DB63/T 2538-2026 普氏原羚个体识别分子技术规程
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资料介绍
ICS 65.020.99 CCS B 65
DB63
青海 省地 方标 准
DB63/T 2538—2026
普氏原羚个体识别分子技术规程
2026-05-07 发布 2026-07-01 实施
青海省市场监督管理局发 布
DB63/T 2538—2026
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由青海省林业和草原标准化技术委员会提出。
本文件由青海省林业和草原局归口。
本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省国家公园科研监测评估中心。
本文件主要起草人：蔡振媛、张同作、高红梅、宋晓英、丁旭洁、严琳、欧智布、胡天石、宋鹏飞、姚占山、江峰、顾海峰、李斌、梁程博、张萌、郭凡、陈晓苑、王佳能。
本文件由青海省林业和草原局监督实施。
II
DB63/T 2538—2026
普氏原羚个体识别分子技术规程
1 范围
本文件规定了普氏原羚个体识别分子技术的术语和定义、缩略语、主要仪器设备及试剂、溶液配方、操作程序等技术要求。
本文件适用于普氏原羚个体识别。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 43650 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程
SF/T 0134 法医学生物检材核酸提取技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
DNA 样品
利用普氏原羚带毛囊的毛发、皮张、血液、肌肉等组织或新鲜粪便等样本提取的基因组DNA样品。 3.2
微卫星标记
普氏原羚的多个特定的基本重复单元为4碱基的微卫星序列，其多态性用于普氏原羚个体识别。
3. 3
微卫星基因分型
对DNA样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用毛细管电泳技术测定生物样本基因型。
3. 4
个体识别
采用微卫星标记技术，对同一时间或不同时间，某一区域或多个区域的两个或多个DNA样品是否来源于同一个体进行判定。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside Triphosphates)
DTT：二硫苏糖醇(Dithiothreitol)
EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid)
1
DB63/T 2538—2026
OD：光密度(Optical Density)
PBS：磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline)
PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
SDS：十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate)
Taq酶：耐热DNA聚合酶(Taq-DNA Polymerase)
TE：含乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-EDTA Buffer Solution)
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)
5 主要仪器设备及试剂
主要仪器设备及试剂见附录A，除非另有说明，所用试剂均为分析纯。超纯水和纯水满足GB/T 6682要求。
6 溶液配方
见附录B。
7 操作程序
7.1 取样与储存
取样与储存样本按照GB/T 43650执行。
7.2 DNA 样品提取与检测
根据检测样本类型，基因组DNA提取按照SF/T 0134执行或选择对应的商用试剂盒。使用微量分光光度计对每个DNA样品进行质量检测，OD260/OD280值在1.7～2.1之间，且浓度>2.0 ng/μL的DNA样品判定为合格。
7.3 DNA 样品保存
一个月内使用的DNA样品保存于4℃冰箱，长期保存的DNA样品保存于-80℃超低温冰箱。
7.4 微卫星标记
宜选取附录C中PR-6、PR- 14、PR-25、PR-30、PR-40、PR-65和PR-71等7个，或者任意9个微卫星标记进行普氏原羚个体识别。
7.5 微卫星标记 PCR
7.5.1 微卫星标记引物合成与荧光标记
根据附录C的微卫星标记的引物序列合成引物，并对正向引物的5’端进行荧光标记。操作过程应避光。
7.5.2 PCR 体系
选用PCR Taq酶进行微卫星扩增，反应体系见附录D，表D.1。
2
DB63/T 2538—2026
7.5.3 PCR 程序
DNA样品的微卫星位点扩增在PCR仪上进行，PCR程序为：95℃预变性5min;94℃变性30 s，最适退火温度退火30 s，72℃延伸30 s，设置10个循环反应;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，设置35个循环反应;72℃修复延伸8 min。
7.5.4 PCR 最适退火温度
12对微卫星引物最适退火温度见附录D，表D.2。
7.6 PCR 产物检测
PCR扩增完成后，用1.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳方法见附录E。电泳条带清晰、长度与附录C相符，且无其他条带，则扩增成功;将扩增成功的PCR产物避光存放于4℃冰箱，用于后续毛细管电泳检测，进行基因分型。
7.7 微卫星基因分型
7.7.1 毛细管电泳检测
符合微卫星基因分型要求的PCR产物进行毛细管电泳检测，获取微卫星扩增长度检测数值，四舍五入取整得到微卫星扩增长度数值。
7.7.2 电泳结果人工校对
获取的微卫星长度数值减去附录C参考长度最小值的差除以4进行人工校正：
a) 余数为 0，该微卫星长度为有效基因型;
b) 余数为 1，该微卫星长度数值减 1 后为有效基因型;
c) 余数为 2，重新进行微卫星标记 PCR 和微卫星基因分型;
d) 余数为 3，该微卫星长度数值加 1 后为有效基因型。
8 个体识别
对微卫星位点的分型数据进行个体识别判定：
a) 当两个或两个以上的检测样品微卫星标记分型结果一致时，判定来自同一个体;
b) 当两个样品的微卫星标记分型结果中只有 1 个基因型差异时，判定来自同一个体;
c) 当两个样品的微卫星标记分型结果中有 2 个及以上基因型结果不同时，判定来自不同个体。
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DB63/T 2538—2026
附录 A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
A.1 主要仪器设备
冷冻研磨机、-20 ℃冰箱、-80 ℃超低温冰箱、高压灭菌锅、超纯水仪、电子天平、水浴锅、移液器、涡旋振荡器、磁力搅拌器、低温高速离心机、微量分光光度计、PCR扩增仪、微波炉、电泳仪、水平电泳系统、凝胶成像系统、毛细管电泳系统。
A.2 主要试剂
Chelex- 100溶液、蛋白酶K、DTT、SDS、细胞裂解缓冲液(含有螯合剂EDTA)、TNE缓冲液、TES裂解液、0.5 mol/L EDTA(pH10.0)、无水乙醇、75%乙醇、次氯酸钠、苯酚、氯仿、异戊醇、TE缓冲液、3 mol/L NaCl溶液、吸附液、硅珠悬液(富含二氧化硅微粒)、漂洗液、SE缓冲液、5 mol/L NaCl溶液、异丙醇、50×TAE缓冲液、琼脂糖(纯度100%)、6×电泳上样缓冲液(含有溴酚蓝)、核酸染料、Taq酶、dNTP、50 bp～500 bp DNA marker、PBS缓冲液。
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附录 B
(资料性)
溶液配方
B.1 细胞裂解缓冲液
0.64 mol/L蔗糖，0.01 mol/L MgCl2，0.02 mol/L Tris-HCl(pH7.6)，2% TritonX- 100。
B.2 TE 缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。
B.3 TNE 缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5 mmol/L EDTA(pH8.0)，100 mol/L NaCl。
B.4 TES 裂解液
10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA(pH8.0)，0. 1% SDS。
B.5 吸附液
12 g GuSCN，10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH6.4)，0.8 mL 0.5 mol/L EDTA，0.5 mL Triton X- 100。
B.6 漂洗液
12 g GuSCN，10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH6.4)。
B.7 SE 缓冲液
25 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl。
B.8 50×TAE 缓冲液
Tris碱242 g和冰醋酸57.1mL，用纯水定容到1 L。
B.9 6×电泳上样缓冲液
EDTA 8.7672 g，二甲苯腈蓝FF 0.5 g，溴酚蓝0.5 g，甘油360 ml，调节pH至7.0，磁力搅拌溶解后，纯水定容至1 L。
B.10 PBS 缓冲液
8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4溶于800 mL纯水中，1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)定容至1 L。
5
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附录 C
(规范性)
普氏原羚个体识别微卫星标记信息表
普氏原羚个体识别微卫星标记信息表见表C.1。
表C.1 普氏原羚个体识别微卫星标记信息表
序号
标记/引物名称
引物序列5’-3’
核心序列
参考长度(bp)
1
PR-6
正向引物：AGCTAGACCCTAAATCCTTGTGT
(ATAG)n
212～248
反向引物：ACTCCTCTCACGTCTTCAGC
2
PR-8
正向引物：ACTTGGGGAAATCTCAAAAGTCT
(AAAG)n
160～212
反向引物：GGCAAAAGCCTTAGAGAAATGC
3
PR- 14
正向引物：AGATGAACTGCTCTGGGAAG
(TATG)n
172～232
反向引物：AATGGGAAAGTATGAAAGGCA
4
PR-25
正向引物：CCAAGAGTGAAGTTGTGCCA
(AGGA)n
162～210
反向引物：AACCAAGTGCTCTGTTTCAG
5
PR-30
正向引物：ATTCTCTCGGGCCATCTGTG
(ATAG)n
164～248
反向引物：CACTGCTGGAATGGTCAAGG
6
PR-40
正向引物：CCGTTCTCCAGGGGAATCTT
(AGAT)n
174～226
反向引物：TTCACAGGGCCTTCAGAAAC
7
PR-46
正向引物：CTCTGTCCTCCGCTGTCTC
(TAGA)n
174～258
反向引物：CAAATTGCCTTGTCCCTGCC
8
PR-53
正向引物：TCCCTGATCTGTAACAAATGTG
(AGGA)n
164～188
反向引物：CCTTAGCGTCACACACACAG
9
PR-58
正向引物：CAGAGTCGGTCATGATGGGA
(AGGA)n
187～231
反向引物：TGCTTCCGACCAAGTGTTTG
10
PR-65
正向引物：GGCAAGTGAGGTGATGAAGC
(AAAG)n
146～226
反向引物：TGGCCTTCTAGAGTTGTTTTGC
11
PR-71
正向引物：TTTGCTGCCTCGACAAACAG
(TCCA)n
186～254
反向引物：TCCCGCATTACAAGCAGATTC
12
PR-85
正向引物：GTTCCAAGCTAAGCATTTAAGGC
(ATAG)n
224～256
反向引物：GGGAACACATGTACACCCGT
6
附录 D
(规范性)
PCR 反应
D.1 PCR 体系
12个微卫星标记PCR体系见表D.1。
表D.1 12 个微卫星标记 PCR 体系(20 μL)
序号
试剂
浓度
用量(μL)
1
DNA样品
2 ng/μL～50 ng/μL
2
2
正向引物
10 μmol/L
1.0
3
反向引物
10 μmol/L
1.0
4
dNTPs
10 mmol/L(各2.5 mmol/L)
2.0
5
PCR缓冲液(含MgCl2)
10×
2.0
6
Taq酶
5 U/μL
0.2
7
超纯水
-
11.3
D.2 12 对微卫星引物 PCR 最适退火温度
12对微卫星引物PCR最适退火温度见表D.2。
表D.2 12 对微卫星引物 PCR 最适退火温度
序号
引物名称
最适退火温度(℃)
1
PR-6
60
2
PR-8
60
3
PR- 14
60
4
PR-25
63
5
PR-30
60
6
PR-40
60
7
PR-46
60
8
PR-53
57
9
PR-58
60
10
PR-65
60
11
PR-71
60
12
PR-85
60
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DB63/T 2538—2026
附录 E
(资料性)
琼脂糖凝胶电泳检测方法
E.1 配制 1.8%的琼脂糖凝胶
取50×TAE缓冲液20 mL，加纯水至1000 mL，配制成1×TAE电泳缓冲液，待用。取1.8 g琼脂糖，置于200 mL锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至完全融化，加入10 μL Genefinder核酸染料混匀，冷却至60℃左右，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳，将琼脂糖凝胶和胶板置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，使用液面高于胶面。
E.2 加样
取5 μL PCR产物，加1 μL 6×电泳上样缓冲液并混匀，然后依次将50 bp～500 bp DNA marker、待检PCR产物上样到点样孔中。
E.3 电泳
接通电泳仪电源，电泳电压为130 V，当电泳上样缓冲液中的溴酚蓝条带迁移至凝胶1/2的位置，关闭电源，停止电泳。
E.4 观察结果
取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪成像拍照、保存。
8
