资料介绍
中华人民共和国国家计量技术规范
JJF2302—2025
时间分辨荧光免疫分析仪校准规范
Calibration Specification forTime-resolvedFluorescence
2025-09-08发布 2026-03-08实施
国家 市场 监督 管理 总局 发布
时间分辨荧光免疫分析仪
校准规范
Calibration Specification forTime-
以以以以以以以以以以以以以
归口 单位 : 全国生物计量技术委员会
主要起草单位 : 广东省计量科学研究院
中国计量科学研究院
参加起草单位 : 珀金埃尔默医学诊断产品 (上海) 有限公司
广州市达瑞生物技术股份有限公司
广州万孚生物技术有限公司
本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释
本规范主要起草人 :
周瑾艳 (广东省计量科学研究院)
黄彦捷 (广东省计量科学研究院)
武利庆 (中国计量科学研究院)
参加起草人 :
王晶 (中国计量科学研究院)
黄哲锋 [珀金埃尔默医学诊断产品 (上海) 有限公司]李志雄 (广州市达瑞生物技术股份有限公司)
孙雅玲 (广州万孚生物技术有限公司)
引言
JJF1071—2010《国家计量校准规范编写规则》、JJF1001—2011《通用计量术语及定义》、JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》、JJF 1094—2002《测量仪器特性评定》, 共同构成支撑本校准规范制定工作的基础性系列规范。
本规范结合时间分辨荧光免疫分析仪的计量和检测性能 , 并参考有关标准制定。
— 时间分辨荧光免疫分析仪检测限、线性、重复性、分析项目浓度重复性参考了YY/T 1533—2017《全自动时间分辨荧光免疫分析仪》、YY/T 1304.1—2015《时间分辨荧光免疫检测系统第 1部分 : 半自动时间分辨荧光免疫分析仪》 的要求。
— 时间分辨荧 光免 疫分 析仪 温度 示值 误差 和波 动度 参考 了 YY/T 1533—2017 《全自动时间分辨荧光免疫分析仪》 和 JJF 1101—2019《环境试验设备温度、湿度参数校准规范》 的要求。
— 时间分辨荧光免疫分析仪分析项目浓度示值误差参考了 YY/T 1304.2—2015 《时间分辨荧光免疫检测系统第 2部分 : 时间分辨荧光免疫分析定量测定试剂 (盒)》和 JJF 1752—2019《全自动封闭型发光免疫分析仪校准规范》 的要求。
本规范为首次发布。
1 范围
本规范适用于基于时间分辨荧光原理的全自动和半自动时间分辨荧光免疫分析仪的校准。
2 引用文件
本规范引用下列文件 :
JJF 1752—2019 全自动封闭型发光免疫分析仪校准规范
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
YY/T 1304.1—2015 时间分辨荧光免疫检测系统第 1部分 : 半自动时间分辨荧光免疫分析仪
YY/T 1304.2—2015 时间分辨荧光免疫检测系统第 2部分 : 时间分辨荧光免疫分析定量测定试剂 (盒)
YY/T 1533—2017 全自动时间分辨荧光免疫分析仪
凡是注日期的引用文件 , 仅注日期的版本适用于本规范 ; 凡是不注日期的引用文件 , 其最新版本 (包括所有修改单) , 适用于本规范。
3 术语
3.1 时间分辨荧光技术 time-resolved fluorescence (TRF) technique
利用镧 系元 素的 荧光 寿命 长的 特点 , 可适 当延 迟一 段时 间 , 待其 他短 半衰 期(1 ns~ 10ns) 的非特异荧光完全衰变后再测量 , 极大地降低背景荧光的干扰 , 大大提高检测灵敏度 , 从而获得目标物特异性荧光信号实现定性或定量的技术。
3.2 时间分辨荧光免疫分析 time-resolved fluoroimmunoassay; TRFIA
将时间分辨荧光与免疫分析结合起来 , 以稀土离子螯合物作为示踪物标记抗体或抗原 , 与被测物进行一系列免疫反应 , 测定最终产物的荧光强度以得出被测物浓度的分析技术。
[来源 : YY/T 1304.1—2015, 3.1]
4 概述
时间分辨荧光免疫分析仪 (以下简称分析仪) 采用时间分辨荧光免疫分析技术的体外微量分析仪器。根据标记物的荧光光谱的特点 , 通过延缓测量时间 , 排除标本中非特异性荧光的干扰 , 达到准确定量分析的目 的。分析仪通常采用稀土金属铕离子 (Eu3+ )的螯合物作为示踪物 , 标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞 , 实现待测物的荧光定量检测。用于蛋白质和多肽激素、半抗原、病原体抗原抗体、肿瘤标
志物分析、干血斑样品、核酸及天然杀伤细胞的活力等方面的测定。
分析仪分全自动和半自动两种模式。 全自动分析仪由样本加注模块、试剂加注模块、微板搬运模块、振荡孵育模块、洗涤模块、检测模块和控制系统组成 , 如图 1 所示。半自动分析仪与全自动分析仪相比 , 没有样本和试剂自动处理模块 , 主要由光源、样本池、滤光系统、信号光透镜组、光电检测系统和信号处理系统组成 , 如图 2所示。
图 1 全自动分析仪原理图
图 2 半自动分析仪原理图5 计量特性
分析仪计量特性指标见表 1。
表 1 分析仪计量特性指标
6 校准条件
6.1 环境条件
6.1.1 环境温度 : (10~ 30) ℃。
6.1.2 相对湿度 : ≤70%。
6.1.3 室内应具备良好的防尘措施 , 仪器远离振动、 电磁干扰。
6.2 标准物质和计量标准器
6.2.1 荧光特性校准可选用铕离子溶液国家有证标准物质或与其浓度等效的时间分辨
荧光校准用标准板 , 相对扩展不确定度不大于 5% (k= 2)。 时间分辨荧光校准用标准
6.2.2 数字温度计 : 测量范围 (20.0~ 50.0) ℃ , 分辨力不低于 0.1 ℃ , 最大允许误差为 ±0.3 ℃。
6.2.3 电子天平 : 测量范围 (0~200) g, 最小分度值不高于 0.1 mg, 级。
6.2.4 容量瓶、移液管 : A级。
6.2.5 分析项目浓度校准可选用甲胎蛋白、雌三醇、人胰岛素等有证标准物质 , 相对
度不大于 5% (k= 2)。标准物质的选择原则参照附录 C。
与分析仪相配套的体外诊断试剂盒 (含增强液、质控品与校准品等)。
7 校准项目和校准方法
7.1 检测限
采用有证标准物质参考附录 B 方法配制系列铕工作标准溶液 , 调节分析仪工作条件 , 采用 1×10-9mol/L铕工作标准液测试 , 激发波长为 (340±2) nm , 发射波长为(613±2) nm, 使分析仪荧光信号约为 106。调节好仪器条件后 , 再采用 1×10-12mol/L铕标准液和增强液各 1份 , 或使用与其浓度等效的时间分辨荧光校准用标准板 , 分别在仪器上连续测量 10次 , 分别计算 2份样本的荧光平均值XEU、XES以及测量结果标准差sEU、sES , 设置包含因子为 2.58, 当公式 (1) 成立 , 即检测限不大于 1×10-12mol/L。
XEU -2.58sEU>XES+2.58sES (1)
式中 :
XEU — 1×10-12mol/L铕标准液 (Eu3+ ) 的荧光均值 ;
XES — 增强液的荧光均值 ;
sEU — 1×10-12mol/L铕标准液 (Eu3+ ) 的荧光强度标准偏差 ;
sES — 增强液的荧光强度标准偏差。
7.2 线性相关系数
采用有证标准物质参考附录 B 方法配制系列铕工作标准溶液 , 或使用与其浓度等效的时间分辨荧光校准用标准板 , 在低值至高值范围内 (高低值之间至少相差 5个数量级) , 选取至少 5个浓度梯度的标准溶液进行测量 , 重复测量 3 次 , 取其平均值。将各标准铕浓度对数值 (Xi) 与荧光对数值 (Yi) 进行线性回归 , 按公式 (2) 计算线性相关系数 r:
式中 :
r — 线性相关系数 ;
n — 标准物质浓度水平的个数 ;
Xi — 每个水平的铕标准物质浓度对数值 ;
X — 每个水平的铕标准物质浓度对数值的平均值 ;
Yi — 每个水平的铕标准物质荧光对数值 ;
Y — 每个水平的铕标准物质荧光对数值的平均值。
7.3 荧光重复性
采用 1×10-10mol/L的铕标准溶液 , 或使用与其浓度等效的时间分辨荧光校准用标准板 , 连续测量 10次 , 计算测得荧光值的相对标准偏差作为重复性的表征 , 如公式(3)计算。
srel,1— 荧光性能测量相对标准偏差 ;
yi — 第 i次测量结果 ;
y — 10次测量结果的平均值 ;
n — 测量次数 (n= 10)。
在每个孵育舱中布一个测温点 , 待孵育系统内温度稳定后进行测量 , 每隔 1 min记录一次 , 每个孵育舱连续记录 10次 , 各测量点温度实测值为 10次测量的平均值 , 孵育系统温度示值误差 Δtd按公式 (4) 计算 :
Δtd=t0 -td (4)
7.5 温度波动度
在孵育系统内温度稳定状态下 , 对各孵育舱连续测量 10min (每 1 min记录 1 次) ,实测最高温度和最低温度温差的一半 , 冠以 “± ”, 如公式 (5) 计算 , 取全部测量点中温度变化量最大值作为温度波动度校准结果。
式中 : Δtf=± [(tjmax-tjmin)/2] (5)
Δtf — 温度波动度 , ℃ ;
tjmax — 测量点 j 在 n 次测量中的最高值 , ℃ ;
tjmin — 测量点 j 在 n 次测量中的最低值 , ℃。
7.6 分析项目浓度示值误差
示值误差的校准采用分析仪配套检测试剂 (含校准品与质控品) 以及具有互换性的
国家有证标准物质。通常采用检测项目的校准点应包括 1个低值点和 1个高值点 , 低值点和高值点至少相差一个数量级 , 且低值点和高值点应当覆盖客户要求的校准点或校准区间 , 当客户要求时 , 也可进行单点校准。校准前应当使用分析仪配套校准品进行自校准 , 并且测定配套质控品靶值在质控区间内。
分别测量选定检测项目的校准点 , 每个校准点分别重复测量 3 次 , 计算 3 次测量结果的平均值。根据公式 (6) 计算示值误差 :
Δc — 分析项目浓度示值误差 ;
c — 3 次测量结果平均值 ;
cs — 标准物质的认定值。
测量结果的单位应与国家有证标准物质认定值的单位保持一致。
7.7 分析项目浓度重复性
采用与分析仪配套的检测试剂 (含校准品与质控品) , 以相关项目 国家有证标准物质作为测量样本 , 在分析仪上重复测量 10次 , 按照公式 (7) 计算测量结果的相对标准偏差 , 以表征分析项目浓度重复性。
srel,2— 分析项目浓度浓度重复性 ;
xi — 第 i次测量结果 ;
x — 10次测量结果的平均值 ;
8 校准结果的表达
校准记录应详尽地记载测量数据和计算结果 , 推荐的校准记录见附录 D。示值误差测量结果的不确定度按照 JJF1059.1 的要求评定 , 评定示例见附录 F、 附录 G。经校准后的光分析仪应出具校准证书 , 校准证书应符合 JJF 1071—2010 中 5.12的要求。
9 复校时间间隔
由于复校时间间隔的长短是由分析仪的使用情况、使用者、分析仪本身质量等诸因素所决定的 , 因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔 , 建议不超过1 年。
附录 A
时间分辨荧光校准用标准板
采用含有 Eu3+、Tb3+、Sm3+ 或 Dy3+ 的稀土元素溶液与增强剂 β-萘甲酰三氟丙酮、三辛基氧化膦和 Triton X-100混合后 , 再与二甲基丙烯酸乙二醇酯、 甲基丙烯酸在甲醇体系中采用引热引发剂或光引发的方法共聚得到含有稀土金属元素的薄膜 , 将薄膜裁剪贴合于 96孔黑色荧光酶标板的底部 , 形成时间分辨荧光校准用标准板 , 见图 A.1。
标准值的确定以检定合格的荧光分光光度计作为比较器 , 以国家稀土单元素溶液标准物质作为标准 , 将测得的稀土单元素溶液标准物质的荧光强度与其浓度进行拟合得到标准曲线 , 再将相同条件下测得的标准板上荧光薄膜的荧光强度值代入标准曲线得到该板等效荧 光强 度的 浓度 值 ( Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome; MESF) ,即标准值经检定合格的荧光分光光度计作为比较器 , 溯源到国家稀土单元素溶液标准物质。
图 A.1 时间分辨荧光校准用标准板示意图
附录 B
荧光性能校准用铕标准溶液的配制
B.1 试剂
B.1.1 铕溶液国家有证标准物质。
B.1.2 纯水 : 新鲜制备 , 符合 GB/T 6682一级水规格要求。
B.1.3 增强液 : 时间分辨荧光免疫分析仪的配套试剂。
B.2 设备与器材
使用的设备与器材须经计量部门检定或校准。
B.2.1 天平 : 检定分度值不低于 0.1 mg, 检定合格。
B.2.2 玻璃 量器 : 容量 瓶 (10 mL、 100 mL) , 单标 线吸 量管 (0.1 mL、 1 mL) , A 级。
B.3 空白溶液的配制
在 (20±3) ℃下 , 取 100 mL 纯水于 10 mL 容量瓶中 , 增强液定容 , 混合均匀 ,即可得到空白溶液。
B.4 铕工作标准溶液的配制
在 (20±3)℃下 , 用天平准确称取所需的铕溶 液有 证标 准物 质于 100 mL 容量 瓶中 , 纯水定容 , 混合 均匀 , 配制 成质 量浓 度为 1× 10-4 mol/L 的铕 离子 母液。 使用10 mL容量瓶 , 按表 B.1 配制系列铕离子标准溶液。
表 B.1 铕离子标准溶液配制方法
分别取以上系列铕溶液 A1~A5 100 mL 于 10 mL 容量瓶中 , 采用增强液稀释定容 ,混合均匀 , 即可得到质量浓度分别为 1× 10-8 mol/L、1× 10-9 mol/L、1× 10-10 mol/L、 1× 10-11 mol/L、1× 10-12 mol/L 的工作标准溶液 , 具体方法见表 B.2。
表 B.2 铕工作标准溶液配制方法
表 B.2 铕工作标准溶液配制方法 (续)
工作标准溶液应现配现用。可根据实际情况参考以上方法配制其他浓度梯度的工作标准溶液。
附录 C
分析项目校准用标准物质的选择原则
C.1 标准物质的选择
人胰岛素、游离雌三醇或甲胎蛋白等有证标准物质不可获得或客户要求时 , 可选择其他检验项目的有证标准物质进行校准。
C.2 校准分析项目浓度示值误差的标准物质
校准分析项目浓度示值误差的标准物质应具有互换性 * , 由于免疫分析存在基质效应 , 校准示值误差时不建议将有证标准物质稀释使用 , 否则可能影响互换性。
* 互换性指对于给定标准物质的规定量 , 由两个给定测量程序所得到测量结果之间关系 与另 一个制定物质所得测量结果之间关系一致程度表示的标准物质特性。 [JJF 1001—2011, 8.16]
C.3 校准分析项目浓度重复性的标准物质
校准分析项目浓度重复性时可采用高纯有证标准物质按照重量-容量法配制校准溶液 , 但此时应当考虑配制过程中引入的不确定度。
附录 D
时间分辨荧光免疫分析仪校准原始记录格式
(推荐性表格)
表 (续)
附录 E
时间分辨荧光免疫分析仪校准证书内页格式
附录 F
分析项目浓度示值误差不确定度评定示例
F.1 概述
采用分析仪测定国家有证标准物质 , 并与标准物质的认定值进行比较 , 以此评定校准过程中的不确定度。
F.2 测量模型
(F.1)
cs — 认定值。
F.3 合成标准不确定度计算公式灵敏度系数为 :
c (F.2)
c (F.3)
由公式 (F.3) 可知 , 仪器分析项目浓度示值误差的不确定度来源由测量结果平均值引入的不确定度分量和标准物质引入的不确定度分量组成。各输入量的不确定度之间彼此不相关 , 根据不确定度传播率可以得到公式 (F.4) 和公式 (F.5)。
F.4 测量不确定度分量
由公式 (F.5) 可知 , 时间分辨荧光免疫分析仪分析项目浓度示值误差的不确定度来源 :
a) 测量结果平均值引入的标准不确定度 ur(c) ;
b) 标准物质引入的标准不确定度 ur(cs)。
测量结果平均值引入的不确定度即由多次测量重复性引入的不确定度。标准物质引入的不确定度即为标准物质认定值引入的不确定度。
下面以一次时间分辨荧光免疫分析仪校准为例具体分析其测量不确定度。分析项目浓度采用甲胎蛋白国家有证标准物质。在校准中甲胎蛋白标准物质 3 次测定的结果分别为 24.605IU/mL、26.672IU/mL、27.212 IU/mL, 该标准物质的标准值为 (25.6±
..) U结(。值引入不确定度分量 ur(c)
选定一台时间分辨荧光免疫分析仪 , 对该甲胎蛋白标准物质连续测量 7次 , 得到一组测 量值 : 26.334 IU/mL、 25.164 IU/mL、 27.987 IU/mL、 26.119 IU/mL、 26.534IU/mL、25.911IU/mL、28.937IU/mL。
则单次测量结果实验标准偏差 :
实际校准时在重复性条件下连续测量 3 次 , 以 3 次测量的算术平均值作为结果 , 则由重复性引入的标准不确定度为 :
F.4.2 标准物质的标准不确定度 ur(cs)
由标准物质引入的不确定度分量 ur(cs) 可以根据标准物质证书提供的扩展不确定度 U(cs) 和包 含因 子 k 计算 , 甲胎 蛋白 标准 物质 的标 准值 为 (25.6± 1.2) IU/mL (k= 2) , 则由标准物质引入的标准不确定度为 :
F.5 合成标准不确定度
根据公式 (F.5) , 合成标准不确定度 :
uc F.6 扩展不确定度
取 k= 2, 则 : U(Δc)=k×uc(Δc)= 7.6%
附录 G
温度示值误差不确定度评定示例
G.1 概述
本规范采用数字温度计对全自动时间分辨荧光免疫分析仪的孵育舱的温度示值误差进行校准。
G.2 测量模型
式中 : Δtd=t0 -td (G.1)
Δtd — 孵育系统温度示值误差 , ℃ ;
t0 — 仪器设定的温度值 , ℃ ;
td — 每个孵育舱的温度实测平均值 , ℃。
G.3 测量不确定度分量
对于时间分辨荧光免疫分析仪 , 一般设定孵育温度为固定的 37 ℃ , 因而温度示值误差的不确定度来源 :
a) 测量重复性引入的不确定度分量 u1 ;
b) 数字温度计引入的不确定度分量 u2。
G.4 合成标准不确定度公式计算
由于测量重复性引入的不确定度分量 u1 与数字温度计引入的不确定度分量 u2 相互独立 , 则合成标准不确定度按照公式 (G.2) 计算 :
u (G.2)
对时间分辨荧光免疫分析仪孵育舱做 10次独立重复测试 , 从数显温度计读取 10次数据 , 记为 td1 , td2 , … , td10 , 平均值记为 td , 测量结果列于表 G.1。
表 G.1 温度重复测量结果
则重复测量结果标准偏差 :
G.4.2 由数显温度计引入的不确定度
=52从,2一=:。为 0.1 ℃的数字温度计检定的扩展不确定度 U95 =0.4 ℃ ,
温度示值误差测量结果的标准不确定见表 G.2。
表 G.2 标准不确定度一览表
G.6 合成标准不确定度
U(Δtd)=k×u(Δtd)≈0.5 ℃
