T/ZNZ 338-2025 动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性评价技术规范

ICS 11.080.99 CCS B45

T/ZNZ

浙江 省农 产品 质量 安全 学会 团体 标准

T /ZNZ 338—2025

动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性评价

技术规范

Technical code for chlorinated disinfectant resistance assessment of

animal-related original Enterobacteria

2025-05-30 发布 2025-06-30 实施

浙江省农产品 质量 安全 学会发 布

T/ZNZ 338—2025

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。

本文件起草单位：浙江省农业科学院、中国计量大学、四川农业大学、浙江大学、浙江国伟科技有限公司。

本文件主要起草人： 肖兴宁、汪雯、邹立扣、杨华、赵珂、丁甜、肖英平、吕文涛、黄学涛。

I

动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性评价技术规范

1 范围

本文件规定了动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性的评价方法。

本文件适用于动物源及环境中肠杆菌科细菌的含氯消毒剂抗性检测。第一法为肉汤稀释法，适用于次氯酸钠等热稳定性较差(<35℃) 的含氯消毒剂;第二法为琼脂稀释法，适用于苯扎氯铵等热稳定性较强(≥35℃) 的含氯消毒剂。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注明日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB 4789.28 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

GB 19489 实验室生物安全通用要求

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

参考敏感株 reference sensitive strain

对抗生素、消毒剂等具有已知敏感性的标准生物菌株。

第一法肉汤稀释法

4 试剂与材料

4.1 参考敏感菌株

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，ATCC 25922)，在-70 ℃以下保存，传代不应超过 5 次。

4.2 灭菌水

实验用水里对于消毒剂工作液配置应符合 GB/T 6682 的规定，121℃灭菌 15 min;用于培养基配置

应符合 GB 4789.28，121℃灭菌 15 min。

4.3 0.85%灭菌生理盐水

称取0.85 g氯化钠溶于100 mL灭菌水中，121℃灭菌15 min。

1

4.4 培养基

4.4.1 MHB 肉汤(Mueller-Hinton broth)的制备见附录 A. 1。

4.4.2 TSA 胰酪胨大豆琼脂(Tryptone Soy agar)的制备见附录 A.2。

4.4.3 MHA 琼脂(Mueller-Hinton agar)的制备见附录 A.3。

4.5 含氯消毒剂工作液

含氯消毒剂工作液应现配现用。使用灭菌水将消毒剂原液稀释成一系列浓度梯度备用。消毒剂测试浓度宜选取参考敏感菌株 1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，常见含氯消毒剂的参考敏感菌株MIC 值见附录 B。

5 仪器与设备

开展细菌抗性评价的微生物实验室应符合GB 19489生物安全二级实验室(BSL-2)要求，除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

5.1 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL;0.5 μL～10 μL;10 μL～100 μL;100 μL～1 000 μL。

5.2 多通道微量加样器：1 μL～100 μL。

5.3 麦氏比浊管或浊度仪：麦氏浊度0.01～4.00。

5.4 通风橱。

5.5 酶标仪。

5.6 涡旋震荡仪。

5.7 恒温水浴锅：46℃。

5.8 恒温培养箱：37℃。

6 评价方法

6.1 接种物制备

无菌操作将测试菌株以及参考敏感菌株在TSA平板上划线，36℃培养16 h-18 h，用无菌棉签蘸取3个-5个单菌落，在含有3 mL生理盐水的灭菌离心管中充分漩涡震荡，用浊度仪或标准比浊管调整菌液浓度至0.5麦氏单位，再使用MHB将菌悬液稀释100倍后混匀备用。调制好浓度的菌液应在15 min内完成加样。

6.2 接种

室温条件下，在96孔酶标板中加入50 μL含不同浓度消毒剂工作液;

按照由低到高的消毒剂浓度依次接种50 μL稀释后的菌悬浮液;

使用酶标板一次性封口膜将其密封，在36℃下培养18 h，试验应同时设置阳性对照(接种50 μL 参考敏感菌悬液和50 μL空白MHB)和阴性对照(直接接种100 μL空白MHB)，每个样品设置3个重复。

2

7 结果判定

利用酶标仪进行细菌浓度检测，以 96 孔板中未检测到测试株可见生长(OD600<0. 1)的最低消毒剂浓度作为 MIC 值;若测试株 MIC 值大于参考敏感株 MIC 值，则判断菌株具有抗性，反之为敏感。

第二法琼脂平板法

8 评价方法

8.1 接种物制备

同6.1。

8.2 琼脂平板制备

灭菌后的 MHA 培养基放置于恒温水浴箱降温至 46℃, 每瓶培养基加入 1/9 体积不同浓度含氯消毒剂工作液，充分混匀后倾倒入直径为 90 mm 无菌平皿，每个浓度做 3 个平行。

8.3 接种

室温条件下，用移液枪将配置好的菌液接种到含不同浓度消毒剂的琼脂平板表面，每个样点的接种量为 5 μL，室温下静置 10 min，转移至 37℃恒温培养箱孵育约 18 h。以未添加消毒剂的琼脂平板作为阳性对照。

9 结果判定

通过肉眼判断琼脂平板上是否有菌落长出，以抑制细菌生长的最低消毒剂浓度为测试株的 MIC 值。若测试株 MIC 值大于参考敏感株 MIC 值，则判断菌株具有抗性，反之为敏感。

3

附录 A

(资料性)

培养基

A.1 Mueller-H inton Broth肉汤(MHB)

A.1.1 成分

MHB肉汤成分见表A. 1。

表 A.1 MHB 成分

组分

用量

牛肉浸出粉，g

2.0

酸水解酪蛋白，g

17.5

可溶性淀粉，g

1.5

蒸馏水，mL

1000.0

A.1.2 制备

称取各成分加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH 至7. 1 ± 0.2，121 ℃高压灭菌15 min。

A.2 胰酪胨大豆琼脂(TSA Agar)

TSA琼脂成分见表A.2。

A.2.1 成分

表 A.2 TSA 成分

胰酪蛋白胨，g

17.0

植物蛋白胨，g

5.0

氯化钠，g

琼脂，g

15.0

A.2.2 制备

除琼脂外，称取各成分加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH 至7. 1±0.2，再加入琼脂，121 ℃高压灭

菌15 min，倾注平板。

A.3 Mueller-Hinton 琼脂(MHA)

A.3.1 成分

4

MHA琼脂成分见表A.3。

表 A.3 MHA 成分

A.3.2 制备

除琼脂外，称取各成分加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH至7.1±0.2，再加入琼脂，121 ℃高压灭菌

15 min，倾注平板。

5

附录 B

细菌消毒剂抗性

常见含氯消毒剂的参考敏感菌株MIC值见表B.1。

表 B.1 常见含氯消毒剂的参考敏感菌株 MIC 值

消毒剂

菌株

MIC值(mg/L)

次氯酸钠

大肠杆菌ATCC 10536

128

苯扎氯铵

32

二氯异氰尿酸钠

沙门氏菌CVCC 1806

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