖子长方形容器，底部铺一层湿纱布或湿水纸)。

　　8.3.5.2 试剂材料同 8.3.4.2。

　　8.3.5.3 血清稀释

　　8.3.5.3.1 牛(马、鹿、骆驼)血清稀释

　　每份血清用 4 个连续的 U 形孔;在反应板的第 1 孔加 192 μL 稀释液(含 0.5% 苯酚的生理盐水);第 2 孔~第 4 孔各加入 100 μL 稀释液;用微量移液器取待检血清 8 μL，加入第 1 孔，并混匀;从第 1 孔吸取 100 μL 混合液加入第 2 孔充分混匀，如此倍比稀释至第 4 孔，从第 4 孔弃去混合液 100 μL 。

　　注：稀释完毕，血清从第 1 孔至第 4 孔的血清稀释度分别为 1∶25、1∶50、1∶100 和1 ∶200。

　　8.3.5.3.2 羊(猪、犬)血清稀释

　　每份血清用 4 个连续的 U 形孔，在反应板的第 1 孔加 184 μL 稀释液(含 0.5% 苯酚的 10% 氯化钠溶液)，第 2 孔~ 第 4 孔各加入 100 μL 稀释液 ;用微量移液器取待检血清 16 μL，加入第 1 孔，并混匀 ;从第 1 孔吸取 100 μL 混合液加入第 2 孔充分混匀，如此倍比稀释至第 4 孔，从第 4 孔弃去混合液100 μL 。

　　注：稀释完毕，血清从第 1 孔至第 4 孔的血清稀释度分别为 1∶12 .5、1∶25、1∶50 和1 ∶100。

　　GB/T 18646—2025

　　8.3.5.4 抗原稀释

　　用含 0.5% 苯酚的生理盐水稀释液稀释成工作抗原。

　　8.3.5.5 加入工作抗原

　　分别取 100 μL 稀释好的工作抗原，加入上述各孔稀释好的血清中，并振荡混匀。

　　注：牛血清稀释度则依次变为 1∶50、1∶100、1∶200 和 1∶400;羊血清稀释度则依次变为 1∶25、1∶50、1∶100 和 1 ∶200。

　　8.3.5.6 孵育

　　完成上述加样后，用薄膜将反应板严密封盖后，放入湿盒，并置恒温培养箱，37 ℃孵育 18 h~24h。

　　8.3.5.7 结果观察

　　取出反应板，观察并记录结果。

　　8.3.5.8 设置对照

　　每次试验时均应设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照。阴性血清对照和阳性血清对照的稀释与待检血清相同;抗原对照按说明书稀释到规定容量，取 500 μL，再加 500 μL 稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

　　8.3.5.9 凝集判定标准

　　凝集反应程度分为 5 个等级：

　　a) ++++：菌体完全凝集，1 孔~4 孔凝集物呈伞状均匀铺于孔;

　　b) +++ ：菌体几乎完全凝集，1 孔 ~3 孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，第 4 孔孔底呈现白色点状;

　　c) ++：菌体凝集显著，1 孔~2 孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3 孔~4 孔孔底呈现白色点状;

　　d) +：凝集物有沉淀，第 1 孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2 孔~4 孔孔底呈现白色点状;

　　e) -：无凝集，1 孔~4 孔孔底均呈现白色点状。

　　8.3.5.10 试验成立条件

　　同时满足下列条件，判定试验条件成立：

　　a) 阳性对照血清出现完全凝集“ ++++”;

　　b) 阴性对照血清无凝集“ -”;

　　c) 抗原对照无自凝“ -”。

　　8.3.5.11 结果判定

　　符合试验成立的条件下，结果判定如下：

　　a) 待检血清出现“ ++ ”及以上凝集现象时，判定为阳性;

　　b) 待检血清出现“ + ”凝集现象时，判定为可疑;

　　c) 待检血清出现“ - ”时，判定为阴性。

　　对试验结果为“可疑 ”的动物，应于 3 周~4 周后重新采血检验，若为可疑，判为阳性。

　　8.4 补体结合试验(CFT)

　　8.4.1 方法特性

　　CFT 特异性高，但灵敏性低于 RBT 、ELISA 和 FPA 。CFT 操作相对复杂，应有良好的实验设施

　　GB/T 18646—2025

　　和训练有素的人员操作。孵育血清抗原和补体时，热结合(37 ℃ , 30 min)和冷结合(2 ℃ ~8 ℃ , 14 h~ 18 h)均可。热结合出现前带现象的频率和强度增加，易产生假阴性。血清学初筛方法确认抗体滴度高的样品，建议采用冷结合方式。

　　8.4.2 抗原标准化方法

　　8.4.2.1 WOAHISS 或国家标准阳性血清在 1/200 稀释度时发生 50% 补体结合反应，并在较低血清稀释度下(<200 倍稀释)发生 100% 补体结合反应。

　　8.4.2.2 CFT 抗原作 1/10 稀释时，37 ℃±2 ℃孵育 18 h 后，为外观均一、稠密的白色悬液，无可见凝集或沉积，试验中不产生抗补体效应。

　　8.4.3 常量法

　　8.4.3.1 仪器设备

　　8.4.3.1.1 水浴锅(温控范围为 37 ℃~38 ℃和 54 ℃~64 ℃)。

　　8.4.3.1.2 移液器和灭菌移液器吸头。

　　8.4.3.1.3 内口径 1 cm 玻璃试管。

　　8.4.3.1.4 试管架。

　　8.4.3.1.5 稀释用器皿。

　　8.4.3.2 试剂材料

　　8.4.3.2.1 稀释液：巴比妥缓冲液(1×)或不含巴比妥缓冲液，按附录 H 中 H .1 配制。

　　8.4.3.2.2 绵羊红细胞悬液，除使用商品化绵羊红细胞外，也可按 H .2 制备。

　　8.4.3.2.3 布鲁氏菌阳性对照血清和阴性对照血清。

　　8.4.3.2.4 溶血素，在有效期内根据说明书标示效价使用。如需进行效价测定，按 H .3 进行。

　　8.4.3.2.5 补体，每次补体结合试验时，应于当日测定补体效价。优先使用商品化冻干补体，也可使用新鲜豚鼠血清作为补体。补体制备及效价测定方法按 H .4 进行。

　　8.4.3.2.6 抗原，在有效期内根据说明书标示效价进行使用，如需进行效价测定，按 H .5 进行。

　　8.4.3.2.7 溶血标准比色管，按 H .6 制备。

　　8.4.3.3 样品

　　牛、羊、猪、鹿、骆驼、马等动物血清，待检血清的稀释和灭活按 H .7。

　　8.4.3.4 试验程序

　　每次试验应设阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、溶血素对照和补体对照。试验各要素添加量和顺序见表 4，具体步骤如下。

　　a) 将灭活后的待检血清作 1∶10 稀释，分别加入 2 支玻璃试管内，每管 500 μL 。

　　b) 其中一管加工作浓度抗原 500 μL，另一管加稀释液 500 μL 。

　　c) 上述两管均加工作浓度补体，每管 500 μL，振荡混匀。

　　d) 置 37 ℃水浴 20 min，取出，放于室温(22 ℃±4 ℃)环境中。每管各加 2 单位的溶血素 500 μL和 2.5% 红细胞悬液 500 μL 。充分振荡混匀。

　　e) 置 37 ℃水浴 20 min，取出，立即进行第一次判定。

　　GB/T 18646—2025

　　表 4 常量法补体结合试验程序

　　各要素加入顺序

　　试验各要素加入量/μL

　　待检血清管

　　对照管

　　阳性血清

　　阴性血清

　　抗原

　　溶血素

　　补体

　　稀释灭活血清

　　500

　　稀释液

　　500

　　1 500

　　抗原

　　500

　　1 000

　　工作量补体

　　500

　　37 ℃~38 ℃水浴 20 min

　　2 单位溶血素

　　500

　　2.5% 红细胞

　　500

　　37 ℃~38 ℃水浴 20 min

　　结果示例

　　溶血程度

　　+++

　　溶血抑制

　　+++

　　阴/阳性和成立情况

　　阳性

　　阴性

　　成立

　　8.4.3.5 试验成立条件

　　同时满足下列条件，判定试验成立。

　　a) 第一次判定，不加抗原的阳性血清对照管、不加或加抗原的阴性血清对照管、抗原对照管呈完全溶血反应。

　　b) 第一次判定静置 12 h 后，作第二次判定。第二次判定时，溶血素对照管、补体对照管应呈完全抑制溶血反应，即 100% 不发生溶血。

　　8.4.3.6 结果判定

　　在试验成立条件下，对待检血清进行判定。将加抗原的待检血清管与参照标准比色管(见 H .6.1)进行比色，记录结果。牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同，判定标准如下：

　　a) 溶血抑制程度<50% ，判为阳性;

　　b) 溶血抑制程度 50%~<100% ，判为可疑;

　　c) 溶血抑制程度为 100% ，判为阴性。

　　8.4.4 微量法

　　8.4.4.1 仪器设备

　　8.4.4.1.1 水浴锅(温控范围为 37 ℃~38 ℃和 54 ℃~64 ℃)。

　　8.4.4.1.2 移液器(100 μL、200 μL)和配套灭菌移液器吸头。

　　GB/T 18646—2025

　　8.4.4.1.3 96 孔 U 形聚苯乙烯板。

　　8.4.4.1.4 稀释用器皿。

　　8.4.4.2 试剂材料同 8.4.3.2。

　　8.4.4.3 样品

　　牛、羊、猪、鹿、骆驼、马等动物血清，待检血清的稀释和灭活按 H .7。

　　8.4.4.4 试验程序

　　每次试验应设阳性血清、阴性血清、抗原、致敏红细胞和补体对照。补体结合试验各要素添加量和顺序见表 5，具体操作按以下试验程序。

　　a) 血清样品稀释，96 孔板第 1、2 排作为血清抗补体对照，血清稀释度为 1/2、1/4;从第 3 排到第8 排血清样品稀释度分别为 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，按如下步骤操作：

　　1) 第 1 排每孔分别加 50 μL 稀释液，第 2、4、5、6、7、8 排每孔分别加稀释液 25 μL;

　　2) 第 1 排每孔加 50 μL 灭能血清，混匀后吸取 25 μL 加入其后的第 2 排孔，混匀后弃去 25 μL;

　　3) 从第 1 排孔混匀液体中先后各吸取 25 μL 分别加入同列的第 3 排、第 4 排孔，混匀;

　　4) 从第 4 排起倍比稀释，即从第 4 排孔吸取液体 25 μL 到同列第 5 排孔，混匀，以此类推到第 8 排 ;

　　5) 第 8 排孔吸取 25 μL 液体弃去。

　　b) 加抗原，除第 1 排、第 2 排外，上述每孔分别加工作量抗原 25 μL 。

　　c) 加补体，上述每孔分别加工作浓度补体 25 μL，轻轻混匀，置 4 ℃孵育过夜或 37 ℃孵育 30 min。

　　d) 制备致敏红细胞，将 2.5% 红细胞及溶血素等体积混匀至室温 20 min。

　　e) 孵育，将孵育过夜的 96 孔板从冰箱取出置 37 ℃孵育 10 min。

　　f) 加致敏红细胞，上述每孔加入 50 μL 致敏红细胞，轻轻混匀，37 ℃孵育 30 min。

　　g ) 在室温条件下 1 000g 离心 5 min~10 min，或者在 2 ℃~8 ℃放置 2 h~3 h 让

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