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T/CVDA 51-2025 改善宠物骨密度产品有效性评价技术标准

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资料介绍

ICS 11 220 B41

团体标准

T/CVDA 51—2025

改善宠物骨密度产品有效性评价技术标准

Technical standards for evaluating the effectiveness of pet bone density improvement

products

2025-6-24 发布 2025-6-24 实施

中国兽药协会发布

T/CVDA 51-2025

前言 2

1 范围 3

2 规范性引用文件 3

3 术语和定义 3

3.1 宠物 3

3.2 骨密度 4

3.3 骨代谢 4

3.4 骨钙 4

3.5 钙吸收率 4

4 通用要求 4

4.1 受试样品及处理要求 4

4.2 受试实验动物、饲养环境及饲料要求 4

4.3 试食试验及宠物要求 5

5 实验设计 5

5.1 以补钙为主的受试样品 5

5.2 不以补钙为主或不含钙的受试样品 6

5.3 宠物试食实验设计 6

6 实验方法 6

6.1 补钙为主的受试样品 6

6.2 不含钙或不以补钙为主的受试样品 7

6.3 宠物试食试验测定指标 9

7 数据处理与结果判定 9

7.1 数据处理 9

7.2 结果判定 9

8 实验报告 10

参考文献 11

前言

本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国兽药协会提出并归口管理。

本文件起草单位：上海宠幸宠物用品有限公司、卫仕营养科学研究院(江苏)有限公司、中国食品发酵工业研究院、江苏大学、芜湖卫仕生物科技有限公司、东西志览国际文化发展无锡有限公司。

本文件主要起草人：李云亮、段玉清、罗安来、王允中、马海乐、刘淑琴、严子华、宋亮亮。

1 范围

本标准规定改善宠物骨密度产品的术语和定义，并规范改善宠物骨密度产品有效性评价技术标准，包括通用要求、实验设计、实验方法、数据处理与结果判定、实验报告。

本标准适用于声称具有改善宠物骨密度的饲料(宠物食品)、保健产品、宠物零食、饲料原料及添加剂等的有效性评价。

本标准适用于以宠物犬、猫为主的伴侣动物。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;未注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB14925 实验动物环境及设施

GB19489 实验室生物安全通用要求

GB/T 27476.1 检测实验室安全第 1 部分:总则

GB/T 29252 实验室仪器和设备质量检验规则

GB/T 31190 实验室废弃化学品收集技术规范

GB/T 35507 生化用试剂测定通则

GB/T 35823 实验动物动物实验通用要求

GB/T 35892 实验动物福利伦理审查指南

RB/T 199 实验室设备生物安全性能评价技术规范

SN/T 3509 实验室样品管理指南

SN/T 3592 实验室化学药品和样品废弃物处理的标准指南

SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求

GB 16740 保健(功能)食品通用标准

GB 26687 食品安全国家标准复配食品添加剂通则

GB 28050 食品安全国家标准预包装食品营养标签通则

保健食品功能检验与评价技术指导原则(2023 年版)

保健食品功能检验与评价方法(2023 年版)

GB 10648-2013/XG1-2020 《饲料标签》国家标准第 1 号修改单

GB 13078-2017 饲料卫生标准

GB/T 18823 饲料检测结果判定的允许误差

DB21/T 2356-2014 饲料和饲料添加剂使用监督规范

《宠物饲料标签规定》，农业农村部第 20 号公告《宠物饲料管理办法》

《饲料添加剂安全使用规范》，中华人民共和国农业部公告第 1224 号

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 宠物 pet

家庭豢养并宠爱的动物。本标准主要指作为伴侣动物的犬和猫。

3.2 骨密度 bone mineral densi

指单位体积内骨骼中骨矿物质含量，以克/每立方厘米表示。

3.3 骨代谢 bone metabolism

旧骨质被吸收，新骨质形成，使骨组织不断得到更新转换，并与细胞外液不断进行钙、磷交换的过程。可以维持骨的坚韧性和弹性，并保持血液中钙离子浓度的稳定性。

3.4 骨钙 bone calcium

指骨中钙含量。

3.5 钙吸收率 dissolved hair ball products指机体对摄入钙质的吸收程度。

4 通用要求

4.1 受试样品及处理要求

4.1.1 受试样品要求

4.1.1.1 应提供受试样品的名称、性状、规格、批号、生产日期、保质期、保存条件、申请单位名称、生产企业名称、配方、生产工艺、质量标准、营养功能以及推荐摄入量等信息。

4.1.1.2 受试样品应是规格化的定型产品，即符合既定的配方、生产工艺及质量标准。

4.1.1.3 应提供受试样品的主要成分、功效成分/标志性成分及可能的有害成分的分析报告。

4.1.1.4 申请产品审定或登记的受试物，应与拟上市的产品完全一致。

4.1.2 需前处理的受试样品

4.1.2.1 推荐用量较大的受试样品。超过实验动物的灌胃量、掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品中的非功效成分的含量，对某些推荐用量极大(如饮料等)的受试样品，还可去除部分无安全问题的功效成分(如糖等)，以满足功能评价的需要。以非定型产品进行试验时，应当说明理由，并提供受试样品处理过程的详细说明和相应的证明文件，处理过程应与原产品的主要生产工艺步骤保持一致。

4.1.2.2 需要浓缩的液体受试样品。应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择 60～70 ℃减压或常压蒸发浓缩、冷冻干燥等进行浓缩。样品的浓缩倍数依具体实验要求而定。

4.1.2.3 冲泡形式饮用的受试样品(如袋泡剂)。可使用其水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取条件：常压，温度80～90 ℃,时间 30～60 min，水量为受试样品体积的 10 倍以上，提取 2 次，将其合并后浓缩至所需浓度，并标明该浓缩液与原料的比例关系。

4.2 受试实验动物、饲养环境及饲料要求

4.2.1 实验动物要求

根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠，推荐使用近交系动物。动物的性

别、周龄依实验需要进行选择。实验动物的数量要求为小鼠每组 10～15 只(单一性别)，大鼠每组8~ 12 只(单一性别)。

4.2.2 饲养环境和饲料

动物及其实验环境应符合国家对实验动物及其实验环境的有关规定。应提供饲料生产商等相关资料。如为定制饲料，应提供基础饲料配方、配制方法，并提供动物饲料检验报告。

4.3 试食试验及宠物要求

4.3.1 基本要求

根据受试样品所需判定功能的要求选择适用的试验宠物。试食宠物应该按照品种或遗传背景相同、年龄、体重相近、骨密度程度一致性原则。试验前对试验宠物进行常规的免疫、驱虫处理。在受试宠物身上采集各种生物样本应详细记录采集样本的种类、数量、次数、采集方法和采集日期。受试宠物应当符合纳入标准和排除标准要求，以排除可能干扰试验目的的各种因素。

4.3.1.1 原则上受试样品已经通过动物实验证实，确定其具有改善骨密度的作用。

4.3.1.2 原则上宠物试食试验应在动物功能学实验有效的前提下进行。

4.3.1.3 宠物试食试验受试样品必需经过动物毒理学安全性评价，并确认为安全的食品。

4.3.1.4 根据试食试验设计要求、受试样品的性质、期限等，选择一定数量的受试宠物。试食试验报告中试食组和对照组的有效例数不少于 25 只，且试验的脱离率一般不得超过 20%。

4.3.1.5 开始试食前要根据受试样品性质，估计试食后可能产生的反应，并提出相应的处理措施。

4.3.2 纳入标准

受试对象为低骨密度宠物，其中犬的骨密度低于1.1 g/cm3，猫的骨密度低于1.0 g/cm3。

4.3.3 排除标准

合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病者;短期内服用与受试功能有关的物品，影响结果判断者;未能按标准服用受试样品，资料不全影响功效判断者。

5 实验设计

有助于改善骨密度作用检验方法根据受试样品作用原理的不同，分为补钙为主的受试样品、不含钙或不以补钙为主的受试样品两种。根据受试样品作用原理的不同，任选其一进行动物实验。所列指标均为必做项目。使用未批准用于食品的钙的化合物，除必做项目外，还必须进行钙吸收率的测定;使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源(如可食动物的骨、奶等)，可以不进行钙的吸收率实验。

5.1 以补钙为主的受试样品

机体中的钙绝大部分储存于骨骼及牙齿中，大/小鼠若摄入钙量不足会影响机体和骨骼的生长发育，表现为体重、身长、骨长、骨重、骨钙含量及骨密度低于摄食足量钙的正常大/小鼠。生长期大/小鼠在摄食低钙饲料的基础上分别补充碳酸钙(对照组)或受试含钙样品(实验组)，比较两者在促进机体及骨骼的生长发育，增加骨矿物质含量和增加骨密度功能上的作用，从而对受试样品有助于改善骨密度的功能进行评价。

该部分以断乳大/小鼠为受试实验动物，通过基础饲料添加受试样品的方式，给予时间一般不少于

2～3 个月。检测骨钙含量或骨密度、钙吸收率，并与低钙对照组和碳酸钙对照组相比较，判定受试样品是否具有改善骨密度的作用。

5.2 不以补钙为主或不含钙的受试样品

雌性成年大鼠切除卵巢后，骨代谢增强，并发生骨重吸收(破骨)作用大于骨生成(成骨)作用的变化。这种变化表现为骨量丢失，经过一定时间的积累，可以造成骨密度降低模型。在建立模型的同时或模型建立之后给模型实验组大鼠补充受试样品，通过受试物抑制破骨或促进成骨等骨代谢调节作用，观察其在增加骨密度功能及骨钙含量的效果，从而对受试样品有助于改善骨密度的功能进行评价。

5.3 宠物试食试验设计

5.3.1 试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。按受试宠物的骨密度水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如品种、性别、年龄、饮食等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试宠物不少于 25 只。

5.3.2 受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法、服用量服用受试样品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。受试样品给予时间 30 天，必要时可延长至 120 天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

6 实验方法

6.1 补钙为主的受试样品

6.1.1 实验动物及饲料配方

6.1.1.1 实验动物出生 4 周左右的断乳大鼠，体重约 60～75 克，同一性别，每组 8～12 只。

6.1.1.2 基础饲料用表 1 基础饲料配制低钙对照组以及各剂量组。

表 1 基础饲料配方(Ca2+计，调整 Ca2+为 150mg/100g 饲料)

成分

酪蛋白

10.0

黄豆粉

15.0

小麦面粉

54.0

玉米油或花生油

4.0

纤维素

2.0

混合盐 a

2.6

混合维生素 b

1.0

氯化胆碱

0.2

DL-蛋氨酸

淀粉 c

11.0

注：配制饲料需高压处理后用。a.混合盐：每 kg 混合盐中各组份含量：KH2PO4，501.4g;NaCl，74.0g;MgCO3，50.2g;乳酸亚铁，5.4g;乳酸锌，4.16g;MnCO3，3.5g;CuSO4 ·5H2O，0.605g;Na2SeO3，6.6mg;KI，7.76mg;Cr3Cl·6H2O，0.292g;加蔗糖到 1kg。b.混合维生素：每 kg 混合维生素中各组份含量：维生素 A，400,000IU;维生素 D3，100,000IU;维

生素 E，500IU;维生素 K，5mg;维生素 B1，600mg;维生素 B2，600mg;维生素 B6，700mg;维生素 B12，1mg;尼克酸，3g;叶酸，200mg;泛酸钙，1.6g;生物素，20mg;加蔗糖到 1kg。c.可根据各组待测受试物(或碳酸钙)的需用量调节淀粉用量。

6.1.2 动物分组及受试样品给予

出生 4 周的断乳大鼠经适应期一周后，禁食 12 小时，称体重，按体重随机分组，分笼饲养。饮用去离子水以避免从饮水中获得钙。实验设三个剂量组，其中一个剂量应相当于宠物犬猫推荐摄入量(折算为每公斤体重的剂量)的 2.5 倍(大鼠)或 5 倍(小鼠)，且最高剂量不得超过犬、猫推荐摄入量的10 倍(特殊情况除外)，另设二个剂量组;同时设一个低钙对照组(150 mg/100 g 饲料)和与相应剂量受试物钙水平相同的碳酸钙对照组(如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙水平相同的碳酸钙对照组)。用低钙对照组(150 mg/100 g 饲料)饲料配制受试样品各剂量组和碳酸钙对照组。经口灌胃给予受试物，无法灌胃时将受试物掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。受试样品给予时间 3个月。

6.1.3 分析测试指标和方法

6.1.3.1 体重测定，测定前禁食 12 小时，每周一次。

6.1.3.2 股骨重量测定，动物喂养 3 个月后处死，剥离出右侧股骨，于 105℃烘箱中干燥至恒重，称量骨干重。

6.1.3.3 股骨骨密度测定，骨密度是衡量骨骼强度的一个重要指标，一般是以每单位体积的矿物质的质量数为主要单位。采用骨密度仪(双能 X 线骨密度仪、或单光子骨密度仪或超声骨密度仪)测量股骨中点及股骨远心端(关节凹槽最下缘处)的骨密度。①股骨中点测量点的确定：测量股骨全长，通过其中点，沿横截面方向画一直线，此为股骨中点测量点(截面)。②股骨远心端测量点的确定：于股骨远心端，通过此点，画一与上述股骨中点处标记平行的直线，此为股骨远心端测量点(截面)。③将待测骨放置于测量台上与骨密度仪探测头移动方向垂直;移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量，每点应重复测定两次(误差小于 10 %)。将两次结果取平均值。

骨密度(BMD)=骨矿物质含量(BMC)/骨宽(BW)

6.1.3.4 骨钙含量及饲料含钙量测定，采用原子吸收法测量。①样品采集与制备。饲料样品经均匀混合并过 20 目筛，在烘箱中烘干，置干燥器中冷却后称重，磨细。注意防止在样品制备过程中的污染;

②骨钙样品前处理，取大鼠一侧股骨在 105 ℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中进行消化。③样品消化后钙的含量测定，准确称取 0.30-1.00 g，置于 150mL 三角瓶中，上盖小漏斗，加入混合酸(硝酸:高氯酸体积比=4:1)15-20 mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加入少量混合酸。消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过 1mL。消化样品时应同时作空白试验，加入与样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。

④测定，按照原子吸收分光光度计仪器说明书的步骤进行。测定液、标准溶液和空白均用 0.5 %氧化镧溶液稀释，定容。

6.2 不含钙或不以补钙为主的受试样品

6.2.1 实验动物和饲料配方

Wistar 或 SD 雌性大鼠，300±20 g，实验前适应 1 周。参照 AIN93 饲料配方配制半成品饲料，用适当的物质替换饲料中来源于大豆的成分，以避免大豆异黄酮等植物雌激素对实验结果的干扰。参考配方见下表 2。

表 2 参考饲料配方

含量(%)

DL-蛋氨酸

0.3

玉米淀粉

蔗糖

纤维

米油

混合矿物盐 a

3.5

二酒石酸胆碱

注：a.含有(mg/kg 饲料)： MnSO4 110，CuSO4 0.8，FeSO4 1.2，KI 18.0，ZnSO4 2960，CaHPO4 2890，MgSO4 1.25×104。

b.含有(/kg 饲料)： VitA 1.4×104IU，VitD 1500 IU，VitE 120mg，VitK 3mg，VitB1 12mg，VitB2 20mg，VitB6 12mg， VitB12 0.03mg，烟酸 60mg，泛酸 24mg，叶酸 6mg，生物素 0.54mg。

6.2.2 大鼠骨密度降低模型

采用卵巢切除术造骨密度降低模型。具体步骤如下：大鼠经腹腔注射 30 mg/kg BW 的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹位固定后于腹中线距阴道口 3～4 cm 处去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约 2-3 cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢。分离脂肪团，便可见到粉红色或黄红色的卵巢，以止血钳夹住卵巢，然后将卵巢下输卵管(包括脂肪)用丝线结扎，剪除卵巢(检查是否完全剪除)，顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另侧卵巢。腹肌和皮肤分层缝合后，再次消毒。最后经后肢肌肉注射 2 万 U 青霉素。也可经背部肋脊角切口行卵巢切除术。为保证手术成功，大鼠摘除卵巢后 5 天，进行阴道涂片检查(用滴管吸取少量生理盐水，轻轻插入阴道 1～2 cm，冲洗数次后吸出，涂于玻片上，镜下观察)，每天一次，连续 7 天，以检查大鼠卵巢是否完全摘除;如涂片呈动情反应(镜下见大量半透明、扁平的表皮细胞)，表明动物卵巢切除不完全，应弃去不用。

6.2.3 动物分组及受试样品给予

6.2.3.1 动物分组，大鼠经适应性饲养后分组，实验动物按体重随机分组为假手术组、切除卵巢组+溶剂组、切除卵巢+低、中和高剂量受试样品组。必要时设切除卵巢+阳性对照组(具雌激素活性的物质)。每组动物 8～12 只。

6.2.3.2 受试样品剂量分组及给予时间，如果受试物为不含钙产品，实验设三个剂量组和一个阴性对照组，其中一个剂量应相当于宠物犬猫推荐摄入量(折算为每公斤体重的剂量)的 2.5 倍(大鼠)或 5倍(小鼠)，且最高剂量不得超过犬、猫推荐摄入量的 10 倍(特殊情况除外)，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。如果受试物是不以补钙为主(可少量含钙)的产品，在根据成人每公斤人体推荐量设置三个剂量受试物组的基础上，可再设与相应受试物钙水平相似的碳酸钙对照组。(如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙相同的碳酸钙对照组)各组动物手术后 3～5 天开始灌胃给予受试物或溶剂，无法灌胃时将受试物掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。要考虑饲料中是否存在大豆异黄酮对结果的影响。受试物给予时间 3 个月。

6.2.4 分析测试指标和方法

6.2.4.1 体重，方法同 6.1.3.1

6.2.4.2 骨钙测定方法同 6.1.3.4。

6.2.4.3 骨密度测定方法同 6.1.3.3。

6.3 宠物试食试验测定指标

根据受试样品的性质和改善骨密度作用确定观察的指标，应包括一般指标和功效性指标。

6.3.1 一般指标

6.3.1.1 一般状况，包括精神、睡眠、饮食、大小便等。

6.3.1.2 血、尿、便常规检查

6.3.1.3 肝、肾功能常规检查

6.3.1.4 常规的血液学指标包括血红蛋白、红细胞和白细胞计数，必要时做白细胞分类。

6.3.1.5 常规生化指标包括转氨酶、血清总蛋白、白蛋白，尿素、肌酐、血脂和血糖等。

6.3.2 功效性指标

6.3.2.1 体重。

6.3.2.2 骨钙含量钙含量通常是指宠物体钙含量。一般有两种检查方法，常见的一种方法是血钙检查，通过抽静脉血检测血液中的血钙含量。第二种方法是骨钙检查，通过骨密度测量的方法检查骨骼中的骨钙含量。①血钙检查：静脉抽血测血钙含量，这种检测的方法在临床上使用较多，可以通过血液中的血钙含量来判断是否有骨质疏松、血钙过高或过低的情况。需要注意的是，宠物在抽血的前一天应避免食用过于油腻和高蛋白的食物，以免干扰结果。②骨钙检查：如果患者发现血钙异常，还要测定骨钙的含量。可以通过骨密度测量了解骨钙密度，从而判断骨钙含量是否正常。需要注意的是骨密度检查存在一定的辐射，短时间内不宜反复检查，孕期宠物也需要避免此项检查，防止辐射对胎儿的发育造成影响。

6.3.2.3 骨密度采用骨密度仪(双能 X 线骨密度仪、或单光子骨密度仪或超声骨密度仪)测量股骨中点及股骨远心端的骨密度。

7 数据处理与结果判定

7.1 数据处理

所有实验数据均应使用国家法定剂量单位。使用数理统计软件进行统计分析，计算总实验重复数内的平均值，所有数据以平均值±标准方差表示。一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算 F 值。若 F 值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性;若 F 值≥F0.05(即 p ≤0.05)，结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析;若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。

7.2 结果判定

7.2.1 以补钙为主产品

骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定该受试样品具有改善动物骨密度的作用。

7.2.2 不含钙的产品

骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加，且差异有显著性，可判定该受试样品具有有助于改善骨密度的作用。

7.2.3 不以补钙为主(可少量含钙)的产品

骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加，差异有显著性，且不低于相应剂量的碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定该受试样品具有有助于改善骨密度的作用。

8 实验报告

实验报告应提供试验获得的所有内容、数据及可视化信息。未纳入统计分析的数据或由于数据缺乏、丢失等无法评价的情况也应报告，并说明在各组别中的平均值及误差。所有试验样品必须留样保存，宠物饲料(食品)留样量≥500 g，液体样品留样量≥50 mL。

实验报告正文至少应包括：

a. 实验名称;

b. 实验目的;

c. 实验材料，至少包括实验用品、受试样品及处理方法、受试动物(包括宠物)要求;

d. 实验方法，测试指标和方法;

e. 结果与分析，根据数据统计结果给出平均值和标准方差、误差值及决定系数，并以可视化的数据或图和表形式体现;

f. 结论，针对受试样品的实验结果给出判定;

此外，试验过程中涉及的所有原始数据和相关可视化图表均要存档。

参考文献